一种人TGFBI基因突变检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于基因检测领域，具体涉及到一种人tgfbi基因突变检测试剂盒及其检测方法。

背景技术：

角膜异常症(cornealdystrophies，cd)，也称作角膜营养不良，是对称性、非炎症性角膜疾病的总称。其发病率约为1/2000,男女发病之比为1.7:1.0。大多数患者为散发性，约占6％-10％患者有明确的阳性家族史，其遗传方式包括隐性和显性形式。其发病是由于正常角膜组织中的细胞在基因异常的作用下，使其结构或功能受到进行性损害，导致角膜组织中形成形态各异的沉淀物，因而逐渐降低视力，以及引发糜烂、畏光等并发症；晚期患者的角膜将布满沉积物，丧失视功能，不仅影响患者生活质量、美观，也给社会带来沉重负担。

近年来，随着分子遗传学的进展，许多学者从分子水平上探索其发病机制并分析其遗传特点。目前报道与角膜营养不良相关的基因包括：tgfbi、gsn、k12、m1s1、chst6、col8a2、slc4a11等，其中tgfbi基因使第一个发现也是目前报道最为常见的相关基因。

tgfbi也被称为keratoepithelin(角膜上皮蛋白，ke蛋白)，在最初的命名为bigh3(beta-inducedgene-h3)。tgfbi蛋白是细胞外基质的重要组成，在角膜、皮肤和其它结缔组织基质中均有表达。tgfbi蛋白分子量68kda，由683个氨基酸组成。一些氨基酸的变异会导致蛋白三维结构和功能的改变，部分氨基酸的变异更会导致其不能被清理和降解。

korvatska等认为氨基酸变化导致tgfbi带电变化是影响其水解的主要原因，也因此导致了角膜中tgfbi的累积；choi等发现突变的tgfbi会诱导成纤维细胞的凋亡进程，使其缺乏正常的清理功能，因而导致沉积物的不断累积。tgfbi是角膜上皮细胞分泌的重要因子之一，它参与细胞间的黏附和爬行，从而调控和维持角膜上皮细胞的正常增生和分化等形态学发生过程。突变会导致细胞黏附和爬行功能的异常，进而影响细胞的增生和分化，在变性产物的累积下，会导致反复地上皮糜烂。tgfbi在多种组织上均有表达，但研究中并未发现tgfbi在其它组织(如肝、肺、肾等)中的沉积。这可能是由于角膜组织的特殊性导致。角膜为无血管、组织结构排列规则有序的、具有透明性的屈光介质，具有良好的自我修复特性。而该组织的修复正是通过分泌tgfbi蛋白来实现细胞的黏附和爬行。因此，外伤、紫外线等损伤刺激会诱使组织分泌tgfbi蛋白。正常人群会在这种修复机制下迅速痊愈，而角膜异常症患者则反而会产生大量不可降解的蛋白从而诱发和加重角膜异常症的症状。tgfbi基因位于5号染色体(5q31)，主要的致病突变分别为4号外显子和12号外显子上编码第124号氨基酸与第555号氨基酸密码子突变。

虽然该病在发病后无法根治，只能在晚期进行针对性手术以该善视力。但对于角膜异常症突变基因携带者，在早期进行有效地、针对性地防护，将可以延缓病程的发展甚至避免发病。

技术实现要素：

为了解决对于角膜异常症突变基因携带者，在早期进行有效地、针对性地防护，将可以延缓病程的发展甚至避免发病的技术问题，本发明提供了检测人tgfbi基因124位点和555位点突变引起角膜营养不良的引物、探针。该引物、探针能够检测tgfbi基因124位点和555位点突变，灵敏度高，特异性强。

本发明还提供了一种角膜异常症突变基因检测试剂盒，该试剂盒能够快速、高效、准确检测人tgfbi基因124位点和555位点突变。

本发明还提供了使用上述试剂盒检测人tgfbi基因124位点和555位点突变的检测方法，该方法检测方法操作简便，灵敏度高，特异性高，适用机型广，检测结果真实可靠且易于推广等优点。

本发明包括如下内容：

一种人tgfbi基因突变检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括引物组和探针；

所述引物组为选自以下两组中的至少一组：

针对tgfbi基因124位点的引物seqidno.1和seqidno.2；

针对tgfbi基因555位点的引物seqidno.5和seqidno.6；

所述探针为选自以下针对引物相应位点的突变型探针和野生型探针的至少一组：

针对tgfbi基因124位点370c>t(r124c)检测的探针seqidno.3和seqidno.4；

针对tgfbi基因124位点371g>t(r124l)检测的探针seqidno.4和seqidno.5；

针对tgfbi基因124位点371g>a(r124h)检测的探针seqidno.4和seqidno.6；

针对tgfbi基因555位点1663c>t(r555w)检测的探针seqidno.9和seqidno.10，针对tgfbi基因555位点1664g>a(r555q)检测的探针seqidno.10和seqidno.11。

优选地，所述的人tgfbi基因突变检测试剂盒的探针seqidno.3、seqidno.6、seqidno.9的5’端标记有荧光基团fam，3’端标记有淬灭基团bhq1；

所述的探针seqidno.4、seqidno.10的5’端标记有荧光基团hex，3’端标记有淬灭基团bhq1；

所述的探针seqidno.5、seqidno.11的5’端标记有荧光基团tamra，3’端标记有淬灭基团bhq1。

优选地，所述的人tgfbi基因突变检测试剂盒还包括针对内参基因gusb检测的引物seqidno.12、seqidno.13，以及针对内参基因gusb检测的探针seqidno.14。

优选地，所述的人tgfbi基因突变检测试剂盒探针seqidno.14的5’端标记有荧光基团cy5，3’端标记有淬灭基团bhq1。

优选地，所述的人tgfbi基因突变检测试剂盒包括引物组和探针；

所述引物组为：

针对tgfbi基因124位点的引物seqidno.1和seqidno.2；

针对tgfbi基因555位点的引物seqidno.5和seqidno.6；

所述探针为选自以下针对引物相应位点的突变型探针和野生型探针：

针对tgfbi基因124位点370c>t(r124c)检测的探针seqidno.3和seqidno.4；

针对tgfbi基因124位点371g>t(r124l)检测的探针seqidno.4和seqidno.5；

针对tgfbi基因124位点371g>a(r124h)检测的探针seqidno.4和seqidno.6；

针对tgfbi基因555位点1663c>t(r555w)检测的探针seqidno.9和seqidno.10，针对tgfbi基因555位点1664g>a(r555q)检测的探针seqidno.10和seqidno.11。

优选地，所述的人tgfbi基因突变检测试剂盒探针seqidno.3、seqidno.6、seqidno.9的5’端标记有荧光基团fam，3’端标记有淬灭基团bhq1；

所述的探针seqidno.4、seqidno.10的5’端标记有荧光基团hex，3’端标记有淬灭基团bhq1；

所述的探针seqidno.5、seqidno.11的5’端标记有荧光基团tamra，3’端标记有淬灭基团bhq1。

优选地，所述的人tgfbi基因突变检测试剂盒还包括pcr预混液；

所述的pcr预混液包括udg酶、dna聚合酶、pcrbuffer、mgcl2、dntps和dutp。

优选地，所述的人tgfbi基因突变检测试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为8种重组质粒的混合液，所述7种重组质粒为含有tgfbi370t、tgfbi371t、tgfbi371a、tgfbi1663t、tgfbi1664g、tgfbi124wt、tgfbi555wt，另一组为gusb序列的重组质粒；

所述阴性对照品为灭菌超纯水。

一种tgfbi基因突变检测方法，包括如下步骤：

(1)设计得到引物和探针，所述的引物组为选自以下两组中的至少一组：针对tgfbi基因124位点的引物seqidno.1和seqidno.2；

针对tgfbi基因555位点的引物seqidno.5和seqidno.6；

所述探针为选自以下针对引物相应位点的突变型探针和野生型探针：

针对tgfbi基因124位点370c>t(r124c)检测的探针seqidno.3和seqidno.4；

针对tgfbi基因124位点371g>t(r124l)检测的探针seqidno.4和seqidno.5；

针对tgfbi基因124位点371g>a(r124h)检测的探针seqidno.4和seqidno.6；

针对tgfbi基因555位点1663c>t(r555w)检测的探针seqidno.9和seqidno.10，针对tgfbi基因555位点1664g>a(r555q)检测的探针seqidno.10和seqidno.11；

(2)提取待检样本dna，作为检测模板；

(3)分别配置检测tgfbi基因的pcr反应液，包括tgfbir124c/l检测反应液、tgfbir124h检测反应液和tgfbir555w/q检测反应液；

(4)分别将待检样本、阳性对照品、阴性对照品加入到对应pcr反应管中；

(5)进行多重荧光定量pcr检测，多重pcr扩增程序为：37℃2分钟；94℃预变性4分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，45循环；

(6)根据多重荧光定量pcr结果判定基因突变。

本发明中的引物与探针序列如下：

seqidno.1：5’tcgttggatccaccaccact3’

seqidno.2：5’gggcgaagatggtgaagct3’

seqidno.3：fam-ctgtacacggactgcacggagaagctg-bhq1

seqidno.4：hex-tgtacacggaccgcacggagaagc-bhq1

seqidno.5：tamra-ctgtacacggacctcacggagaagctg-bhq1

seqidno.6：fam-ctgtacacggaccacacggagaagctg-bhq1

seqidno.7：5’ccacaaatgaagccttccga3’

seqidno.8：5’aatggagacgtgtacttaagttggtc3’

seqidno.9：fam-ccaccaagagaatggagcagactcttg-bhq1

seqidno.10：hex-ccaccaagagaacggagcagactcttg-bhq1

seqidno.11：tamra-ccaccaagagaacagagcagactcttgg-bhq1

seqidno.12：5’gatgttcactgaagagtaccagaaa3’

seqidno.13：5’ccacgtattttctgcgtttttg3’

seqidno.14：cy5-tctgctagagcagtaccatctgggtctgg-bhq1

综合上述发明内容如下：本发明的一种检测人tgfbi基因124位点和555位点突变的特异性引物，所述引物分别为针对tgfbi基因124位点检测的特异性引物1和2，针对tgfbi基因555位点检测的特异性引物3和4，针对内参基因gusb检测的特异性引物5和6。特异性引物如下：

引物1：5’tcgttggatccaccaccact3’

引物2：5’gggcgaagatggtgaagct3’

引物3：5’ccacaaatgaagccttccga3’

引物4：5’aatggagacgtgtacttaagttggtc3’

引物5：5’gatgttcactgaagagtaccagaaa3’

引物6：5’ccacgtattttctgcgtttttg3’

一种检测人tgfbi基因124位点和555位点突变的特异性探针，所述探针分别为针对tgfbi基因124位点370c>t(r124c)检测的特异性探针1和2，针对tgfbi基因124位点371g>t(r124l)检测的特异性探针3和2，针对tgfbi基因124位点371g>a(r124h)检测的特异性探针4和2，针对tgfbi基因555位点1663c>t(r555w)检测的特异性探针5和6，针对tgfbi基因555位点1664g>a(r555q)检测的特异性探针7和6，以及针对内参基因gusb检测的特异性探针8。特异性探针如下：

探针1：fam-ctgtacacggactgcacggagaagctg-bhq1

探针2：hex-tgtacacggaccgcacggagaagc-bhq1

探针3：tamra-ctgtacacggacctcacggagaagctg-bhq1

探针4：fam-ctgtacacggaccacacggagaagctg-bhq1

探针5：fam-ccaccaagagaatggagcagactcttg-bhq1

探针6：hex-ccaccaagagaacggagcagactcttg-bhq1

探针7：tamra-ccaccaagagaacagagcagactcttgg-bhq1

探针8：cy5-tctgctagagcagtaccatctgggtctgg-bhq1

一种角膜异常症突变基因检测试剂盒，组分见下表1，该试剂盒包括针对tgfbi基因124位点370c>t(r124c)检测的特异性引物和特异性探针、针对tgfbi基因124位点371g>t(r124l)检测的特异性引物和特异性探针、针对tgfbi基因124位点371g>a(r124h)检测的特异性引物和特异性探针、针对tgfbi基因555位点1663c>t(r555w)检测的特异性引物和特异性探针、针对tgfbi基因555位点1664g>a(r555q)检测的特异性引物和特异性探针、以及针对内参基因检测的引物和探针。该试剂盒还包括pcr预混液，pcr预混液包括udg酶、dna聚合酶、pcrbuffer、mgcl2、dntps和dutp。

该试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为8种重组质粒的混合液，所述7种重组质粒为含有tgfbi370t、tgfbi371t、tgfbi371a、tgfbi1663t、tgfbi1664g、tgfbi124wt、tgfbi555wt和gusb序列的重组质粒。阴性对照品为灭菌超纯水。

表1：试剂盒组分

本发明还提供了一种人tgfbi基因124位点和555位点突变的检测方法，该方法包括使用上述检测人tgfbi基因124位点370c>t(r124c)、tgfbi基因124位点371g>t(r124l)、tgfbi基因124位点371g>a(r124h)、tgfbi基因555位点1663c>t(r555w)、tgfbi基因555位点1664g>a(r555q)和内参基因的引物和探针或上述检测人tgfbi基因124位点和555位点突变的试剂盒检测人tgfbi基因124位点和555位点突变的步骤。

本发明检测方法采用多重荧光定量pcr技术检测基因突变，具体步骤如下：

(1)提取待检样本dna，作为检测模板；

(2)根据待检测样本数(含1个阳性对照和1个阴性对照)，计算并配制各反应混合液，包括tgfbir124c/l检测反应液、tgfbir124h检测反应液和tgfbir555w/q检测反应液。将配制好的检测反应液分别分装到八联pcr反应管。

(3)分别将待检样本、阳性对照品、阴性对照品加入到对应pcr反应管中。

(4)进行多重荧光定量pcr检测，多重pcr扩增程序为：37℃2分钟；94℃4分钟；94℃30秒，60℃(收集荧光信号)30秒，45循环。

(5)根据多重荧光定量pcr结果判定基因突变。

与现有技术相比，本发明有以下优点：

(1)本发明提供的人tgfbi基因124位点和555位点突变检测引物、探针具有高特异性和高灵敏度；

(2)使用多重荧光定量pcr技术进行检测，检测过程均为闭关反应，且添加防污染系统和内控系统，能更加准确、稳定地对样本进行分型检测，确保结果真实可信；

(3)操作简单快速，并且结果判读简单客观，便于分析，适用于大规模推广应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例2中tgfbi370c/c纯合图；

图2为本发明实施例2中tgfbi370c/t杂合图；

图3为本发明实施例2中tgfbi370t/t纯合图；

图4为本发明实施例2中tgfbi371g/g纯合图；

图5为本发明实施例2中tgfbi371g/t杂合图；

图6为本发明实施例2中tgfbi371t/t纯合图；

图7为本发明实施例2中tgfbi371g/g纯合图；

图8为本发明实施例2中tgfbi371g/a杂合图；

图9为本发明实施例2中tgfbi371a/a纯合图；

图10为本发明实施例2中tgfbi1663c/c纯合图；

图11为本发明实施例2中tgfbi1663c/t杂合图；

图12为本发明实施例2中tgfbi1663t/t纯合图；

图13为本发明实施例2中tgfbi1664g/g纯合图；

图14为本发明实施例2中tgfbi1664g/a杂合图；

图15为本发明实施例2中tgfbi1664a/a纯合图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例1一种角膜异常症突变基因检测试剂盒

根据目标基因序列设计特异性引物和特异性探针，设计的引物和探针可以按照现有方法进行人工合成。具体引物和探针如下所示：

引物1(tgfbi124-fo)：5’tcgttggatccaccaccact3’

引物2(tgfbi124-re)：5’gggcgaagatggtgaagct3’

引物3(tgfbi555-fo)：5’ccacaaatgaagccttccga3’

引物4(tgfbi555-re)：5’aatggagacgtgtacttaagttggtc3’

引物5(gusb-fo)：5’gatgttcactgaagagtaccagaaa3’

引物6(gusb-re)：5’ccacgtattttctgcgtttttg3’

探针1(tgfbi370t-pr)：fam-ctgtacacggactgcacggagaagctg-bhq1

探针2(tgfbi124wt-pr)：hex-tgtacacggaccgcacggagaagc-bhq1

探针3(tgfbi371t-pr)：tamra-ctgtacacggacctcacggagaagctg-bhq1

探针4(tgfbi371a-pr)：fam-ctgtacacggaccacacggagaagctg-bhq1

探针5(tgfbi1663t-pr)：fam-ccaccaagagaatggagcagactcttg-bhq1

探针6(tgfbi555wt-pr)：hex-ccaccaagagaacggagcagactcttg-bhq1

探针7(tgfbi1664a-pr)：tamra-ccaccaagagaacagagcagactcttgg-bhq1

探针8(gusb-pr)：cy5-tctgctagagcagtaccatctgggtctgg-bhq1

本发明的一种角膜异常症突变基因检测试剂盒包含三组引物探针混合液，分别为：

tgfbir124c/l引物探针混合液：用于tgfbi基因124位点370c>t(r124c)和tgfbi基因124位点371g>t(r124l)检测，包含特异性上游引物tgfbi124-fo和下游引物tgfbi124-re，内参基因上游引物gusb-fo和下游引物gusb-re，特异性探针tgfbi370t-pr、tgfbi124wt-pr和tgfbi371t-pr，内参基因探针gusb-pr。

tgfbir124h引物探针混合液：用于tgfbi基因124位点371g>a(r124h)检测，包括上游引物tgfbi124-fo和下游引物tgfbi124-re，内参基因上游引物gusb-fo和下游引物gusb-re，特异性探针tgfbi1663t-pr和tgfbi124wt-pr，内参基因探针gusb-pr。

tgfbir555w/q引物探针混合液：用于tgfbi基因555位点1663c>t(r555w)和tgfbi基因555位点1664g>a(r555q)检测，包括上游引物tgfbi555-fo和下游引物tgfbi555-re，内参基因上游引物gusb-fo和下游引物gusb-re，特异性探针包括tgfbi1663t-pr、tgfbi555wt-pr和tgfbi1664a-pr，内参基因探针gusb-pr。

pcr预混液包含pcr预混液包括udg酶、dna聚合酶、pcrbuffer、mgcl2、dntps和dutp。

阳性对照品为含有tgfbi370t、tgfbi371t、tgfbi371a、tgfbi1663t、tgfbi1664g、tgfbi124wt、tgfbi555wt和gusb在内的重组质粒混合液；阴性对照品为灭菌超纯水。

实施例2

采用本发明实施例1的试剂盒检测人tgfbi基因124位点和555位点突变，包括以下步骤：

(1)待测样本处理和模板提取；

随机采集20份口腔拭子样本，用提取试剂盒提取dna，提取dna原液作为pcr检测模板。

用合成的重组质粒配制纯合野生，杂合突变和纯合突变质控品，进行pcr检测。配制方法如下：

tgfbi370c/c纯合野生质控品：将合成的tgfbi370c/c质粒和gusb质粒分别稀释成400拷贝/μl,将两种质粒分别以等体积混合，充分混匀。

tgfbi370c/t杂合突变质控品：将合成的tgfbi370c/c质粒、tgfbi370t/t质粒和gusb质粒分别稀释成600拷贝/μl,将两种质粒分别以等体积混合，充分混匀。

tgfbi370t/t纯合突变质控品：将合成的tgfbi370t/t质粒和gusb质粒分别稀释成400拷贝/μl,将两种质粒分别以等体积混合，充分混匀。

tgfbi371g/g纯合野生质控品：将合成的tgfbi371g/g质粒和gusb质粒分别稀释成400拷贝/μl,将两种质粒分别以等体积混合，充分混匀。

tgfbi371g/t杂合突变质控品：将合成的tgfbi371g/g质粒、tgfbi371t/t质粒和gusb质粒分别稀释成600拷贝/μl,将两种质粒分别以等体积混合，充分混匀。

tgfbi371t/t纯合突变质控品：将合成的tgfbi371t/t质粒和gusb质粒分别稀释成400拷贝/μl,将两种质粒分别以等体积混合，充分混匀。

tgfbi371g/a杂合突变质控品：将合成的tgfbi371g/g质粒、tgfbi371a/a质粒和gusb质粒分别稀释成600拷贝/μl,将两种质粒分别以等体积混合，充分混匀。

tgfbi371a/a纯合突变质控品：将合成的tgfbi371a/a质粒和gusb质粒分别稀释成400拷贝/μl,将两种质粒分别以等体积混合，充分混匀。

tgfbi1663c/c纯合野生质控品：将合成的tgfbi1663c/c质粒和gusb质粒分别稀释成400拷贝/μl,将两种质粒分别以等体积混合，充分混匀。

tgfbi1663c/t杂合突变质控品：将合成的tgfbi1663c/c质粒、tgfbi1663t/t质粒和gusb质粒分别稀释成600拷贝/μl,将两种质粒分别以等体积混合，充分混匀。

tgfbi1663t/t纯合突变质控品：将合成的tgfbi1663t/t质粒和gusb质粒分别稀释成400拷贝/μl,将两种质粒分别以等体积混合，充分混匀。

tgfbi1664g/g纯合野生质控品：将合成的tgfbi1664g/g质粒和gusb质粒分别稀释成400拷贝/μl,将两种质粒分别以等体积混合，充分混匀。

tgfbi1664g/a杂合突变质控品：将合成的tgfbi1664g/g质粒、tgfbi1664a/a质粒和gusb质粒分别稀释成600拷贝/μl,将两种质粒分别以等体积混合，充分混匀。

tgfbi1664a/a纯合突变质控品：将合成的tgfbi1664a/a质粒和gusb质粒分别稀释成400拷贝/μl,将两种质粒分别以等体积混合，充分混匀。

(2)体系配制

将试剂盒中所有组分冰上融化，根据待检测样本数，计算并配制各反应混合液(见表2)。

表2检测反应液配制公式

(3)pcr扩增

(4)结果分析

阈值设定：根据不同机型设定阈值，ct值确定：选择std反应管，ntc和样品反应管一并划定阈值，得到各体系和内参ct值阴性无模板空白对照(ntc)应无扩增曲线升起；

根据△ct值(△ct＝fam信号ct值-hex信号ct值或△ct＝tamra信号ct值-hex信号ct值)，判定对应样本的基因多态性，结果判定详见表3。

表3结果判定

tgfbi基因124位点和555位点突变检测结果见说明图(图1-图15)

(5)结果验证

本发明对上述样本同时进行了测序验证，结果表明20例的检测结果与测序结果完全符合，均为纯合野生型。

此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其原料、产品的所取名称等可以不同。凡依本发明专利构思所述的原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。