本发明涉及生物标记技术领域，具体涉及一种用于预测绵羊多羔性状的分子标记及其应用。
背景技术
绵羊(ovisaries)属于单起源的牛科(bovidae)绵羊属，是最早被人类驯化的物种之一。目前有超过1300个品种的10亿只绵羊遍布世界各地，以满足全球市场对肉、奶、毛和皮的需求。其中产羔数性状是绵羊三大重要经济性状(产羔、肉和毛皮)中所占权重最大的生产性状，产羔数对养羊业经济效益的贡献甚至可以达到74％至96％。据不完全统计，产双羔所获的经济效益是产单羔的1.6倍以上(notterdr.geneticimprovementofreproductiveefficiencyofsheepandgoats[j].anim.reprod.sci.2012,130(3-4):147-151)。在大多数绵羊属季节性发情一胎单羔的动物的现实情况下，为了经济利益的最大化，多羔性状一直是人们追求的育种目标。
然而，产羔数是一个极其复杂的性状，受到遗传背景、饲料、饲养环境等多种因素的影响，其中尤以遗传背景最为重要，不同品种绵羊之间的繁殖力具有显著的差异。据不完全统计，世界上仅10余个绵羊品种产羔率为200％以上，其中布鲁拉美利奴绵羊以高达350％的平均产羔率而受世人瞩目。我国也拥有以多羔著称的湖羊和小尾寒羊等高繁殖力绵羊品种，其平均产羔数都在2.5只以上，但是国内其他大部分品种均产单羔。由于羊产羔数性状的遗传力仅为0.1左右，对其选择还受到性别(限性性状)等因素的制约，故用常规的育种技术改良该性状很难在短期内获得较大的遗传进展。因此，如何较快提高产羔数是养羊业亟待解决的一个科学难题。
鉴于绵羊多羔性状的重要性，从20世纪中叶起人们就开始寻找多羔基因。其中研究最多的是绵羊fecb基因。然而，fecb突变在不同绵羊品种中的突变频率各不相同。例如，据报道，含有fecb突变的8个中国绵羊品种的b等位基因频率如下：小尾寒羊(0.50-0.55)、湖羊(0.80-1.00)、多浪羊(0.13-0.17)、策勒黑羊(0.33)、滩羊(0.02-0.22)、洼地绵羊(0.57-0.63)、阿勒泰羊(0.168)、巴音布鲁克羊(0.01)。本发明人的以前研究结果表明，在小尾寒羊中，fecb基因的b等位基因频率在选择过的群体中差异比较大，从0.43至0.83不等，而且不同群体中有分离，bb和b+是最主要的基因型。另外，虽然fecb基因型在一些品种例如小尾寒羊中是分离的，但在不携带fecb突变的小尾寒羊中仍然能够观测到连续的高产羔数现象，如果仅是fecb起主效作用，那实际的产羔数就和预测的产羔数不相符。由此推断小尾寒羊还存在其他的多羔主效基因。因此非常需要进一步鉴定其他的多羔主效基因以及致因突变位点，以期更准确地预测绵羊例如小尾寒羊等的多羔性状。
通用转录因子2a1(gtf2a1，generaltranscriptionfactor2a1)至今在近20种物种中被发现。kyung-alee等(interactionofpolymorphismsintheinterleukin1b-31andgeneraltranscriptionfactor2a1genesonthesusceptibilitytogastriccancer.cytokine,第96-100页，2007.05)的研究结果认为gtf2a1与白血病相关的il1b-31c基因互作从而引发胃癌风险。目前未见gtf2a1与羊多羔性状有关的报道。
技术实现要素：
为了解决现有技术中通过分子标记预测绵羊多羔性状中所存在的结果不稳定、可用于预测的分子标记少等问题，本发明提供了一种新的snp分子标记，该分子标记可以单独地或者与现有的分子标记组合地对绵羊多羔性状进行预测，从而提供高准确度的稳定的预测结果。
本发明人在对绵羊基因组的snp进行研究的过程中发现，在绵羊第7号染色体的第89505005个碱基位置的g>a突变与绵羊多羔性状显著相关。
于是，本发明在第一方面提供了一种与绵羊多羔性状相关的snp分子标记，基于绵羊基因组序列信息版本号oar_v3.1，该分子标记位于绵羊第7号染色体基因组序列第89505005bp位点。
本发明在第二方面提供了一种用于通过sequenom
本发明在第三方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于检测所述分子标记的试剂。
本发明在第四方面提供了一种预测绵羊多羔性状的方法，所述方法通过检测本发明第一方面所述的snp分子标记位点的基因型进行判定。
本发明在第五方面提供了本发明第一方面所述的snp分子标记、本发明第二方面所述的引物组、本发明第三方面所述试剂盒或者本发明第四方面所述的方法在绵羊多羔性状预测中的应用。
本发明的snp分子标记与绵羊的多羔性状显著相关，是适合的可供用于预测绵羊多羔性状的分子标记。本发明的引物组和试剂盒具有使用方便、成本低廉等优点，本发明方法具有高灵敏度，高准确性、高性价比、高通量等优点，可以同时对数百至数千份样本的snp位点进行检测。利用本方法可对所述snp位点实现自动化检测，可以筛选出具有多羔性状的aa纯合个体，从而提高绵羊的繁殖力，适合于以多羔性状为育种目标的绵羊大规模育种。
附图说明
图1为本发明实施例1中利用sequenom
具体实施方式
如上所述，本发明在第一方面提供了一种与绵羊多羔性状相关的snp分子标记，该分子标记位于绵羊第7号染色体基因组序列第89505005bp位点，基于绵羊基因组序列信息版本号oar_v3.1。
所述snp分子标记可以用于预测绵羊例如小尾寒羊的多羔性状。小尾寒羊具有性早熟(6月龄)、常年发情(一年两胎)以及多羔(一胎至少2羔以上)的特点，适应舍饲条件，在全国各地均能正常生长、发育、繁衍，并且其体格高大，因此常被用来作为母本杂交改良其他品种。
sequenom
于是，本发明在第二方面提供了一种用于通过sequenom
当然，本发明还可以延及基于pcr扩增的其他引物或引物组，只要这些引物或者引物组能够通过基于pcr扩增技术检测snp分子标记的基因型即可。
本发明在第三方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括用于检测所述分子标记的试剂和可选的使用说明书。在一些优选的实施方式中，所述试剂包括本发明第二方面所述的引物组。在一些更优选的实施方式中，所述试剂盒还包括dntps、taqdna聚合酶、mg2+溶液、pcr反应缓冲液和sap酶。更优选的是，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明在第四方面提供了一种预测绵羊多羔性状的方法，所述方法通过检测本发明第一方面所述的snp分子标记位点的基因型进行判定。在一些更具体的实施方式中，基因型可以被判定为aa基因型、ga基因型或gg基因型，并且具备aa基因型的母羊产羔数显著高于gg型母羊。
在一些具体的实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)提取待测绵羊的基因组dna；
(2)以待测绵羊的基因组dna为模板，利用本发明第二方面所述的引物组中的正向引物和反向引物进行pcr扩增反应；
(3)用sap酶对pcr扩增产物进行消化，获得酶消化产物；
(4)以所述酶消化产物为模板，利用本发明第二方面所述的引物组中的延伸引物进行延伸反应，获得延伸产物；
(5)分析延伸产物，从而对本发明第一方面所述的snp分子标记位点的基因型进行判定。
在一些优选的实施方式中，步骤(2)中pcr扩增反应使用的反应体系以5μl计为：20-50ng/μl基因组dna1μl，10×pcr反应缓冲液0.5μl，25mmol/lmgcl20.4μl，25μmol/ldntps0.1μl，pcr引物混合物(pcrprimermix)1μl，5u/μltaqdna聚合酶0.2μl，去离子水补至5μl；pcr扩增反应的扩增程序为：95℃2min；95℃30s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃5min。
在另外一些优选的实施方式中，步骤(3)中对pcr扩增产物进行消化时使用的sap酶消化体系以2μl计为：sap缓冲液(sapbuffer)0.17μl，sap酶(sapenzyme)0.3μl，去离子水补至2μl；反应条件为：37℃40min，85℃15min，25℃保存。
另外优选的是，步骤(4)中延伸反应体系以2μl计为：iplex缓冲液(iplexbuffer)0.2μl，终止子混合物(terminatormix)0.2μl，延伸引物混合物(extendprimermix)0.94μl，iplex酶(iplexenzyme)0.041μl，用去离子水补至2μl；延伸反应条件为：94℃30s；{94℃5s，[(52℃5s，80℃5s)5个循环]，40个循环}；72℃3min。其中，40个循环，每个循环包括：94℃5s；以及5个循环的(52℃5s，80℃5s)。其中的5个循环，每个循环包括：52℃5s；以及80℃5s。
本发明在第五方面提供了本发明第一方面所述的snp分子标记、本发明第二方面所述的引物组、本发明第三方面所述的试剂盒或者本发明第四方面所述的方法在绵羊多羔性状预测中的应用。当然，所述snp分子标记或基于所述snp分子标记的试剂盒、引物或引物组以及方法还可以用于其他方面，例如可以联合其他分子标记用于绵羊的遗传图谱的构建、物种起源与亲缘关系分析、遗传育种等方面。
实施例
以下将通过实施例对本发明进行进一步的说明，但是这些实施例不应被理解为是对本发明范围的限制。除非另有说明，否则实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1
1、实验材料
多羔绵羊品种小尾寒羊380只，单羔绵羊品种(滩羊、苏尼特羊、萨福克羊、杜泊羊和草原型藏羊)共380只(具体数量如下表1所示)。对它们进行基因型分型，并对产羔数存在差异的380只小尾寒羊进行基因型与产羔数的关联分析。
表1.基因型分型用绵羊品种及个体数量信息
2、试剂及仪器
试剂：completegenotypingreagentkitfor
3、基因组dna的提取
绵羊颈静脉采血1ml，用edta抗凝处理。首先使用红细胞裂解液裂解去除不含dna的红细胞，再使用细胞核裂解液释放出基因组dna，然后使用蛋白沉淀液选择性地去除沉淀蛋白，从而获得纯净的基因组dna，再通过异丙醇沉淀基因组dna并将其重溶解于dna溶解液备用。
4、sequenom
针对绵羊第7号染色体基因组序列第89505005bp位点(基于绵羊基因组序列信息版本号oar_v3.1)设计引物组。pcr扩增使用的上游引物的序列如seqidno.1所示，下游引物的序列如seqidno.2所示。延伸引物的序列如seqidno.3所示，延伸方向是正向。上述引物由君诺德公司合成。
检测流程如下：
(1)提取待测绵羊的基因组dna；
(2)以待测绵羊的基因组dna为模板，利用正向引物和反向引物进行pcr扩增反应；
(3)用sap酶对pcr扩增产物进行消化，获得酶消化产物；
(4)以酶消化产物为模板，利用延伸引物进行延伸反应；
(5)分析延伸产物，从而对绵羊第7号染色体基因组序列第89505005bp位点基因型进行判定。
其中，pcr扩增反应使用的反应体系以5μl计为：20-50ng/μl基因组dna1μl，10×pcr反应缓冲液0.5μl，25mmol/lmgcl20.4μl，25μmol/ldntps0.1μl，pcrprimermix1μl，5u/μltaqdna聚合酶0.2μl，去离子水补至5μl；pcr扩增反应的扩增程序为：95℃2min；95℃30s，56℃30s，72℃60s，45个循环；72℃5min。
对pcr扩增产物进行消化，主要是用sap酶去除反应产物中的剩余引物和dntp。使用的sap酶消化体系以2μl计为：sapbuffer0.17μl，sapenzyme0.3μl，去离子水补至2μl。反应条件为：37℃40min，85℃15min，25℃保存。
延伸反应体系以2μl计为：iplexbuffer0.2μl，terminatormix0.2μl，extendprimermix0.94μl，iplexenzyme0.041μl，去离子水补至2μl。延伸反应条件为：94℃30s；{94℃5s，[(52℃5s，80℃5s)5个循环]，40个循环}；72℃3min。
将树脂纯化后的延伸产物移至384孔spectrochip(sequenom)芯片上，进行maldi-tof-ms(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)反应，利用typer4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。小尾寒羊第7号染色体基因组序列第89505005bp位点的质谱检测结果如图1所示，其中横坐标为低分子量高度(lowmassheight)，纵坐标为高分子量高度(highmassheight)。结果发现，aa基因型277例；ag基因型94例；gg基因型6例；基因型缺失(nocall)3例。
统计结果：
待测绵羊第7号染色体基因组序列第89505005bp位点不同基因型分析统计结果见表2。
表2绵羊第7号染色体基因组序列第89505005bp位点在单、多羔绵羊群体中的基因型频率和等位基因频率
注：表2中的数据来自于材料部分所述的单羔绵羊(380只)和小尾寒羊(380只)。
从表2的统计结果可以看出，多羔绵羊与单羔绵羊的基因型频率分布存在极显著差异，多羔群体主要以aa型为主，单羔群体主要以gg型为主。就等位基因频率而言，多羔群体主要以a等位基因为主，单羔群体主要以g等位基因为主。
表3.绵羊第7号染色体基因组序列第89505005bp位点不同基因型与小尾寒羊产羔数的关联分析
注：同一列中不同肩标小写字母之间表示差异显著(p<0.05)。
从表3的统计结果可以看出，绵羊第7号染色体基因组序列第89505005bp位点与小尾寒羊第1、2、3胎的产羔数均密切关联，该位点aa型母羊的产羔数显著高于gg型母羊产羔数。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120>一种用于预测绵羊多羔性状的snp分子标记及其应用
<130>gy17100585
<160>3
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
acgttggatgatgaaatccatctaccgccc30
<210>2
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
acgttggatgatccccatgtccagatcttc30
<210>3
<211>24
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
gcattagtttattctcccataact24