一种用于药物筛选的颈动脉分叉三维细胞培养模型及其构建方法与流程

本发明属于细胞模型制备技术领域，涉及一种用于药物筛选的颈动脉分叉三维细胞培养模型及其构建方法。

背景技术：

根据世界卫生组织统计，心血管疾病是全球的头号死因，到2030年，死于心血管疾病的人数将增加至2330万人，而其治疗花费可能将高达20万亿元。中国心血管病危险因素流行趋势明显，导致了心血管病的发病人数持续增加。今后10年心血管病患病人数仍将快速增长。目前，心血管病死亡占城乡居民总死亡原因的首位，农村为45.01％，城市为42.61％。心血管病的疾病负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题。内皮功能障碍是动脉粥样硬化、冠心病、脑血管病和血栓栓塞性疾病等心血管疾病的主要病理基础。而内皮功能障碍是动脉粥样硬化、高血压及脑梗死等心血管系统疾病的始动因素和中心环节。到目前为止，内皮功能障碍的发病机制尚未完全清楚，存在多种学说，涉及多种危险因素，以至临床缺乏有效的防治药物。因此，迫切的需要构建合适的内皮损伤模型，作为研究内皮细胞功能障碍分子机制并进行防治的重要工具。

大量研究表明，传统二维平面细胞培养皿模型不能很好地反映体内细胞的微环境，而且缺乏生理相关性，不能反映组织架构的动态性和高度复杂性，不适合用于准确预测生理器官的反应，如要研究细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用及其机制等用2d培养难以达到研究目的。很多研究已报道了3d和2d模型在药物作用和关键细胞过程如细胞分化、形态、信号通路等上的不同点，表明了体外3d模型对于基础研究的重要性。3d培养将具有三维结构的不同材料的载体与同种或不同种类的细胞在体外培养，使细胞能在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。3d培养环境模拟了细胞在体内的生存环境，可使细胞呈立体生长，有利于研究细胞-细胞间及旁分泌对细胞的作用，从而能更好地观察细胞的表型、功能，基因、蛋白质的表达，以及对药物和刺激的反应。以往体外实验研究在二维tcp上进行内皮细胞培养，细胞由于其培养环境与体内的差异，其表型和功能可能发生改变从而导致不能较好反映内皮细胞在体内的功能。

因此，如果能够利用较好模拟人体微环境的三维立体培养细胞模型，构建合适的细胞培养模型将成为探讨血管细胞功能及分子机制的重要工具。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于药物筛选的颈动脉分叉三维细胞培养模型及其构建方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开的用于药物筛选的颈动脉分叉三维细胞培养模型的构建方法，包括以下步骤：

1)制备三维中空水凝胶流道

首先根据统计得到的人体颈动脉血管形态和尺寸数据，通过计算机辅助建模软件设计得到仿生颈动脉血管结构模型，然后基于光固化3d打印技术制备具有三维中空仿生血管结构的水凝胶流道；

2)制备颈动脉分叉三维细胞培养模型

制备浓度为1×10⁵～2×10⁶cells/ml的huvec混悬液，然后将huvec混悬液灌入步骤1)制得的水凝胶流道中，旋转种植使细胞贴壁生长，再向水凝胶流道中加入培养基，于37℃、5％二氧化碳的气体培养箱中孵育1～4d，制得颈动脉分叉三维细胞培养模型。

优选地，步骤1)中，所述的基于光固化3d打印技术制备具有三维中空仿生血管结构的水凝胶流道，参考中国专利cn107361880a公开的方法。

优选地，步骤2)中，制备浓度为1×10⁵～2×10⁶cells/ml的huvec混悬液，具体操作如下：

取内皮细胞或平滑肌细胞，以低糖dmem作为培养基进行细胞常规培养，先用胰酶消化处理，再经低速离心处理，然后加入含有8％～12％胎牛血清的培养基，获得浓度为1×10⁵～2×10⁶cells/ml的huvec混悬液。

进一步优选地，所述低速离心处理是在800～1000rpm离心处理5～10min。

本发明还公开了采用上述的制备方法制得的用于药物筛选的颈动脉分叉三维细胞培养模型。

优选地，所述颈动脉分叉三维细胞培养模型能够模拟人体不同病理环境下的刺激因子。

优选地，所述刺激因子包括炎症刺激因子、高糖刺激因子和高尿酸刺激因子。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明用细胞为人源，弥补了动物模型不同种属的缺陷，同时较传统二维平面环境更接近细胞在人体所处真实微环境。这种方法能体现传统2d细胞培养的条件可控制性及直观性，可以将2d细胞培养体系与组织器官研究联系起来，从而有效模拟不同病理刺激对体内细胞功能的影响，对细胞功能的评价更加准确；本方法相比已有的三维类血管结构培养，给予模拟人体不同病理环境下的刺激因子，进而对细胞在疾病状态下形态、功能的改变进行研究。

附图说明

图1为本发明的仿生颈动脉血管的基本构建流程图；

图2为本发明中培养在三维培养模型中内皮细胞在不同浓度tnf-α刺激下，细胞的形态改变及ldh释放水平；(a)为光镜下拍照观察内皮细胞的形态改变；(b)为细胞的形状指数统计分析结果；(c)为不同浓度tnf-α刺激下内皮细胞ldh释放水平的改变；

图3为分别培养在二维传统平面培养皿及三维培养模型中的内皮细胞akt、erk及enos磷酸化水平的改变；其中，(a)为内皮细胞akt、erk及enos蛋白电泳结果；(b)为akt磷酸化水平统计结果；(c)为erk磷酸化水平统计结果；(d)为enos磷酸化水平结果；

图4为分别培养在二维传统平面培养皿及三维培养模型中的内皮细胞在不同浓度tnf-α刺激下，细胞上清液中氧化应激和炎症水平的改变；其中，(a)为mda释放水平；(b)为sod活性；(c)il-1β释放水平；(d)il-6释放水平；

图5为分别培养在二维传统平面培养皿及三维培养模型中的内皮细胞在不同浓度tnf-α刺激下，细胞上清液中内皮舒缩因子的改变；其中，(a)为no释放水平；(b)为pgi2含量；(c)et-1释放水平。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明公开的用于药物筛选的颈动脉分叉三维细胞培养模型的构建方法，包括以下步骤：

1)水凝胶流道制作：基于3d打印技术，制备具有三维中空仿生血管结构的水凝胶流道。

2)细胞制备-模型制作：采用内皮、平滑肌细胞等进行培养，用含有dmem(lowglucose)进行细胞常规培养，胰酶消化后经800-1000rpm低速离心5-10min，加入适量含8-12％胎牛血清的培养基获得浓度为1×105～2×10⁶cells/ml的huvec混悬液。将细胞悬液灌入步骤1)制得的三维中空水凝胶流道中，旋转种植使细胞贴壁生长。将培养基加入流道内，使培养基可以和细胞充分接触，在37℃、5％二氧化碳的气体培养箱中孵育。

3)模型培养：模型孵育1-4d后，待细胞在结构内表面分布均匀，密度合适，换用无fbs培养基，饥饿8～12小时后，加入梯度浓度的tnf-α、lps等炎症因子或高糖、高尿酸等刺激，对照组加入同等体积的无fbs培养基，处理24～72小时。模拟不同疾病情况下，患者大血管的细胞的真实情况。

4)确定刺激最佳浓度：不同浓度的各种刺激培养时，每隔2-4h与显微镜下拍照并观察。同时取培养液离心(400g、离心5min)后检测细胞内总乳酸脱氢酶释放，细胞内总乳酸脱氢酶释放；

细胞内总乳酸脱氢酶释放：设置背景组、对照组和药物处理组；模型组处理24～72小时后，去除培养基，1*pbs清洗，每孔加入ldh细胞毒性检测试剂盒里的ldh释放剂，倾斜放在孵箱中孵育0.5～1.5小时，使得其与模型充分接触；取上清500μl于400g离心5分钟；配制ldh检测工作液，避光；取离心后上清，每孔120μl加入96孔板中，在相对应的每个孔中加入60μl工作液；混匀，室温，避光摇床上缓慢摇动，孵育30分钟；490nm处测定吸光度，读值应减去背景值。

5)细胞氧化应激水平检测：利用elisa或试剂盒等方式，检测培养液中内皮细胞、平滑肌细胞等血管壁细胞的mda释放水平或sod活性等，以反映细胞的氧化应激损伤程度。

6)细胞炎性水平检测：利用elisa或试剂盒等方式，检测培养液中内皮细胞、平滑肌细胞等血管壁细胞的il-1β、il-6等因子的释放，以反映细胞的炎症水平。

7)细胞相关分泌功能检测：利用elisa或试剂盒等方式，检测培养液中内皮细胞、平滑肌细胞等血管壁细胞的no、et-1、pgi2等分泌因子的表达。

8)细胞样本的提取：利用胰酶消化下贴壁生长的细胞(37°，3min)，细胞混悬液离心(1000r/min，3min)，然后应用预冷的1*pbs清洗后离心，重复3次，将细胞样本保存在无菌无酶ep管中-80冻存。

9)mrna提取：每孔1mltrizol，加入六孔板，将六孔板倾斜静置，10分钟，加入无酶ep管中。三氯甲烷200μl/ml，摇匀，静置5分钟。12000g，离心，15分钟，取水相中rna，另取一组无酶ep管，将水相加入，并取等体积异丙醇，摇匀，-20℃过夜。4℃，12000g，离心20分钟，去除异丙醇，加入75％乙醇，8000g，离心15分钟，去上清，7500g，离心1分钟，待酒精晾干后，加入depc水，重悬浮。

10)定量pcr：上述提取得到mrna逆转录为cdna，根据faststartessentialdnagreenmaster说明书，配制体系；61℃退火；最后根据ct值，并利用公式2-△△ct相对定量计算出炎症因子或细胞功能相关基因的表达情况。

11)蛋白提取：将处理后的细胞，弃去细胞培养基，用预冷的pbs轻轻清洗3遍；加入预冷的ripa裂解液(按1:50比例加入蛋白酶抑制剂cocktail)，轻轻反复吹打细胞，确保ripa裂解液能够均匀覆盖细胞；冰上裂解20min，使细胞充分裂解；收集细胞裂解液，4℃，12000rpm离心15min；将细胞裂解液上清移至另一新的eppendorf管中，取适量用于测定蛋白浓度(蛋白定量bca试剂盒)，其余分装后-80℃保存。蛋白变性，将5×上样缓冲液按4:1的比例加入到蛋白样品中，混匀，沸水中煮5min使之变性。

12)westernblotting：配制10％～12％的分离胶及5％的浓缩胶，向电泳槽内加入足量的1×电泳缓冲液，每孔用微量加样器吸取等量蛋白样品缓慢加入蛋白泳道内，90-110v恒压条件下进行电泳，待溴酚蓝下移至分离胶底部停止电泳。三明治湿转，按照负极-滤纸-凝胶pvdf膜-滤纸-正极的顺序依次铺好放入转膜用的夹子，于冰浴中200ma恒流下低温湿转；pvdf膜放入5％的脱脂牛奶封闭液中，于摇床上室温封闭2-4h；分别用对应的一抗进行孵育，4℃孵育过夜，然后放入1×tbst中洗膜3次，每次10min；用1×tbst稀释hrp标记的抗兔或抗鼠igg抗体室温孵育2h；然后将pvdf膜放入1×tbst中洗膜3次，每次10min；将ecl发光液a、b按1：1配制，pvdf膜置于曝光仪器内，均匀加上发光液(约200μl)进行曝光；采用lane1d生物分析软件对条带的灰度值进行分析，将同一样本的目标蛋白和内参蛋白的的灰度值进行比较相比得到相对灰度值。

实施例1

1、采用huvec(crl-1730tm)细胞进行培养，用含有dmem(lowglucose)进行细胞常规培养，胰酶消化后经800-1000rpm低速离心5-10min，加入适量含8-12％胎牛血清的培养基获得浓度为1×10⁵～2×10⁶cells/ml的huvec混悬液。

2、将细胞悬液灌入制备的水凝胶仿生血管中，在水凝胶仿生血管结构内表面形成细胞层，形成仿生血管。将培养基加入流道内，使培养基可以和huvec充分接触，在37℃、5％二氧化碳、95％空气的气体培养箱中孵育，如图1所示。

3、参见图2，待细胞贴壁生长并完整分布在内表面，如图2中(a)cont组所示，内皮细胞均匀分布生长，细胞呈卵圆形，生长状态良好。待细胞生长至合适密度，在流道内加入胰酶消化2-3分钟，吸取细胞混悬液，800-1000rpm低速离心5-10min，用预冷的1*pbs洗3次后，加入ripa裂解液，提取细胞蛋白并进行westernblot检测，对比二维/三维下内皮细胞的蛋白表达改变。

结果如图3所示，可知相比二维平面培养皿，三维细胞培养模型中的内皮细胞akt、enos磷酸化水平显著提高，而erk磷酸化水平降低，表明相比传统二维平面培养皿，内皮细胞在三维仿生培养模型中表型和基因表达发生改变，增殖表型减弱，而内皮功能相关基因表达增加。

实施例2

1、应用1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100ng/ml的tnf-α培养液加入模型中，刺激24h后，光镜下进行形态学观察。

结果如图2中(a)所示，正常对照组中，内皮细胞均匀分布生长，细胞呈卵圆形，生长状态良好；内皮细胞形态在6.25ng/mltnf-α刺激下开始发生显著改变，细胞由卵圆形转变为瘦长，形状指数显著降低并呈剂量依赖性改变；在50ng/mltnf-α刺激下部分细胞开始出现破碎崩解，tnf-α剂量为100ng/ml时细胞大量死亡，仅残留细胞碎片；

2、应用试剂盒检测内皮细胞分泌的ldh以反映内皮细胞膜损伤程度。

从图2中(c)可知，在二维平面培养皿中，tnf-α浓度为12.5ng/ml开始，内皮细胞细胞膜开始出现损伤，ldh释放水平出现统计学差异并呈剂量依赖性升高，而三维细胞培养模型中的内皮细胞在tnf-α浓度为6.25ng/ml时即升高(p<0.01)，提示三维培养环境可以提高内皮细胞对tnf-α刺激的敏感性；且12.5-100ng/ml浓度的tnf-α刺激时，与对应的正常对照组相比，三维培养模型中的内皮细胞释放ldh倍数高于二维培养环境，提示tnf-α刺激对内皮细胞膜损伤程度同样增加。

3、细胞氧化应激水平检测：内皮细胞损伤过程中往往伴随着氧化应激水平的改变，因此我们利用elisa或试剂盒等方式，分别检测三维内皮细胞培养模型中和二维平面培养皿中内皮细胞上清液里mda释放含量和sod活性水平。

结果由图4中(a)、(b)可知，三维培养模型中的内皮细胞氧化损伤程度相比二维平面培养皿中更为严重，且出现统计学差异的最小刺激剂量同样为6.25ng/ml，表明三维培养模型中刺激条件下内皮细胞氧化应激升高且敏感性增加。

4、细胞炎症水平检测：利用特异性elisa试剂盒，检测培养液中内皮细胞分泌il-1β和il-6炎症因子的水平。

结果如图4中(c)、(d)所示，表明内皮损伤时，三维培养模型中细胞分泌炎症因子水平的灵敏度和程度均高于传统二维平面培养皿。

5、细胞相关分泌功能检测：利用elisa或试剂盒等方式，检测不同培养模型中内皮细胞分泌调控血管舒缩相关因子如no、et-1、pgi2等分泌因子的表达。

结果参见图5，从图中可以看出，三维培养模型中，tnf-α刺激可导致内皮细胞释放的血管舒张因子no和pgi2分泌均剂量依赖性的降低，血管收缩因子et-1的分泌则呈剂量依赖性的升高。

上述结果表明，内皮细胞在颈动脉分叉三维细胞培养模型中可以对tnf-α刺激产生响应，细胞膜损伤、氧化应激及炎症水平均呈剂量依赖性改变；相比传统二维平面培养皿，内皮细胞在三维模型中对刺激的敏感性增加，同等剂量的刺激损伤内皮细胞的程度也更为严重。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。