本发明属于食品、医药和化妆品技术领域，具体涉及一种鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐的制备方法。
背景技术
植物甾醇是一类重要的食品功能因子，具有降胆固醇和抗癌等多种生理功能，但由于其水不溶性和低油溶性，限制了其在食品工业中的应用。鸟氨酸是一种非蛋白氨基酸，存在于蛋白质含量丰富的食物中，是尿素循环的重要中间体之一，能够治疗肝脏疾病，强健心脏，刺激生长激素的释放，改善睡眠，缓解疲劳，增加肌肉量和减少体脂，在食品、医药等领域上应用愈加广泛。
近年对植物甾醇研究主要集中在改善其溶解度方面，如将甾醇与月桂酸、谷氨酸等进行酯化或者制备微胶囊等，但这些方法大多存在能耗高，步骤繁琐，安全性未知等问题，应用受到了较大限制。因此，若能选择一些可安全应用于食品领域的功能性物质与植物甾醇进行温和的一步反应，不但可以改善各自理化性质上的缺陷，提高其生物利用度，而且又可保留各自的功能或者发生协同作用，从而实现改性增效提质。鸟氨酸溶于水，且是食品领域内较好的功能性物质，将鸟苷酸和植物甾醇为原料合成植物甾醇衍生物，不但可以改善各自理化性质上的缺陷，提高其生物利用度，而且又可保留各自的功能或者发生协同作用，实现改性增效提质。
目前还没有关于鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐合成的相关报道，本发明探索出一种鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐的制备方法，提高了甾醇和鸟氨酸的生物利用度，且生产反应条件温和、步骤简单，所得产物纯度达99.37％以上，不需要进一步分离纯化。
技术实现要素：
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有植物甾醇酯盐酸盐的制备方法存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明其中一个目的是，克服现有植物甾醇酯盐酸盐的制备方法的不足，提供一种鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐的制备方法。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐的制备方法，其特征在于：包括，冰浴条件下，将n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸、二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑混合溶解在无水有机溶剂中，活化反应1～2h后，再加入植物甾醇和4-二甲氨基吡啶，升温至25～30℃，搅拌反应4～8h后，经减压旋转蒸发去除有机溶剂后，再经过硅胶柱层析分离纯化得到n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸植物甾醇酯；将n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸植物甾醇酯溶于氯化氢/乙酸乙酯溶液中，25～30℃搅拌反应1～2h，减压旋转蒸发去除有机溶剂得到鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐。
作为本发明所述鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐的制备方法的一种优选方案，其中：所述植物甾醇包括豆甾醇。
作为本发明所述鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐的制备方法的一种优选方案，其中：所述无水有机溶剂包括二氯甲烷。
作为本发明所述鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐的制备方法的一种优选方案，其中：所述植物甾醇与n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸的摩尔比为1：1～1：3。
作为本发明所述鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐的制备方法的一种优选方案，其中：所述n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸、二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1.00：1.00：1.00：0.06～1.00：1.40：1.40：0.14。
作为本发明所述鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐的制备方法的一种优选方案，其中：所述氯化氢/乙酸乙酯的浓度为3.5～4.5mol/l。
作为本发明所述鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐的制备方法的一种优选方案，其中：所述硅胶柱层析流动相包括石油醚、乙酸乙酯、甲酸的混合物。
本发明的有益效果：
(1)本发明合成了一种植物甾醇衍生物，改善了甾醇的溶解度，提高了甾醇和鸟氨酸的生物利用度，极大地拓宽了植物甾醇和鸟氨酸的应用范围；
(2)采用本发明在有机溶剂中利用化学法反应制备植物甾醇酯的方法，可以大大提高酯的转化率，转化率超过89.99％，纯度为99.37％以上，不需要再进行分离纯化；
(3)本发明工艺简单，每一步的反应条件要求低，易实现工业化生产，且生产反应条件温和、步骤简单、所得产物纯度和收率高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为两步法合成n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐图。
图2为n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的hplc图谱。
图3为n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐hplc图谱。
图4为n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的红外光谱图。
图5为n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐的红外光谱图。
图6为n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的质谱图。
图7为n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐的质谱图。
图8为n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的氢谱图。
图9为n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的碳谱图。
图10为n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐的氢谱图。
图11为n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐的碳谱图。
图12为环己基碳二亚胺(dcc)和1-羟基苯并三唑(hobt)催化作用机理图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
产物的鉴定方法：采用傅里叶变换红外光谱、质谱以及核磁共振波谱进行鉴定n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸甾醇酯和鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐的结构。ft-ir分析采用thermoscientificnicoletis10傅里叶变换红外光谱仪，选用kbr压片法，扫描次数：32次，分辨率：4cm-1。质谱分析采用watersuplc-tqd质谱仪，将分离纯化的样品经0.22μm微孔滤膜后进样，离子源为电喷雾(esi)离子源，毛细管电压3.5kv，脱溶剂温度250℃，脱溶剂气流速500l/h，锥孔气流速50l/h，锥孔电压20v，碰撞能量6v，检测器电压1700v，质量范围50～1000m/z。核磁共振波谱分析以四甲基硅烷为内标，1hnmr和13cnmr频率分别为100mhz和400mhz。n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯以氘代氯仿为溶剂，鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐以氘代甲醇为溶剂。
酯化率和产物纯度的计算方法：本发明采用hplc测定鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐的纯度和产率，hplc-elsd分析系统包括waters1525高效液相色谱仪、alltech3300蒸发光散射检测器(elsd)和empower数据处理软件。色谱柱为waterssymmetryc18反相柱(4.6×150mm，5μl)，柱温：45℃，流动相∶甲醇/甲酸(1000/1，v/v)，流速：1ml/min，等速洗脱，进样量：10μl；elsd参数：温度为55℃，载气为氮气，流速为1.5l/min，增益为1。
具体酯化率的计算方法为：将分离纯化的n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯分别配制一系列不同浓度的溶液，利用hplc测定各峰面积，根据样品峰面积的对数值与浓度的对数值的线性关系制作标准曲线。将酯化后的反应液进样后，再根据峰面积计算出反应液中n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的浓度，再根据下列公式即可算出酯化率。
xpse(％)＝cpse/cps×100
式中xpse为n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的酯化率(％)，cpse为n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的浓度(mol/l)，cps为反应开始植物甾醇的浓度(mol/l)。
鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐的纯度(％)＝鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐的峰面积/所有样品的总峰面积×100。
实施例1
称取n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸0.266g、dcc(二环己基碳二亚胺)0.1979g、hobt(1-羟基苯并三唑)0.1979g，量取二氯甲烷2ml，在冰浴条件下混合，活化反应1h之后，转入到125ml的圆底烧瓶中，再加入植物甾醇0.33026g、dmap(4-二甲氨基吡啶)0.0106g、二氯甲烷10ml，升温至25℃后搅拌反应，每间隔2小时取样用薄层层析硅胶板点样检测反应进程，反应6小时，停止搅拌，取出样品经旋转蒸发除去溶剂得到反应产物n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸植物甾醇酯。
在n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸植物甾醇酯中加入一定量的氯化氢/乙酸乙酯溶液，25℃搅拌反应1h，经减压旋转蒸发去除有机溶剂得到鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐纯品，鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐的纯度达99.37％以上。
鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐的鉴定以鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐为例。鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐的反应式如图1所示。在高效液相色谱中，n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的出峰时间为6.840min，鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐的出峰时间为2.944min，如图2、图3所示。
n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的红外光谱如图4所示，分析如下：3362.58cm-1和1514.39cm-1处的强吸收峰分别为-nh-的伸缩振动吸收(νnh)和弯曲振动吸收(δnh)，2958.65cm-1和2869.36cm-1处的强吸收峰为-ch3和-ch2-的伸缩振动吸收(νch)，1455.71cm-1附近的中等强度吸收峰为-ch3和-ch2-的弯曲振动吸收(δch)，1712.18cm-1和1251.44cm-1处的强吸收峰分别为甾醇酯键c＝o(νc＝o)和c-o(νc-o)的伸缩振动吸收，1712.18cm-1和1170.20cm-1处的强吸收峰分别为boc基团中酯键c＝o(νc＝o)和c-o(νc-o)的伸缩振动吸收，1366.80cm-1处的强吸收峰为boc基团中叔丁基-c(ch3)3的弯曲振动吸收(δch)，1251.44cm-1处的强吸收峰为c-n的伸缩振动吸收(νcn)。同豆甾醇的红外光谱比对发现，产物中含有boc基团的吸收峰和酯键的吸收峰，初步判定产物可能为n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯。
鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐的红外光谱如图5所示，分析如下：3374.12cm-1处的强吸收峰和1631.74cm-1处的弱吸收峰分别为nh3+的伸缩振动吸收(νnh)和弯曲振动吸收(δnh)，2933.83cm-1和2864.03cm-1处的强吸收峰为-ch3和-ch2-的伸缩振动吸收(νch)，1491.90cm-1和1454.38cm-1处的中等强度吸收峰为-ch2-和-ch3弯曲振动吸收(δch)，1739.98cm-1和1214.09cm-1处的强吸收峰分别为甾醇酯键c＝o(νc＝o)和c-o(νc-o)的伸缩振动吸收。同n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的红外光谱相比发现，boc基团的吸收峰消失，但存在酯键的吸收峰，同时n-h的弯曲振动吸收峰由1514.39cm-1移至1631.74cm-1，说明存在nh3+，预测产物可能为鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐。
n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的质谱图谱如图6所示，分析如下：豆甾醇的相对分子质量为412.69，n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸的相对分子质量为332.39，因此n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的相对分子质量为727。n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯在es+电离下，可能存在n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的[m+h]+、[m+nh4]+和[m+na]+的分子离子峰，图7中728(727+1)为n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的[m+h]+的质谱信号。因此，产物为n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯。鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐的质谱图谱如图7所示，分析如下：n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸的相对分子质量为727，因此鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐的相对分子质量为600。图7中527(600-25.5-35.5-1-1)为鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐的[m-2cl-2h]+的质谱信号。因此，产物为鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐。
n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的1h谱和13c谱如图8和图9所示，其分析为：1hnmr(400mhz,cdcl3,δ,ppm)：δ＝0.71(3h,s,18-h),0.80(6h,d,26-27-h),0.86(3h,t,29-h),0.94-1.04(6h,m),1.03(3h,s,19-h),1.10-1.30(5h,m),1.45(18h,s,2(ch3)3c-),1.62-1.50(8h,m),1.65-1.73(2h,m),1.86-2.09(5h,m),2.32(2h,d),3.14(2h,t,-ch2nh-),4.13(1h,m,-chco),4.62-4.67(1h,m,3-h),5.06(1h,dd,j＝8.6,15.2hz,22-hor23-h),5.14-5.18(1h,dd,j＝8.5,15.2hz,22-hor23-h),5.38(1h,d,j＝4.6hz,6-h)；13cnmr(100mhz,cdcl3,δ,ppm)：δ＝18.98(29-ch3),19.28(18-ch3),21.02(21-ch3),21.04(19-ch3),21.21(26-or27-ch3),21.07(26-or27-ch3),24.34(ch2),25.38(11-ch2),26.02(15-ch2),27.71(ch2),28.33((ch3)3c-),28.40((ch3)3c-),28.87(ch2),30.27(ch2),31.87(2c,8-and25-ch),36.59(quaternaryc-10),36.93(ch2),38.00(ch2),39.64(ch2),40.28(20-ch),40.44(quaternaryc-13),42.22(-ch2co),50.07(9-ch),51.24(24-ch),55.98(17-ch),56.80(14-ch),75.15(3-ch),79.37((ch3)3c-),79.81((ch3)3c-),122.93(6-ch),129.34(22-ch),138.26(23-ch),139.30(quaternaryc-5),155.36(conh)，155.99(conh),171.92(ch2c＝o)。
在n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的1h谱中，化学位移为5.56、5.14-5.18、5.53均为豆甾醇部分的h，化学位移为1.45为鸟氨酸保护基团上(ch3)3c-部分的h；在其13c谱中，化学位移为122.93、129.34、138.26、139.30均为豆甾醇部分的c，化学位移为28.33、28.40、79.37、79.81为鸟氨酸保护基团上(ch3)3c-部分的c。因此，通过核磁共振波谱可得，该产物是n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯。
鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐的1h谱和13c谱如图10和图11所示，其分析为：1hnmr(400mhz,cd3od,δ,ppm)：δ＝0.75(3h,s,18-h),0.83(6h,d,j＝8.0hz,26-27-h),0.87(3h,t,j＝6.0hz,29-h),1.08(3h,s,19-h),0.96-1.08(6h,m),1.18-1.35(5h,m),1.40-1.61(8h,m),1.69-1.78(2h,m),1.92-2.05(4h,m),2.06(2h,m,j＝8.0hz),2.44(2h,m,j＝8.0hz),3.05(2h,t,-ch2nh-),3.40(h,t,-chco),4.70-4.78(1h,m,3-h),5.04(1h,dd,j＝8.0,16.0hz,22-hor23-h),5.18(1h,dd,j＝8.0,16.0hz,22-hor23-h),5.45(1h,d,j＝8.0hz,6-h)；13cnmr(100mhz,cdcl3,δ,ppm)：δ＝11.12(29-ch3),11.24(18-ch3),18.08(21-ch3),18.31(19-ch3),20.11(26-or27-ch3),20.36(26-or27-ch3),20.74(ch2),23.12(ch2),23.91(11-ch2),25.10(ch2),27.28(15-ch2),28.72(ch2),31.60(ch2),31.80(2c,8-and25-ch),36.37(quaternaryc-10),36.71(ch2),37.53(ch2),38.68(ch2),39.55(ch2),40.44(20-ch),41.99(quaternaryc-13),50.20(9-ch),51.39(24-ch),52.15(-ch2co),55.99(17-ch),56.78(14-ch),76.82(3-ch),122.89(6-ch),129.31(22-ch),138.29(23-ch),139.09(quaternaryc-5),168.10(c＝o)。
在鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐的1h谱13c谱与n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯对比可得，鸟氨酸部分和豆甾醇部分的化学位移均存在，但是鸟氨酸保护基团上(ch3)3c-部分不存在，说明保护基团被去掉。因此，通过核磁共振波谱可得，该产物是鸟氨酸豆甾醇酯盐酸盐。
实施例2
选取无水硫酸氢钠、对甲苯磺酸、dmap/dcc、dmap/dcc/tsoh、dmap/edc/et3n、dmap/dcc/hobt催化合成n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸植物甾醇酯，植物甾醇的浓度为0.1mmol/ml，n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸与植物甾醇摩尔比为1.0：1.0，复合溶剂dmf/thf(55/45，v/v)为反应溶剂，室温下反应5h。不同催化剂催化合成n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的酯化率如表1所示。
表1不同催化剂催化合成n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸豆甾醇酯的酯化率
从表1可以看出，在这几种催化剂中，dmap/dcc、dmap/edc/et3n和dmap/dcc/hobt的催化效率较好，相应的酯化率分别是34.73％、21.09％、39.42％。不难得出：复合催化剂的催化效果远高于使用单一催化剂，在复合催化剂中，dmap/dcc与dmap/dcc/hobt的催化效果最好。
复合催化剂dcc/hobt/dmap具有协同增效作用，hobt和dcc的作用机理如图12所示，可以看出，hobt与dcc与在合成酰胺中起到抑制外消旋作用。dcc与n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸合成的o-酰基脲中间体过于活泼，能够经分子内环合生成另一环状中间体并通过稀醇互变而导致消旋，加入hobt能够将活泼的o-酰基脲中间体转化成另一较为稳定的中间体，从而防止消旋化。dmap是一种超强的亲核的酰化作用催化剂，酸酐中间体在dmap的作用下生成n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸植物甾醇酯。
实施例3
在实施案例1的基础上，将除了催化剂添加顺序之外的其他反应条件不变，分别进行分批投料和同时投料实验。
分批投料方式为：首先加入n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸、dcc、hobt与二氯甲烷，在冰浴下混合反应，活化1h之后，转入到125ml的锥形瓶中，再加入植物甾醇、dmap、二氯甲烷，在室温下搅拌反应；
同时投料方式为：将n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸、dcc、hobt、植物甾醇、dmap、二氯甲烷同时加入到125ml的锥形瓶中，在冰浴下混合反应，活化1h之后，在室温下搅拌反应。当反应达到6小时的时候，进行采样检测，计算酯化率。
结果表明，同时投料的酯化率达到63.47％，而分批投料的酯化率为72.45％。因此，分批投料能够明显提高反应的酯化率。
实施例4
在实施案例1的基础上，将反应温度设置为变量，其他反应条件不变，分别控制反应温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，当反应达到6小时的时候，进行采样检测，计算酯化率，考查反应温度对酯化率的影响，不同温度的酯化率如表2所示。
可以看出，当反应温度达到25℃的时候，酯化率达到最高，因此在制备n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸植物甾醇酯过程中，选择温度25～30℃。
表2反应温度对合成终产物的影响
实施例5
在实施案例1的基础上，将反应时间设置为变量，其他反应条件不变，分别在反应时间到4、5、6、7、8h进行采样检测，计算酯化率，考查反应时间对酯化率的影响，不同时间的酯化率如表3所示。可以看出，反应时间达6h的时候，酯化率达最高，因此在制备n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸植物甾醇酯过程中，反应时间选6h。
表3反应时间对合成终产物的影响
实施例6
在实施案例1的基础上，将dcc与hobt用量设置为变量，其他反应条件不变，dcc：hobt：n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸的摩尔比值分别设置为1.0：1.0：1.0、1.1：1.1：1.0、1.2：1.2：1.0、1.3：1.3：1.0、1.4：1.4：1.0、1.5：1.5：1.0，待反应结束后进行采样检测，计算酯化率，同催化剂添加量的酯化率如表4所示。
当dcc：hobt：n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸的摩尔比值为1.2：1.2：1.0时，酯化率达到最高。
表4dcc与hobt用量对合成终产物的影响
实施例7
在实施案例1的基础上，将dmap用量设置为变量，其他反应条件不变，dmap：n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸的摩尔比值分别设置为0.6：1.0、0.8：1.0、0.1：1.0、0.12：1.0、0.14：1.0，待反应结束后进行采样检测，计算酯化率。不同催化剂添加量的酯化率如表5所示。可以看出，当dmap：n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸的摩尔比值的添加量设置0.8：1.0时，酯化率达到最高。
表5dmap用量对合成终产物的影响
实施例8
在实施案例1的基础上，将底物摩尔比设置为变量，其他反应条件不变，分别在将n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸：植物甾醇的摩尔比值分别设置为1.0：1.0、1.5：1.0、2.0：1.0、2.5：1.0、3.0：1.0，待反映结束后进行采样检测，计算酯化率。不同底物摩尔比的酯化率如表6所示。
结果表明n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸：植物甾醇的摩尔比值为1.5：1.0的酯化率最高。
表6底物摩尔比对合成终产物的影响
实施例9
薄层色谱层析与硅胶柱层析的分离原理相似，所以可通过薄层色谱探索适合硅胶柱层析分离n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸植物甾醇酯的洗脱溶剂为：石油醚/乙酸乙酯/甲酸(v/v/v)：13/7/0.02。本发明使用硅胶柱层析的方法分离纯化n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸植物甾醇酯，将4g样品溶于20ml洗脱溶剂，上样，用洗脱剂洗脱硅胶柱，用自动收集器收集洗脱液，8min/管，并用薄层色谱分析跟踪洗脱产物，将比移值(rf)一致的产物合并收集，经旋转蒸发去掉溶剂后为n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸植物甾醇酯。
硅胶柱的制备：将320g100-200目柱层析硅胶g放入烧杯，加入一定洗脱溶剂，充分搅匀，呈匀浆状态，室温下浸泡3h。将充分浸泡的硅胶g缓缓装入扩口层析柱(2.5cm×100cm)，避免气泡出现，待硅胶充分沉降后，静置一晚，待用。
纯化过程：将4g样品溶于20ml洗脱溶剂，上样，用洗脱剂洗脱硅胶柱，用自动收集器收集洗脱液，8min/管，并用薄层色谱分析跟踪洗脱产物，不同物质的被洗脱出来的先后次序不同，实验前后共收集了60管，各组分分布如下表7所示。将比移值(rf)一致的产物合并收集，经旋转蒸发去掉溶剂后为n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸植物甾醇酯。
表7硅胶柱层析分离n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸植物甾醇酯的分布情况
鸟氨酸是一种非蛋白氨基酸，存在于蛋白质含量丰富的食物中，是尿素循环的重要中间体之一，能够治疗肝脏疾病，强健心脏，刺激生长激素的释放，改善睡眠，缓解疲劳，增加肌肉量和减少体脂，在食品、医药等领域上应用愈加广泛。且鸟氨酸溶于水，是食品领域内较好的功能性物质，本发明将鸟苷酸和植物甾醇为原料合成植物甾醇衍生物，制得的鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐经人体吸收可分解为游离的植物甾醇和鸟氨酸，可以改善各自理化性质上的缺陷，提高其生物利用度，在保留各自的功能或者发生协同作用的同时，实现改性增效提质，并对人体不会产生副作用。鸟氨酸植物甾醇酯盐酸盐能够增加植物甾醇和鸟氨酸溶解度，提高生物利用率，可以更加方便的加入到各种体系的食品中且不影响食品本身的质构和风味，水溶性和油溶性好，功能性显著并益于人体吸收。
本发明通过实验筛选出环己基碳二亚胺(dcc)、1-羟基苯并三唑(hobt)、4-二甲氨基吡啶(dmap)作为反应的催化剂。在催化反应中，dcc与n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸合成的o-酰基脲中间体过于活泼，能够经分子内环合生成另一环状中间体并通过稀醇互变而导致消旋，而加入hobt能够将活泼的o-酰基脲中间体转化成另一较为稳定的中间体，从而防止消旋化。dmap是一种超强的亲核的酰化作用催化剂，酸酐中间体在dmap的作用下生成n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸植物甾醇酯。整个反应催化过程催化剂dcc/hobt/dmap具有协同增效作用，能有效提高催化效率。
在确定催化剂的条件下，本发明还对反应温度、反应时间、dcc与hobt用量、dmap用量、n-叔丁氧羰基-n'-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸：植物甾醇的摩尔比、投料方式、n-叔丁氧羰基-n′-叔丁氧羰基-l-鸟氨酸植物甾醇酯的纯化进行了实验探究，确定了本发明最佳的反应条件。
综上所述，本发明以将鸟苷酸和植物甾醇为原料合成植物甾醇衍生物，通过筛选出环己基碳二亚胺(dcc)、1-羟基苯并三唑(hobt)、4-二甲氨基吡啶(dmap)作为反应的最佳的催化剂，提高催化效率，在此基础上，通过实验探究确定最佳的最佳的反应条件。在改善了甾醇的溶解度，提高了甾醇和鸟氨酸的生物利用度，大大提高酯的转化率的同时，生产反应条件温和、步骤简单，反应条件要求低，易实现工业化生产，且产物纯度高。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。