本发明涉及一种人参皂苷ck的制备方法，属于提取物制备领域。
背景技术
人参皂苷ck是人参中二醇型人参皂苷在人肠道内的代谢产物，是人参在体内发挥活性的实体；生物活性研究表明人参皂苷ck是一个多靶点、高活性化合物，其不但在抗肿瘤、抗炎、保肝和抗过敏方面体现了良好的活性，而且在神经系统及免疫系统方面也具有很好的调节作用，具有抑制肿瘤细胞增殖和炎症、抗致癌和抗癌、抗过敏、缓解老年痴呆症的症状、抗糖尿及抗氧化因子促进夷岛素分泌、保护肝脏和皮肤。
人参皂苷ck稳定性差，人参皂苷在天然人参中并不存在，人参皂苷ck突出的药理活性引起了广泛的关注，寻找一条有效的获得途径成为迫切需求。世界上很多学者致力于ck的生产研究。人参皂苷ck属于原人参二醇型皂苷，此类皂苷结构特点是具有相同的母核，不同点是在c-3和c-20位是由不同糖基构成。传统思维是通过利用酸碱水解的方法获得产物，但化学方法存在污染大，耗资大，水解副产物多等弊端；化学方法存在产物难以控制，难以获得单一性的目标产物，后续需要大量的分离工序，对环境污染比较严重等缺点。因此，相关研究逐年减少，现在多集中于生物转化法上，主要包括微生物转化和酶转化；文献报道中从人参中分离而得的人参皂苷β-葡萄糖甙酶转化效率较高，杂质少，但该酶不是单一化合物，很难人工制备，直接分离成本较高，很难适用于人参皂苷ck酶解制备方法的工业化。
技术实现要素：
本发明提供了一种人参皂苷ck的制备方法，本发明采用弱酸混合酸水解法制备人参皂苷ck，该方法关键点在于控制转化时混合酸水解溶液比例、浓度和水解时间，避免了化学方法存在的产物难以控制，难以获得单一性的目标产物，后续还要大量的分离工序，对环境污染比较严重、目标产物收率低的问题。
本发明方法的步骤如下：
（1）以三七叶为原料，粉碎后采用质量浓度50-70%的甲醇溶液或乙醇溶液热回流提取2-3次，提取温度80-85℃，每次提取时间1-2h，过滤，合并提取液，减压浓缩回收有机溶剂，得三七叶粗提物；
（2）将步骤（1）三七叶粗提物经过苯乙烯大孔吸附树脂柱吸附三七叶总皂苷，水洗树脂柱到无色，然后用体积浓度70-75%的乙醇溶液解析三七叶总皂苷，收集洗脱液，回收乙醇浓缩干燥得三七叶总皂苷；
（3）在步骤（2）三七叶总皂苷中加入其质量4-6倍的无水乙醇、甲醇或正丁醇，水浴加热溶解，过滤得到三七叶皂苷澄清液，在三七叶皂苷澄清液中加入其质量3-5倍的乙酸乙酯或丙酮，边加边磁力搅拌，搅拌25-35min后，置于4℃下冷藏24小时，逐渐有白色沉淀析出，析出物为人参皂苷rb3、rb2、人参皂苷fc；过滤取白色沉淀，弃滤液；沉淀中按干燥品计算rb3含量大于30%，rb2含量大于20%，人参皂苷fc大于20%；
（4）在步骤（3）中白色沉淀中加入干燥白色沉淀质量9-11倍的纯水加热溶解，放冷后再加入溶液质量9-11%的冰乙酸-hcl溶液，混匀后于水浴60-80℃加热，当出现沉淀时，停止加热，完成反应；加热过程中出现大量白色沉淀，反应溶液中主要含人参皂苷ck和少量人参皂苷rh2，沉淀主要含有人参皂苷rg3、人参皂苷rh2和少量人参皂苷ck，其中冰乙酸-hcl溶液是冰乙酸与盐酸按体积比3-5:1的比例混合制得；
（5）步骤（4）反应结束后，向反应物中加入1-1.5mol/l的naoh溶液调节ph值到中性，过滤得滤液和沉淀，沉淀反复用80-100℃热水洗涤3-4次，洗涤液合并入滤液中，滤液主含人参皂苷ck，沉淀为人参皂苷rh2、人参皂苷rg3；
（6）取步骤（5）滤液，加热到40-50℃过苯乙烯大孔吸附树脂柱脱盐，吸附人参皂苷ck，上柱流出液为盐类，纯净水洗柱子到无盐后，用体积浓度80%-95%的乙醇溶液解析人参皂苷ck，收集洗脱液，旋蒸回收乙醇，浓缩得清膏，清膏波美度为1.2-1.3，向清膏中加入其质量1-2倍的丙酮，搅拌均匀，置于1-3℃下放置24小时，得白色粉末结晶产物，过滤低温干燥得人参皂苷ck粗品，含量大于90%；
（7）取人参皂苷ck粗品用二氯甲烷-甲醇溶液超声溶解，200-400目硅胶用二氯甲烷湿法装柱，溶解液上硅胶柱，上样后以二氯甲烷-甲醇溶液作为洗脱液进行洗脱，收集含人参皂苷ck的洗脱液，减压回收溶剂，浓缩产物冷冻干燥得人参皂苷ck，含量大于98%，以步骤（3）中三七叶总皂苷计算，人参皂苷ck得率大于30%。
所述二氯甲烷-甲醇溶液是二氯甲烷与甲醇按体积比8:0.1的比例混合制得。
所述苯乙烯大孔吸附树脂型号为d101、hpd100、xad-1600、t-28。
本发明方法中酸解反应后液体里主要是人参皂苷ck和少量人参皂苷rh2，沉淀里主要是人参皂苷rg3和人参皂苷rh2，这四个转化产物中人参皂苷ck和rh2薄层层析时极性相差不大，硅胶分离难度较大，反应产物如果直接过硅胶柱层析，死吸附大，分离度低，rg3成分柱层析时还存在严重堵柱子的问题；本发明根据人参皂苷ck和人参皂苷rh2在水中溶解性差异，采用水做萃取溶剂提取反应所得沉淀部分人参皂苷ck,分离去除杂质人参皂苷rh2和人参皂苷rg3，实验发现人参皂苷ck和人参皂苷rh2虽然在硅胶柱上分离度低，但在热水中溶解度差异较大，人参皂苷ck在热水中具有较好的溶解度，人参皂苷rh2则仅微溶，将步骤（4）反应产物进行调碱到中性、树脂脱盐树脂洗脱液浓缩干燥简单处理即可得到含量大于90%的人参皂苷ck粗产品，要获得高纯度人参皂苷ck仅需把含量大于90%粗品进行一次硅胶柱层析即可获得含量大于98%的人参皂苷ck样品，由于上样粗品中基本不含人参皂苷rg3不存在柱层析堵柱现象，避免了文献中反复用硅胶柱、凝胶柱层析法才可以得到人参皂苷ck的方法弊端；该法对原料起始物有一定要求，二醇皂苷含量越高，黄酮类杂质越少，人参皂苷ck转化速度快，杂质少、含量高；在混合酸水解时，盐酸比例越高，水解越快，人参皂苷ck得率越低，盐酸比例越低，人参皂苷ck得率越高，但反应越慢，本发明采用适当的混合比例使得ck转化率提高，反应加快。
本发明采用混酸水解法制备人参皂苷ck，本发明方法转化效率高，转化产物容易分离去除杂质，用简单溶剂法处理即可得到含量大于90%的人参皂苷ck粗产品，避免了反复用硅胶柱、凝胶柱层析法才可以得到人参皂苷ck的弊端；本发明方法成本低、效率高，适于工业化生产和市场推广应用。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。
实施例1：人参皂苷ck的制备方法步骤如下：
（1）以三七叶为原料，粉碎后采用质量浓度50%的甲醇溶液热回流提取3次，提取温度80℃，每次提取时间2h，过滤，合并提取液，减压浓缩回收有机溶剂，得三七叶粗提物；
（2）将步骤（1）三七叶粗提物经过苯乙烯大孔吸附树脂d101柱吸附三七叶总皂苷，水洗树脂柱到无色，然后用体积浓度70%的乙醇溶液解析三七叶总皂苷，收集洗脱液，回收乙醇浓缩干燥得三七叶总皂苷；
（3）在步骤（2）三七叶总皂苷中加入其质量4倍的无水乙醇，水浴加热溶解，过滤得到三七叶皂苷澄清液，在三七叶皂苷澄清液中加入其质量3倍的乙酸乙酯，边加边磁力搅拌，搅拌35min后，置于4℃下冷藏24小时，有白色沉淀析出，过滤取白色沉淀，弃滤液，沉淀中按干燥品计算rb3含量35%，rb2含量25%，人参皂苷fc25%；
（4）在步骤（3）中白色沉淀中加入干燥白色沉淀质量11倍的纯水加热溶解，放冷后再加入溶液质量10%的冰乙酸-hcl溶液，混匀后于水浴60℃加热，加热1小时后出现白色沉淀，停止加热，完成反应，其中冰乙酸-hcl溶液是冰乙酸与盐酸按体积比4:1的比例混合制得；
（5）步骤（4）反应结束后，向反应物中加入1mol/l的naoh溶液调节ph值到中性，过滤得滤液和沉淀，沉淀反复用80℃热水洗涤4次，洗涤液合并入滤液中；
（6）取步骤（5）滤液，加热到50℃过苯乙烯大孔吸附树脂d101柱脱盐，吸附人参皂苷ck，上柱流出液为盐类，纯净水洗柱子到无盐后，用体积浓度80%的乙醇溶液解析人参皂苷ck，收集洗脱液，旋蒸回收乙醇，浓缩得清膏，清膏波美度为1.2，向清膏中加入其质量1倍的丙酮，搅拌均匀，置于2℃下放置24小时，得白色粉末结晶产物，过滤50℃干燥得人参皂苷ck粗品，含量92.5%；
（7）取人参皂苷ck粗品用二氯甲烷-甲醇溶液（二氯甲烷与甲醇按体积比8:0.1的比例混合制得）超声溶解，200目硅胶用二氯甲烷湿法装柱，溶解液上硅胶柱，上样后以二氯甲烷-甲醇溶液（二氯甲烷与甲醇按体积比8:0.1的比例混合制得）作为洗脱液进行洗脱，收集含人参皂苷ck的洗脱液，减压回收溶剂，浓缩产物冷冻干燥得人参皂苷ck，含量99.2%，以步骤（3）中三七叶总皂苷计算，人参皂苷ck得率27.3%。
实施例2：人参皂苷ck的制备方法步骤如下：
（1）以三七叶为原料，粉碎后采用质量浓度60%的甲醇溶液热回流提取2次，提取温度85℃，每次提取时间1.5h，过滤，合并提取液，减压浓缩回收有机溶剂，得三七叶粗提物；
（2）将步骤（1）三七叶粗提物经过苯乙烯大孔吸附树脂hpd100柱吸附三七叶总皂苷，水洗树脂柱到无色，然后用体积浓度72%的乙醇溶液解析三七叶总皂苷，收集洗脱液，回收乙醇浓缩干燥得三七叶总皂苷；
（3）在步骤（2）三七叶总皂苷中加入其质量5倍的甲醇，水浴加热溶解，过滤得到三七叶皂苷澄清液，在三七叶皂苷澄清液中加入其质量4倍的丙酮，边加边磁力搅拌，搅拌30min后，置于4℃下冷藏24小时，有白色沉淀析出，过滤取白色沉淀，弃滤液，沉淀中按干燥品计算rb3含量32%，rb2含量30%，人参皂苷fc22%；
（4）在步骤（3）中白色沉淀中加入干燥白色沉淀质量9倍的纯水加热溶解，放冷后再加入溶液质量11%的冰乙酸-hcl溶液，混匀后于水浴70℃加热，加热0.6小时后出现白色沉淀，停止加热，完成反应，其中冰乙酸-hcl溶液是冰乙酸与盐酸按体积比3:1的比例混合制得；
（5）步骤（4）反应结束后，向反应物中加入1.2mol/l的naoh溶液调节ph值到中性，过滤得滤液和沉淀，沉淀反复用90℃热水洗涤3次，洗涤液合并入滤液中；
（6）取步骤（5）滤液，加热到40℃过苯乙烯大孔吸附树脂xad-1600柱脱盐，吸附人参皂苷ck，上柱流出液为盐类，纯净水洗柱子到无盐后，用体积浓度85%的乙醇溶液解析人参皂苷ck，收集洗脱液，旋蒸回收乙醇，浓缩得清膏，清膏波美度为1.3，向清膏中加入其质量1倍的丙酮，搅拌均匀，置于1℃下放置24小时，得白色粉末结晶产物，过滤55℃干燥得人参皂苷ck粗品，含量94.3%；
（7）取人参皂苷ck粗品用二氯甲烷-甲醇溶液（二氯甲烷与甲醇按体积比8:0.1的比例混合制得）超声溶解，300目硅胶用二氯甲烷湿法装柱，溶解液上硅胶柱，上样后以二氯甲烷-甲醇溶液（二氯甲烷与甲醇按体积比8:0.1的比例混合制得）作为洗脱液进行洗脱，收集含人参皂苷ck的洗脱液，减压回收溶剂，浓缩产物冷冻干燥得人参皂苷ck，含量99.2%，以步骤（3）中三七叶总皂苷计算，人参皂苷ck得率25.2%。
实施例3：人参皂苷ck的制备方法步骤如下：
（1）以三七叶为原料，粉碎后采用质量浓度70%的乙醇溶液热回流提取2次，提取温度85℃，每次提取时间1h，过滤，合并提取液，减压浓缩回收有机溶剂，得三七叶粗提物；
（2）将步骤（1）三七叶粗提物经过苯乙烯大孔吸附树脂xad-1600柱吸附三七叶总皂苷，水洗树脂柱到无色，然后用体积浓度75%的乙醇溶液解析三七叶总皂苷，收集洗脱液，回收乙醇浓缩干燥得三七叶总皂苷；
（3）在步骤（2）三七叶总皂苷中加入其质量6倍的正丁醇，水浴加热溶解，过滤得到三七叶皂苷澄清液，在三七叶皂苷澄清液中加入其质量5倍的乙酸乙酯，边加边磁力搅拌，搅拌25min后，置于4℃下冷藏24小时，有白色沉淀析出，过滤取白色沉淀，弃滤液，沉淀中按干燥品计算rb3含量34%，rb2含量34%，人参皂苷fc23%；
（4）在步骤（3）中白色沉淀中加入干燥白色沉淀质量10倍的纯水加热溶解，放冷后再加入溶液质量9%的冰乙酸-hcl溶液，混匀后于水浴80℃加热，加热1.5小时后出现白色沉淀，停止加热，完成反应，其中冰乙酸-hcl溶液是冰乙酸与盐酸按体积比5:1的比例混合制得；
（5）步骤（4）反应结束后，向反应物中加入1.5mol/l的naoh溶液调节ph值到中性，过滤得滤液和沉淀，沉淀反复用100℃热水洗涤3次，洗涤液合并入滤液中；
（6）取步骤（5）滤液，加热到45℃过苯乙烯大孔吸附树脂t-28柱脱盐，吸附人参皂苷ck，上柱流出液为盐类，纯净水洗柱子到无盐后，用体积浓度90%的乙醇溶液解析人参皂苷ck，收集洗脱液，旋蒸回收乙醇，浓缩得清膏，清膏波美度为1.2，向清膏中加入其质量1.5倍的丙酮，搅拌均匀，置于2℃下放置24小时，得白色粉末结晶产物，过滤低温干燥得人参皂苷ck粗品，含量90.2%；
（7）取人参皂苷ck粗品用二氯甲烷-甲醇溶液（二氯甲烷与甲醇按体积比8:0.1的比例混合制得）超声溶解，400目硅胶用二氯甲烷湿法装柱，溶解液上硅胶柱，上样后以二氯甲烷-甲醇溶液（二氯甲烷与甲醇按体积比8:0.1的比例混合制得）作为洗脱液进行洗脱，收集含人参皂苷ck的洗脱液，减压回收溶剂，浓缩产物冷冻干燥得人参皂苷ck，含量98.6%，以步骤（3）中三七叶总皂苷计算，人参皂苷ck得率32.2%。