本发明涉及花青素加工
技术领域：
，特别涉及一种桉树叶花青素制备方法。【
背景技术：
】桉树(eucalyptus)是一类活性丰富的速生类植物，其根、茎、叶均具有药用价值，桉树叶中含有大量活性成分，其主要成分1,8-桉叶油素具有良好的脂溶性，易于穿透生物膜结构，与其他药物合用具有促进透皮的作用。桉叶中的其它成分，如萜类、黄酮类、鞣质、间苯三酚类和糖苷类等也具有丰富的生物活性，这些成分已被广泛应用于杀菌剂作用中，然而，桉树叶中还含有少量花青素，由于其含量很低，提取难度相当大。如果能找出一种桉树花青素的提取方法将会大大增强桉树的产品附加值，延长其加工链。技术实现要素：鉴于上述内容，有必要提供一种提高桉树叶的花青素产量和提取率的制备方法。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种桉树叶花青素制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)桉树叶预处理：将桉树叶与预处理液按照质量比为1:1-3进行混合，然后放入温度为40℃-50℃的水浴中加热24h-26h，过滤后取滤液得到桉树叶溶出物；将桉树叶进行熏蒸40min-50min，然后与生物酶溶液混合，在36℃-38℃的恒温箱中恒温处理12h-14h；然后在转速为1000r/min-1500r/min的离心机中离心处理5min-15min，取上清液完成桉树叶预处理；(2)蓝光处理：将步骤(1)预处理好的桉树叶清液放入蓝光灯箱中进行蓝光照射，照射时长为48h-50h；照射的蓝光光照强度为1000lx-1500lx；(3)花青素提取：将步骤(2)蓝光照射后的桉树叶清液与有机溶剂按照质量比为1:3-5进行混合，然后放入超声提取器中进行超声提取；提取12h-14h后旋转蒸发浓缩、烘干得到花青素粗粉；(4)花青素净提：将步骤(3)的花青素粗粉与蒸馏水按照质量比为1:10-15混合得到花青素溶液，然后用大孔树脂柱进行吸附；吸附时，花青素溶液上柱流速为0.5-1倍柱体积/小时，上柱温度为30-40℃，吸附完成后用体积百分数为75％的乙醇溶液进行洗脱，然后进行真空浓缩、冷冻干燥得到所述桉树叶花青素；所述洗脱时乙醇溶液的上柱流速为1-1.5倍柱体积/小时。进一步的，所述步骤(1)的预处理液由酒石酸溶液、柠檬酸溶液和苹果酸溶液按照质量比为1:1-3:2-4组成；酒石酸溶液中酒石酸的质量浓度为3-7mg/l；柠檬酸溶液中柠檬酸的质量浓度为10-15mg/l；苹果酸溶液中苹果酸的质量浓度为5-15mg/l。进一步的，所述步骤(1)熏蒸的温度为105℃-110℃。进一步的，所述步骤(1)生物酶由蛋白酶、鞣酸酶和脂肪酶按照质量比为1:3-5:4-6混合制得；所述蛋白酶的酶活力为800u/g-1000u/g，鞣酸酶的酶活力为800u/g-1000u/g，脂肪酶的酶活力为1000u/g-1200u/g。进一步的，所述步骤(3)有机溶剂由乙醇、甲醇和正丁醇按照质量比为5-8：2-4:1组成；所述乙醇的体积百分数为95％；所述甲醇的体积百分数为25％；所述正丁醇的体积百分数为15％。进一步的，所述步骤(3)超声提取的提取功率为500w-1000w。本发明具有如下有益效果：本申请的桉树叶花青素提取包括桉树叶预处理、蓝光处理、花青素提取和花青素净提四个步骤，在预处理过程中，预处理液由酒石酸溶液、柠檬酸溶液和苹果酸溶液等有机酸组成，这些有机酸成分呈酸性，能很好的腐蚀桉树叶，加热后与叶片中的活性物质进行反应，过滤后能有效去除桉树叶脉(成分主要为木质素)；酸处理加热后，滤液中会含有较高成分的单宁和精油物质；经过熏蒸后将能有效去除单宁和精油，此时的反应液中仍含有较丰富的胶质、纤维素等大分子物质，特别是胶质，其能形成包膜从而影响花青素的析出；申请人发现此时添加生物酶将能促进大分子物质的分解，针对桉树叶的细胞进行破壁，加快内溶物的析出，从而提高花青素产量；在申请人研究过程中发现，如果此时对提取液进行蓝光处理将能进一步富集花青素，具体原因目前还在做进一步研究，初步断定是因为蓝光促使了某些酶促反应促进花青素中间体的合成；蓝光照射后，通过有机溶剂提取和大孔树脂吸附，能有效促使花青素的析出和纯化，使用本申请的方法生产桉树叶花青素能有效提高提取物中花青素的含量和得率，同时还能有效降低提取物中单宁含量。【具体实施方式】本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。实施例1：本实施例提供了一种桉树叶花青素制备方法，该方法包括如下步骤：(1)桉树叶预处理：将桉树叶与预处理液按照质量比为1:1进行混合(预处理液由质量浓度为3mg/l的酒石酸溶液、质量浓度为10mg/l的柠檬酸溶液和质量浓度为5mg/l的苹果酸溶液按照质量比为1:1:2混合制得)，然后放入温度为40℃的水浴中加热24h，过滤后取滤液得到桉树叶溶出物；将桉树叶在温度为105℃的条件下熏蒸40min，然后与生物酶溶液混合(生物酶由酶活力为800u/g的蛋白酶溶液、酶活力为800u/g的鞣酸酶溶液和酶活力为1000u/g的脂肪酶溶液按照质量比为1:3:4混合制得)，在36℃的恒温箱中恒温处理12h；然后在转速为1000r/min的离心机中离心处理5min，取上清液完成桉树叶预处理；(2)蓝光处理：将步骤(1)预处理好的桉树叶清液放入蓝光灯箱中进行蓝光照射，照射时长为48h；照射的蓝光光照强度为1000lx；(3)花青素提取：将步骤(2)蓝光照射后的桉树叶清液与有机溶剂按照质量比为1:3进行混合(有机溶剂由体积百分数为95％的乙醇、体积百分数为25％的甲醇和体积百分数为15％的正丁醇按照质量比为5：2:1混合制得)；然后放入超声提取器中进行超声提取,超声提取的功率为500w；提取12h后旋转蒸发浓缩、烘干得到花青素粗粉；(4)花青素净提：将步骤(3)的花青素粗粉与蒸馏水按照质量比为1:10混合得到花青素溶液，然后用大孔树脂柱进行吸附；吸附时，花青素溶液上柱流速为0.5倍柱体积/小时，上柱温度为30℃，吸附完成后用体积百分数为75％的乙醇溶液进行洗脱，然后进行真空浓缩、冷冻干燥得到所述桉树叶花青素；所述洗脱时乙醇溶液的上柱流速为1倍柱体积/小时。实施例2：本实施例提供了一种桉树叶花青素制备方法，该方法包括如下步骤：(1)桉树叶预处理：将桉树叶与预处理液按照质量比为1:3进行混合(预处理液由质量浓度为7mg/l的酒石酸溶液、质量浓度为10-15mg/l的柠檬酸溶液和质量浓度为15mg/l的苹果酸溶液按照质量比为1:3:4混合制得)，然后放入温度为50℃的水浴中加热26h，过滤后取滤液得到桉树叶溶出物；将桉树叶在温度为110℃的条件下熏蒸50min，然后与生物酶溶液混合(生物酶由酶活力为1000u/g的蛋白酶溶液、酶活力为1000u/g的鞣酸酶溶液和酶活力为1200u/g的脂肪酶溶液按照质量比为1:5:6混合制得)，在38℃的恒温箱中恒温处理14h；然后在转速为1500r/min的离心机中离心处理15min，取上清液完成桉树叶预处理；(2)蓝光处理：将步骤(1)预处理好的桉树叶清液放入蓝光灯箱中进行蓝光照射，照射时长为50h；照射的蓝光光照强度为1500lx；(3)花青素提取：将步骤(2)蓝光照射后的桉树叶清液与有机溶剂按照质量比为1:5进行混合(有机溶剂由体积百分数为95％的乙醇、体积百分数为25％的甲醇和体积百分数为15％的正丁醇按照质量比为8：4:1混合制得)；然后放入超声提取器中进行超声提取,超声提取的功率为1000w；提取14h后旋转蒸发浓缩、烘干得到花青素粗粉；(4)花青素净提：将步骤(3)的花青素粗粉与蒸馏水按照质量比为1:15混合得到花青素溶液，然后用大孔树脂柱进行吸附；吸附时，花青素溶液上柱流速为1倍柱体积/小时，上柱温度为40℃，吸附完成后用体积百分数为75％的乙醇溶液进行洗脱，然后进行真空浓缩、冷冻干燥得到所述桉树叶花青素；所述洗脱时乙醇溶液的上柱流速为1.5倍柱体积/小时。实施例3：本实施例提供了一种桉树叶花青素制备方法，该方法包括如下步骤：(1)桉树叶预处理：将桉树叶与预处理液按照质量比为1:2进行混合(预处理液由质量浓度为5mg/l的酒石酸溶液、质量浓度为12mg/l的柠檬酸溶液和质量浓度为7mg/l的苹果酸溶液按照质量比为1:2:3混合制得)，然后放入温度为45℃的水浴中加热25h，过滤后取滤液得到桉树叶溶出物；将桉树叶在温度为108℃的条件下熏蒸45min，然后与生物酶溶液混合(生物酶由酶活力为900u/g的蛋白酶溶液、酶活力为900u/g的鞣酸酶溶液和酶活力为1100u/g的脂肪酶溶液按照质量比为1:2:5混合制得)，在37℃的恒温箱中恒温处理12h-14h；然后在转速为1200r/min的离心机中离心处理8min，取上清液完成桉树叶预处理；(2)蓝光处理：将步骤(1)预处理好的桉树叶清液放入蓝光灯箱中进行蓝光照射，照射时长为49h；照射的蓝光光照强度为1300lx；(3)花青素提取：将步骤(2)蓝光照射后的桉树叶清液与有机溶剂按照质量比为1:4进行混合(有机溶剂由体积百分数为95％的乙醇、体积百分数为25％的甲醇和体积百分数为15％的正丁醇按照质量比为6：3:1混合制得)；然后放入超声提取器中进行超声提取,超声提取的功率为700w；提取13h后旋转蒸发浓缩、烘干得到花青素粗粉；(4)花青素净提：将步骤(3)的花青素粗粉与蒸馏水按照质量比为1:12混合得到花青素溶液，然后用大孔树脂柱进行吸附；吸附时，花青素溶液上柱流速为0.8倍柱体积/小时，上柱温度为35℃，吸附完成后用体积百分数为75％的乙醇溶液进行洗脱，然后进行真空浓缩、冷冻干燥得到所述桉树叶花青素；所述洗脱时乙醇溶液的上柱流速为1.3倍柱体积/小时。对照组1：本对照组不用预处理液对桉树叶进行处理，其它制备方法与实施例1完全相同。对照组2：本对照组不对桉树叶进行熏蒸处理，其它制备方法与实施例1完全相同。对照组3：本对照组不使用生物酶对桉树叶进行处理，其它制备方法与实施例1完全相同。对照组4：本对照组不使用蓝光进行处理，其它制备方法与实施例1完全相同。对照组5：本对照组有机溶剂仅使用乙醇，即，在步骤(3)花青素提取中：将步骤(2)蓝光照射后的桉树叶清液与体积百分数为95％的乙醇溶液按照质量比为1:3进行混合，其它制备方法与实施例1完全相同。得率及纯度测试：统计并检测实施例1-3和对照组1-5提取物中花青素、单宁含量，并计算花青素得率，得率由如下公式计算而得，具体情况见表1：表1由上表可知，实施例1-3的花青素含量、得率都明显高于对照组1-5，说明本申请的预处理液处理、熏蒸处理、生物酶处理、蓝光照射处理以及有机溶剂配方均能很好的提高本申请的桉树叶花青素含量，且缺一不可；实施例1-3的单宁含量明显低于对照组1-3，与对照组4-5相差不大，说明本申请的预处理液处理、熏蒸处理、生物酶处理能有效降低提取物中的单宁含量，且缺一不可。预处理液组分对单宁含量的影响测试：按照如下处理组对桉树叶进行预处理，测试预处理前后桉树叶单宁含量，处理组如下：处理1：按照本申请实施例1的方法对桉树叶进行预处理；处理2：预处理液中不含酒石酸溶液，其他处理方式与实施例1完全相同，即预处理液由质量浓度为10mg/l的柠檬酸溶液和质量浓度为5mg/l的苹果酸溶液按照质量比为1:2混合制得。处理3：预处理液中不含柠檬酸溶液，其他处理方式与实施例1完全相同，即预处理液由质量浓度为3mg/l的酒石酸溶液和质量浓度为5mg/l的苹果酸溶液按照质量比为1:2混合制得。处理4：预处理液中不含酒石酸溶液，其他处理方式与实施例1完全相同，即预处理液由质量浓度为3mg/l的酒石酸溶液和质量浓度为10mg/l的柠檬酸溶液按照质量比为1:1混合制得。测试结果见表2：表2单宁含量(mg/g)处理1处理2处理3处理4处理前24.3525.1324.0825.19处理后4.0312.3113.2615.33由上表可知，处理1处理单宁的能力最强，处理2-4处理单宁的能力不如处理1，由此说明，本申请预处理液组分中有机酸的含量、组分能很好的降低单宁含量，且成分缺一不可。生物酶液组分对单宁含量的影响测试：按照如下处理组对桉树叶进行预处理，测试预处理前后桉树叶单宁含量，处理组如下：处理a：按照本申请实施例1的方法对桉树叶进行预处理；处理b：预处理液中不含蛋白酶溶液，其他处理方式与实施例1完全相同，即生物酶液由酶活力为800u/g的鞣酸酶溶液和酶活力为1000u/g的脂肪酶溶液按照质量比为3:4混合制得。处理c：预处理液中不含鞣酸酶溶液，其他处理方式与实施例1完全相同，即生物酶液由生物酶由酶活力为800u/g的蛋白酶溶液和酶活力为1000u/g的脂肪酶溶液按照质量比为1:4混合制得。处理d：预处理液中不含脂肪酶溶液，其他处理方式与实施例1完全相同，即生物酶液由生物酶由酶活力为800u/g的蛋白酶溶液和酶活力为800u/g的鞣酸酶溶液按照质量比为1:3混合制得。测试结果见表3：表3单宁含量(mg/g)处理a处理b处理c处理d处理前24.3525.1324.0825.19处理后4.038.659.068.33由上表可知，处理a处理单宁的能力最强，处理b-d处理单宁的能力不如处理a，由此说明，本申请生物酶液组分中生物酶的含量、组分能很好的降低单宁含量，且成分缺一不可。综上所述，使用本发明的方法生产桉树叶花青素能有效提高提取物中花青素的含量和得率，同时还能有效降低提取物中单宁含量。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12