一种富含三萜的抗肿瘤组合物及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及抗肿瘤组合物领域，公开了一种富含三萜的抗肿瘤组合物，包括10～15重量份的牛樟芝子实体提取物、10～25重量份的牛樟芝菌丝体提取物和60～80重量份的灵芝子实体提取物；所述组合物中三萜化合物的重量百分含量为10～17％。两种真菌的脂溶性提取物按适当比例混合形成组合物，单位价值组合物的抗肿瘤效果大大提升，能明显降低肿瘤标志物含量，减轻了肿瘤患者的经济负担，也避免了因过多服用灵芝类药物而导致的过剩残留造成机体损伤。
【专利说明】一种富含三萜的抗肿瘤组合物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及抗肿瘤组合物领域，尤其涉及一种富含三萜类化合物的抗肿瘤组合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]当今世界，肿瘤是仅次于心血管疾病的导致人类死亡的另一大杀手，并且肿瘤的发生率呈逐年上升趋势。目前，肿瘤的诊断和治疗主要集中在手术、化疗、放疗等常规方法上，但是由于原发病灶切除手术容易造成创伤留下安全隐患，而化疗方法有较大的毒副作用，放疗对机体的损伤可引起或加重机体发生非感染性炎症反应等副作用，因此，这些常规治疗肿瘤的方法受到限制。
[0003]深入研究发现传统中草药和植物药等天然产物在肿瘤治疗方面具有显著疗效。例如，名称为“具有抗肿瘤活性的灵芝子实体提取物及其制备方法”的发明专利，公开了灵芝中含有多种抗肿瘤有效成分。但是灵芝的抗肿瘤疗效不高，患者需服用大量灵芝才能抑制肿瘤的生长，这不但会使病患在使用过程中产生较大的经济负担，并且过剩的灵芝残留体内还会对身体造成伤害。牛樟芝因其独特的生长环境,菌菇体内积累有大量的抗癌成分一三萜类化合物，相同质量的牛樟芝抗癌效果远胜于灵芝，但是牛樟芝的价格非常昂贵，是相同质量灵芝的十几甚至几十倍。
【发明内容】
[0004]有鉴于上述现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题在于提供一种成本较低的富含三萜的抗肿瘤组合物。
[0005]本发明解决上述技术问题所采用的方案是提供一种富含三萜的抗肿瘤组合物，包括10?15重量份的牛樟芝子实体提取物、10?25重量份的牛樟芝菌丝体提取物和60?80重量份的灵芝子实体提取物；所述组合物中三萜化合物的重量百分含量为10?17%。
[0006]本发明的目的还在于提供上述富含三萜的抗肿瘤组合物的制备方法，包括:
[0007]步骤A:分别制备牛樟芝子实体提取物、牛樟芝菌丝体提取物和灵芝子实体提取物；
[0008]步骤B:称取10?15重量份所述牛樟芝子实体提取物、10?25重量份所述牛樟芝菌丝体提取物和60?80重量份所述灵芝子实体提取物混合均匀。
[0009]进一步地，所述牛樟芝子实体提取物、所述牛樟芝菌丝体提取物和所述灵芝子实体提取物的制备分别包括步骤A1:将原料牛樟芝子实体或牛樟芝菌丝体或灵芝子实体置于95 %乙醇中进行回流提取或者渗漉提取，收集提取液；将所述提取液回收乙醇后于硅藻柱用乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液并回收乙酸乙酯，获得所述原料的乙醇提取物。
[0010]进一步地，所述回流提取中95%乙醇与所述原料的料液比为6?8L/kg ;所述渗漉提取中95%乙醇与所述原料的料液比为20L/kg。
[0011]进一步地，所述步骤A1还包括:将所述原料的乙醇提取物加入环糊精饱和水溶液中，超声混合制得环糊精包含物悬浮液，静置干燥粉碎后获得所述原料的水提取物。
[0012]进一步地，所述超声混合的温度为30°C，超声混合的时间为40min。
[0013]进一步地，所述静置为于0_5°C条件下冷藏放置24h ;所述干燥温度为60°C。
[0014]进一步地，所述牛樟芝子实体提取物、所述牛樟芝菌丝体提取物和所述灵芝子实体提取物的制备还包括步骤A2:将经过步骤A1提取的原料，分别用水煎煮提取，然后加95 %乙醇至醇含量为75 %，待完全沉淀后取上清液进行过滤旋蒸，将所得物进行冷冻干燥，制得各原料的水提取物。
[0015]本发明通过将牛樟芝的菌丝体、子实体和灵芝子实体分别经过醇提和水提再按适当比例混合，制得富含三萜的抗肿瘤组合物，具有显著的抗肿瘤活性。本发明抗肿瘤组合物可用于预防和治疗肿瘤，治疗效果趋近于价格昂贵的牛樟芝，提高了单位价值组合物的抗肿瘤效率，减轻了肿瘤患者的经济负担，也避免了因过多服用灵芝类药物而导致的过剩残留造成机体损伤。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是本发明实验例1不同组合物对肿瘤细胞的影响的测试结果图；
[0017]图2是本发明实验例2不同组合物对荷瘤小鼠T细胞转化及脾细胞抗体生
[0018]成能力的影响的测试结果图；
[0019]图3是本发明实验例2不同组合物对荷瘤小鼠血清中细胞免疫因子含量的
[0020]影响的测试结果图。
【具体实施方式】
[0021]为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0022]本实施实例采用的牛樟芝和灵芝组合物为牛樟芝子实体、牛樟芝菌丝体和灵芝子实体的提取物。将三种原料分别采用95%乙醇提取出三萜类化合物，浓缩后再使用β-环糊精进行包埋。然后将醇提后的药渣进行水提，浓缩、干燥后与环糊精包含的醇提取物混合。称取10?15重量份牛樟芝子实体提取物、10?25重量份牛樟芝菌丝体提取物和60?80重量份所述灵芝子实体提取物混合均匀。所得到的提取物中有效成分总三萜的重量百分含量在10-17 %，其中来自牛樟芝的总三萜的重量百分含量在8-12 %，来自于灵芝总三萜重量百分含量在2-5%。
[0023]具体制备方法如下:
[0024](1)先将一定质量的牛樟芝子实体粉碎过20目筛，置于95%乙醇(料液比为6?8L/kg)回流提取3次，每次2h ;或于95%乙醇(料液比为20L/kg)渗漉提取。将回流提取或渗漉提取的提取液回收乙醇后，上样于硅藻柱进行洗脱，所用硅藻土质量为真菌原料的1-1.5倍。然后，用乙酸乙酯洗脱(料液比为6?8L/kg)，收集洗脱液，并回收乙酸乙酯，制得原料的醇提取物。
[0025](2)取β -环糊精溶入30°C蒸馏水中，制成饱和溶液。将步骤A1中制得的提取物用少量乙醇溶解后滴入不断搅拌的加β -环糊精饱和水溶液中，于30°C超声40min使三萜类化合物被包合。所得包含物悬浮液于0_5°C冷藏放置24h，抽滤后60°C干燥，研细获得环糊精包裹的醇提取物。
[0026](3)将上述95%乙醇提取后的粉末药渣，用水(料液比为8?12L/kg)煎煮提取两次，每次提取2h，将提取液浓缩至相对密度为1.5-2.0kg/L，然后加95%乙醇至含醇量为75%左右，待完全沉淀后进行过滤和旋蒸，将所得物进行冷冻干燥，得原料的水提取物。
[0027](4)合并原料的醇提取物和水提取物，混合均匀，干燥至水分含量小于4%，即得牛樟芝子实体提取物。
[0028](5)同上，牛樟芝菌丝体和灵芝子实体分别按照以上方法制得牛樟芝菌丝体提取物和灵芝子实体提取物。
[0029]称取10?15重量份所述牛樟芝子实体提取物、10?25重量份所述牛樟芝菌丝体提取物和60?80重量份所述灵芝子实体提取物用多维混合机混合均匀，即得到樟芝和灵芝药物组合物。组合物中有效成分总三萜的重量百分含量在10-17%，其中牛樟芝总三萜的重量百分含量在8-12%,灵芝总三職重量百分含量在2-5%。
[0030]实施例1
[0031]制备步骤同上所述，仅改变组合物成分为12重量份所述牛樟芝子实体提取物、20重量份所述牛樟芝菌丝体提取物和68重量份所述灵芝子实体。
[0032]实施例2
[0033]制备步骤同上所述，仅改变组合物分成为单味的灵芝子实体提取物。
[0034]实施例3
[0035]制备步骤同上所述，仅改变组合物成分为14重量份所述牛樟芝子实体提取物和18重量份所述牛樟芝菌丝体提取物。
[0036]实验例1:组合物对肿瘤的影响
[0037]选取2周龄左右，大小均匀，体重为(20 ±2) g，状态良好的Balb/c-nu裸鼠40只，随机分为5组，每组8只。在无菌条件下取对数期肝癌0fepG2)细胞用PBS稀释成1 X 107/mL的细胞悬液，于SPF洁净室中接种在裸鼠右前肢腋窝皮下，0.lmL/只，建立荷瘤裸鼠模型。
[0038]随机分成五组，分别为:模型组、组合物组、灵芝组、牛樟芝组和环磷酰胺组。组合物组、灵芝组、牛樟芝组分别灌胃实施例1、2、3所制得药物，剂量皆为300mg/kg/day。模型组则每日灌胃等量生理盐水。环磷酰胺(CTX)组按30mg/kg/day的剂量每日腹腔注射环磷酰胺。按上述方法连续处理4周后，将所有裸鼠脱颈椎处死、剥瘤，记录瘤重并计算抑瘤率。上述五组不同提取物对肿瘤细胞的影响结果如图1所示。(注:与模型组比较:*P < 0.05，**P < 0.01 ;与组合物组比较:##P < 0.01。)
[0039]实验例2:抗肿瘤组合物对免疫系统的影响
[0040]选取清洁级Balb/c-nu裸鼠40只，2周龄左右，大小均匀，体重(20±2) g。取对数期肝癌0fepG2)细胞用PBS稀释成1 X 107个/mL的细胞悬液，于SPF洁净室中接种在裸鼠右前肢腋窝皮下，0.lmL/只，建立荷瘤裸鼠模型。随机分为5组，每组8只，分别为:模型组、组合物组、灵芝组、牛樟芝组和环磷酰胺组。此外，另设空白对照组8只，不接种肿瘤细胞。
[0041]其中，组合物组、灵芝组、牛樟芝组三组分别灌胃相应实施例1、2、3所制备的药物，剂量皆为300mg/kg/day。模型组和空白对照组则每日灌胃等量生理盐水。环磷酰胺(CTX)组按30mg/kg/day的剂量每日腹腔注射环磷酰胺。按上述方法处理持续4周，最后一天眼眶采血，分离血清；无菌取脾，制备脾细胞悬液。使用MTT法检测T细胞生成和转化能力、脾细胞抗体生成能力以及血清中细胞免疫因子(白细胞介素IL-2、IL-12、肿瘤坏死因子TNF-α )含量变化，试验结果如图2和图3所示。(注:与空白对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01 ;与模型组相比，#P < 0.05，##P < 0.01 ;与组合物组相比，aP < 0.05，aaP< 0.01。)
[0042]上述实验结果表明，相同剂量的本发明富含三萜的抗肿瘤组合物的抑瘤率虽低于牛樟芝组，但是明显高于单味的灵芝组，约为其4倍。从提高免疫细胞活力和免疫分子水平来提高荷瘤小鼠抗肿瘤免疫功能上看，本发明抗肿瘤组合提取物的抗癌趋势和牛樟芝组相近，呈剂量依赖关系。可见，组合物中三萜类化合物的抑瘤作用与其改善机体免疫功能有关。牛樟芝提取物的抗癌作用最为明显，但是由于牛樟芝资源稀缺，导致其价格极其昂贵。而单味灵芝的提取物在相同用量时的抗癌效果不明显，只有在大剂量服用时才会有较好抗癌效果。但是服用大剂量灵芝对人体有害，因此将部分灵芝用牛樟芝代替，制备提取物再按合适配比制成组合物，在保证抗肿瘤效率的同时大大降低了生产成本。
[0043]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种富含三萜的药用真菌组合物，其特征在于，包括10?15重量份的牛樟芝子实体提取物、10?25重量份的牛樟芝菌丝体提取物和60?80重量份的灵芝子实体提取物；所述组合物中三萜化合物的重量百分含量为10?17%。
2.一种富含三萜的抗肿瘤组合物的制备方法，其特征在于，包括: 步骤A:分别制备牛樟芝子实体提取物、牛樟芝菌丝体提取物和灵芝子实体提取物； 步骤B:称取10?15重量份所述牛樟芝子实体提取物、10?25重量份所述牛樟芝菌丝体提取物和60?80重量份所述灵芝子实体提取物混合均匀。
3.如权利要求2所述的抗肿瘤组合物的制备方法，其特征在于，所述牛樟芝子实体提取物、所述牛樟芝菌丝体提取物和所述灵芝子实体提取物的制备分别包括步骤Al:将原料牛樟芝子实体或牛樟芝菌丝体或灵芝子实体置于95%乙醇中进行回流提取或者渗漉提取，收集提取液；将所述提取液回收乙醇后于硅藻柱用乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液并回收乙酸乙酯，获得所述原料的乙醇提取物。
4.如权利要求3所述的抗肿瘤组合物的制备方法，其特征在于，所述回流提取中95%乙醇与所述原料的料液比为6?8L/kg ;所述渗漉提取中95%乙醇与所述原料的料液比为20L/kg。
5.如权利要求3所述的抗肿瘤组合物的制备方法，其特征在于，所述步骤Al还包括:将所述原料的乙醇提取物加入环糊精饱和水溶液中，超声混合制得环糊精包含物悬浮液，静置干燥粉碎后获得所述原料的水提取物。
6.如权利要求5所述的抗肿瘤组合物的制备方法，其特征在于，所述超声混合的温度为30°C，超声混合的时间为40min。
7.如权利要求5所述的抗肿瘤组合物的制备方法，其特征在于，所述静置为于0-5°C条件下冷藏放置24h ;所述干燥温度为60°C。
8.如权利要求3所述的抗肿瘤组合物的制备方法，其特征在于，所述牛樟芝子实体提取物、所述牛樟芝菌丝体提取物和所述灵芝子实体提取物的制备还包括步骤A2:将经过步骤Al提取的原料，分别用水煎煮提取，然后加95%乙醇至醇含量为75%，待完全沉淀后取上清液进行过滤旋蒸，将所得物进行冷冻干燥，制得各原料的水提取物。
【文档编号】A61P35/00GK104306410SQ201410515095
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】赵宗杰, 谢海涛, 张向阳, 王鹏亭, 陈波宏 申请人:深圳市仁泰生物科技有限公司