荧光比率探针及其合成方法和检测细胞内溶酶体甲醛应用与流程

本发明属于分析化学
技术领域：
，涉及一种用于检测细胞内甲醛的荧光比率探针；本发明还涉及该荧光比率探针的合成方法；另外，该发明还涉及该荧光比率探针的用途。具体涉及一种荧光比率探针及其合成方法和检测细胞内溶酶体甲醛应用。
背景技术：
：甲醛(fa)是一种常见的致癌和致畸物质，已经被世界卫生组织确定为潜在的变态反应源。作为一种化学污染物，甲醛造成的室内空气、大气环境和食品污染会导致甲醛中毒，造成头晕、头痛或恶心、呕吐，严重的会引起记忆力减退，甚至死亡。但据报道，fa在正常生理条件下以较高的浓度存在于细胞内，在某些细胞器中高达500μm。在大多数生物有机体中，一些氨基酸和外源性物质，在脱甲基化酶或氧化酶的催化作用下，发生新陈代谢，也会产生内源性的甲醛。在大脑组织内，正常浓度的甲醛通过dna脱甲基过程，在长期记忆的存储、保存和检索上有着至关重要的作用。然而，人体内的甲醛含量超过一定剂量时，会引起许多疾病，包括阿尔茨海默病、神经源性炎症、糖尿病、慢性肝病、心血管疾病和癌症等。由于甲醛在工业环境和家用物品中普遍存在，已经设计了几种敏感的甲醛检测方法，包括使用高效液相色谱(hplc)、气相色谱(gc)、质谱(ms)以及预富集/化学电离质谱的方法。尽管如此，甲醛的生理功能仍未明确，开发一种有效的监测生物体系中甲醛的荧光探针也是一个非常有意义的课题。由于光谱技术的发展和荧光分子探针的发展，荧光成像技术已经成为追踪生物分子在生物系统中的一种强有力的手段。目前检测生物体内甲醛的荧光探针基本上为有机分子。但其水溶性差，限制其应用，有些有机分子存在合成工艺复杂，光漂白快，荧光寿命短，反应时间长，检测灵敏度低、受溶剂影响构建比率难度大等问题。为了解决这些问题，碳点(cds)作为一种有效的荧光探针，与其他成像技术相比，由于其合成简单、具有细胞毒性低、化学惰性好、光稳定性高、水溶性好、易于表面功能化等特点，被用作一种更有效的荧光探针。将有机分子与碳点结合，一方面增强其水溶性，使其可以在水溶液中进行操作反应，二是可以构成比率检测，提高检测灵敏度，比率荧光探针可以提供一种内置的环境干扰校正，排除了光激发强度的波动及一些因素，如仪器效率，环境条件的干扰。技术实现要素：针对目前现有的荧光探针检测甲醛时所面临的合成工艺复杂，光漂白快，荧光寿命短，水溶性差、检测准确性容易受探针环境干扰、检测灵敏度低等现状，本发明通过将水溶性良好的纳米碳点与有机小分子结合，合成出一种具有双发射带的比率型甲醛荧光探针，简写为cds-na；并进一步提供了cds-na的合成方法和应用。本文将碳点与萘酰亚胺结构的分子结合，以碳点为背景荧光信号，萘酰亚胺为反应基团，构建一种检测甲醛的高效荧光比率探针(cds-na)。该荧光比率探针成功地实现了对细胞内外甲醛的检测，具有较好的选择性和检测灵敏度，对未来双发射荧光比率探针进一步应用于生物标记等领域提供了重要的理论意义。本发明的一种荧光比率探针，其结构式为：所述的荧光比率探针，是一种比率型荧光探针，其激发波长为365nm；随甲醛浓度的升高，所述的荧光比率探针在414nm处的荧光峰值保持不变，而在535nm处的荧光峰值逐渐增强；所述的荧光比率探针在535nm处的荧光强度与414nm处的荧光强度比值(f535/f414)，随甲醛浓度的升高而增强。所述的荧光比率探针，随着时间增加，535nm处的荧光强度与414nm处的荧光强度比值(f535/f414)逐渐变大，并且在30分钟达到最大值。所述的荧光比率探针，能抗pbs、乙二醛、乙醛、丙酮、4-硝基苯甲醛、三氯乙醛、naclo、h2o2、cacl2、mgcl2、nano2、na2so3、nahs、nahso3、谷胱甘肽还原、乙酰l半胱氨酸、dl-半胱氨酸、精氨酸、l-半胱氨酸、苯丙氨酸精氨酸、l-半胱氨酸、苯丙氨酸中的一种或几种混合物的干扰。本发明的一种荧光比率探针的合成方法，包括以下步骤：步骤1：制备甲硫氨酸碳点固体粉末将甲硫氨酸和柠檬酸加入水中，溶解均匀，得到反应液；其中，按质量比，甲硫氨酸：柠檬酸＝(0.8～1.6)：(1～2)，加入水的量为充分溶解甲硫氨酸和柠檬酸即可；将反应液置于180～200℃下反应2～4h，反应结束后，冷却至室温，得到混合液；将混合液离心后，得到的上清液备用；将上清液用透析袋透析，去除残留的原料分子，冷冻、真空干燥，得到甲硫氨酸碳点固体粉末；步骤2：制备荧光比率探针粗产品(1)将4-溴-1,8-萘酸、6-氨基已酸、无水乙醇混合，搅拌回流1～3h，旋蒸，将得到的固体物料真空烘干，得到s1；其中，按固液比，4-溴-1,8-萘酸：6-氨基已酸：无水乙醇＝(1.0～1.5)g：(0.5～0.8)g：(20～40)ml；将s1溶于二甲基亚砜(dmso)中，得到s1的dmso溶液；(2)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl)和4-二甲氨基吡啶(dmap)溶于水中，搅拌均匀，得到催化剂溶液；其中，按质量比：edc.hcl：dmap＝(0.01～0.02)：(0.001～0.003)；(3)将s1的dmso溶液、催化剂溶液混合，最后加入甲硫氨酸碳点固体粉末，搅拌均匀，避光室温搅拌35～40h，得到荧光比率探针粗产品反应液；其中，按质量比：s1：催化剂：甲硫氨酸碳点固体粉末＝(0.01～0.02)：(0.01～0.02)：(0.015～0.03)；步骤3：取代反应向荧光比率探针粗产品反应液中，加入无水乙醇和质量浓度为60～80％的水合肼，70～80℃搅拌回流3～5h，旋蒸，将剩余的固体物料，经过透析袋透析46～50h，去除未反应的原料，旋蒸，冻干，得到荧光比率探针；其中，按体积比：荧光比率探针粗产品反应液：无水乙醇：质量浓度为60～80％的水合肼＝(3～5)ml：(3～5)ml：(300～500)μl。所述的步骤1中，所述的透析袋为截留分子量为500d的透析袋，去除小于500d的原料分子，透析时间为10～15h，每隔1～3h换一次水。所述的步骤1中，所述的离心，离心转速为10000～13000r/min，离心时间为10～20min。所述的步骤2(1)中，回流温度为70～85℃。所述的步骤3中，所述的透析袋为截留分子量为500～1000d的透析袋。所述的步骤3中，所述的回流温度为70～90℃，回流时间为1～3h。本发明的荧光比率探针的应用，用于检测甲醛，尤其用于检测水环境中的甲醛和生物样品时的甲醛。所述的荧光比率探针的应用，所述的生物样品，可以为活细胞。所述的荧光比率探针的应用，具体应用方法为：当检测水环境中的甲醛时，采用荧光光谱仪，通过荧光比率探针的荧光光谱变化来检测水环境中的甲醛；当检测生物样品中的甲醛时，采用采用共聚焦显微镜，通过观察荧光比率探针的荧光成像图的变化来检测生物样品中的甲醛。所述的荧光比率探针的应用，采用荧光光谱仪，激发波长为365nm；随甲醛浓度的升高，荧光光谱在414nm处的荧光峰值逐渐降低，同时在535nm处产生一个新的发射带并且荧光峰值逐渐增强。所述的荧光比率探针的应用，采用共聚焦显微镜，激发光源为汞灯，分别收集蓝色和黄色频道荧光；随着甲醛浓度的增加，蓝色频道荧光保持不变，同时黄色频道荧光逐渐增强。所述的荧光比率探针的应用，当检测生物样品中的甲醛时，荧光比率探针主要分布在溶酶体中。本发明的荧光比率探针的合成方法中，其工艺路线为：(1)cds的合成(2)s1的合成(3)cds-na的合成本发明的荧光比率探针的应用，其与甲醛反应的过程为：本发明的荧光比率探针及其合成方法和检测细胞内溶酶体甲醛应用，其有益效果在于：本发明的荧光比率探针，水溶性好，检测准确性不容易受探针浓度、探针所处环境、检测仪器影响，准确性高；所能检测到的甲醛的最低浓度为338nmol/l，灵敏度高；抗干扰能力强，实现了在水溶液中对甲醛的高选择性检测；不仅能检测水环境中的甲醛，还能检测细胞环境中的甲醛，对溶酶体有良好的靶向性，实现了在活细胞水平中甲醛的荧光成像，具有潜在的实际应用价值。附图说明图1是实施例1中探针cds-na的三维荧光图谱，图1(a)为未加甲醛，图1(b)是加了30μm甲醛，535nm发射处荧光有增强；图2是实施例2中探针cds-na随不同量甲醛的加入，荧光谱图的变化情况；从下至上，依次为在甲醛浓度为0,1,2,5,10,15,20,30,40,50,60,100,160μm中，探针的荧光光谱；图3是实施例3中探针cds-na荧光强度比值(f535/f414)与不同量甲醛的线性关系图；图4是实施例4中探针cds-na与甲醛随时间变化的点状荧光数据图；图5是实施例5中探针cds-na对不同干扰分析物的选择性柱状荧光数据图；图中，pbs、乙二醛、乙醛、丙酮、4-硝基苯甲醛、三氯乙醛、甲醛、naclo、h2o2、cacl2、mgcl2、nano2、na2so3、nahs、nahso3、谷胱甘肽还原、乙酰l半胱氨酸、dl-半胱氨酸、精氨酸、l-半胱氨酸、苯丙氨酸；图6是实施例6探针cds-na与细胞中甲醛响应的荧光成像图；图中，加入探针0.1mg/mlcds-na孵育4h后的荧光成像，分别添加不同浓度的甲醛(0，200，500，1000μm)与hela细胞继续孵育1h荧光成像；标尺为50微米。图7是实施例7探针cds-na与溶酶体探针共定位图，a为探针蓝色通道的光，b为探针绿色通道的光，c为溶酶体探针红色的光，d为a、b、c三者的叠加图，e为重叠系数图。图8是实施例8细胞摄取探针cds-na途径。先将细胞用抑制剂预处理，再将预处理后的细胞与探针孵育，进行荧光成像。(1)control(2)阿米洛利(3)甲基β-环糊精(4)氯丙嗪(5)4℃(6)染料木黄酮。图9是本发明实施例1制备的甲硫氨酸碳点固体粉末(cds)和荧光比率探针(cds-na)的红外光谱谱图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1:化合物cds-na的合成方法，包括以下步骤：步骤1：制备甲硫氨酸碳点固体粉末称取0.8g甲硫氨酸和1g柠檬酸于20ml小烧杯中，缓慢加入5ml二次水用玻璃棒均匀搅拌使之溶解，待溶解完全后，得到反应液；将反应液全部转移到25ml反应釜中，并装好钢套，于鼓风干燥箱中200℃加热反应3h，待反应结束后，冷却至室温，得到混合液。接着，将混合液吸出，以12000r/min的转速离心15分钟，以去掉无荧光的大颗粒物质，得到碳点的上清液备用。然后，将上清液用截留分子量为500d的透析袋透析12h，去除残留的原料分子，其间每隔2h换一次水。最终得到的碳点水溶液，经冷冻和真空干燥，得到甲硫氨酸碳点固体粉末(cds)。对制备的cds进行红外分析，采用kbr压片法，得到的红外光谱谱图见图9。步骤2：制备荧光比率探针粗产品(1)将1.3824g的4，溴-1,8-萘酐，0.6597g的6-氨基己酸，30ml无水乙醇混合，80℃搅拌回流2h，40℃旋蒸后，将得到的旋蒸留下的物质转移至50ml小烧杯，30℃真空烘箱烘干，得s1。称取0.0116g的s1溶于1mldmso中，超声溶解，得到s1的dmso溶液；(2)将0.0141g的edc.hcl，0.0023g的dmap溶解于4ml水，搅拌1h，得到催化剂溶液；(3)将s1的dmso溶液，催化剂溶液混合，20mg的甲硫氨酸碳点固体粉末后加入，包锡纸避光，室温搅拌36h，得到荧光比率探针粗产品反应液。步骤3：取代反应向荧光比率探针粗产品反应液中，加入4ml无水乙醇和300μl80％水合肼，80℃加热搅拌回流4h。旋蒸至4ml，将剩余的固体物料，透析(500-1000d)48h，去除未反应的原料。旋蒸，冻干得终产物-荧光比率探针(cds-na)。对制备的cds-na进行红外分析，采用kbr压片法，得到的红外光谱图见图9，3500至3200cm-1的宽振动带归因于-oh和-nh2伸缩振动，在1632cm-1处的强振动带(-c＝o伸缩振动)证实cds表面上存在-cooh基团。2926,2856cm-1的条带对应于ch2和-ch3的伸缩，-ch2变形的1399cm-1的谱带证明成功合成带有-cooh和-nh2基团的cds。与cds的红外光谱相比，cds-na在1463和1605cm-1处表现出额外的振动带，与萘的芳香环骨架相对应。在2957cm-1处有一个强化的振动带，在2852cm-1处有一个小的振动带，代表-ch2的延伸。3431cm-1，1627cm-1和1354cm-1的伸缩振动表明酰胺键的-nh，c＝o，c-n的伸缩振动，证实了cds与萘酰亚胺单元的偶联。其结构为荧光比率探针(cds-na)的三维荧光图谱见图1，图1(a)为未加甲醛，图1(b)是加了30μm甲醛，535nm发射处荧光有增强。实施例2:荧光比率探针cds-na随不同量甲醛的加入荧光谱图的变化用pbs(10mm,ph7.4)作为溶剂，配制浓度为0.1mgml-1的cds-na的pbs溶液。依次向装有400μlcds-na的pbs溶液的离心管中，加入100μl不同浓度(0,1,2,5,10,15,20,30,40,50,60,100,160μm)的甲醛溶液，震荡30min。使用光程为0.5cm的比色皿，固定激发波长为365nm，光电倍增管电压为650v，用日立f-7000型荧光分光光度计测量其荧光发射光谱，不同量甲醛的探针cds-na的荧光光谱的变化情况见图2，从图2中可以看出随着甲醛浓度的升高，在414nm处的荧光峰值保持不变，而在535nm处的荧光峰值逐渐增强。实施例3:探针cds-na检测甲醛下限的计算根据实例2的荧光光谱图，535nm处的荧光强度与414nm处的荧光强度比值(f535/f414)与对应甲醛浓度做图，见图3。由图3可见，甲醛浓度在0-40μmol/l，f535/f414与甲醛浓度具有很好线性。根据公式dl＝3σ/k(dl为检测下限，σ为截距标准偏差，k为斜率)可计算检测下限为338nm。实施例4:荧光比率探针cds-na加不同量甲醛随时间变化荧光强度的变化向装有400μl、0.1mgml-1cds-na的pbs溶液的离心管中，加入100μl0、20和100μm浓度的甲醛标准溶液，用荧光光谱仪测试探针在甲醛母液中随时间变化的荧光光谱见图4。在20μm浓度下30分钟内达到响应平衡。当用100μm甲醛反应时，达到平台10分钟。实施例5:荧光比率探针cds-na对不同干扰分析物的选择性研究取21支编好号的1.5ml的ep管，先向每支管中加入400μl的cds-na(0.1mgml-1)的pbs溶液，然后依次再加入100μl的甲醛(150μm)、pbs、250μm醛酮类(乙二醛、乙醛、丙酮、4-硝基苯甲醛、三氯乙醛)、500mm活性氧氮(naclo、h2o2、nano2)、25mm阴阳离子(cacl2、mgcl2、nahs、na2so3、nahs、nahso3)、25mm氨基酸类(还原型谷胱甘肽、乙酰-l-半胱氨酸、dl-半胱氨酸精氨酸、l-半胱氨酸、苯丙氨酸)，震荡30min。使用光程为0.5cm的比色皿，固定激发波长为365nm，光电倍增管电压为650v，用日立f-7000型荧光分光光度计测得探针的双发射荧光峰对各个分析物的荧光响应谱图见图5，图5中，横坐标各个序号代表的物质见下表。表1图5中横坐标各个序号代表的物质序号代表物质1pbs2乙二醛3乙醛4丙酮54硝基苯甲醛6三氯乙醛7甲醛8naclo9h2o210cacl211mgcl212nano213na2so314nahs15nahso316谷胱甘肽还原17乙酰l半胱氨酸18dl-半胱氨酸19精氨酸20l-半胱胺酸21苯丙氨酸实施例6：荧光比率探针cds-na与细胞中甲醛的荧光成像选取处于对数生长期的细胞，将细胞瓶中的培养液倒掉，加入10mmoll-1的pbs洗涤2次，每次浸泡1min。向细胞瓶中加入用dmem高糖培养基稀释的cds-na溶液，终浓度为0.1mg/ml，放在co2培养箱中37℃孕育4h。将培养瓶中的标记溶液倒掉，用10mmoll-1pbs(ph7.4)冲洗3次。分别添加不同浓度的甲醛(0，200，500，1000μm)与hela细胞继续孵育1h后，pbs洗三次。放在共聚焦荧光显微镜(olympus，日本)下观察细胞，观察过程中保持细胞表面湿润。细胞成像实验中分别使用405nm作为激发光源。(图片中blue蓝色；green绿色；bright明场；overlay通道叠加；ratio比例)细胞成像实验中使用40倍物镜。观察时用到2个通道，激发波长为405nm,发射波长分别是420-460nm(通道1)，520-560nm(通道2)。探针cds-na与细胞中甲醛响应的荧光成像图见图6。实施例7：荧光比率探针cds-na与细胞中对溶酶体的靶向采用荧光染料共定位的方法确定cds-na在细胞中的分布。先将细胞和cds-na(0.1mg/ml)孵育4个小时，弃去培养液并用pbs缓冲溶液清洗细胞。然后用lysotracker-red对细胞染色40分钟，用pbs缓冲溶液洗净残余。在共聚焦显微镜下观察cds-na在细胞中的分布。探针cds-na与溶酶体探针共定位图见图7，在激发405nm观测条件下，可以分别观察到细溶酶体中蓝色的碳点荧光，也可以观察到绿色的响应荧光。在激发559nm观测条件下，则只能观察到溶酶体探针的红色荧光。分别将探针中的蓝色荧光和绿色荧光与溶酶体探针的红色荧光叠加，皮尔森相关系数达0.93。具有较强的相关性，重叠程度较高，这说明进入细胞的cds-na主要分布在溶酶体中。实施例8：细胞摄取荧光比率探针cds-na的途径将hela细胞与不同的途径抑制剂如氯丙嗪(10μm，网格蛋白介导的内吞抑制剂)、染料木黄酮(185μm，穴陷蛋白介导的内吞抑制剂)、甲基β-环糊精(5mm，脂筏介导的内吞抑制剂)和阿米洛利(100μm，巨胞饮抑制剂)在37℃下预孵育1h，还有一组细胞用4°c预培养1h，观察能量对细胞内化过程的影响，并设置一组对照组。之后，将cds-na(0.1mg/ml)与细胞共培养4h，然后用pbs生理缓冲液(10mm，ph7.40)冲洗3次，最后进行荧光成像。图中(1)对照组(control)；(2)阿米洛利(ami)；(3)甲基β-环糊精(mcd)；(4)氯丙嗪(chp)；(5)4℃；(6)染料木黄酮(gen)。细胞摄取探针cds-na途径见图8。4℃培育摄取率下降到57％，说明细胞摄取是一个耗能过程，由于酶活性降低，低温下产生的能量较少。与氯丙嗪、染料木黄酮共同孵育时，探针的内化率分别下降到68％和72％，表明内化主要通过网格蛋白介导的内吞作用和穴陷蛋白介导的内吞作用进行。与阿米洛利和甲基β-环糊精的孵育对摄取几乎没有影响，表明内化过程中不存在脂筏介导的内吞和巨胞饮或这两种内化作用较弱。当前第1页12