一种南极磷虾中虾青素双酯参考物质的制备方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种南极磷虾中虾青素双酯参考物质的制备方法。

背景技术：

虾青素，化学名称：3,3'-二羟基-4,4'-二酮基-β,β'-胡萝卜素，英文名称：astaxanthin，cas：7542-45-2，分子式：c40h52o4，相对分子质量为596.86da，是一种类胡萝卜素衍生物，是目前已知的抗氧化性最强的天然抗氧化剂之一，具有抗氧化等多种生物活性，在化妆品、保健品和医药工业中具有广泛的应用前景。

南极磷虾是虾青素的重要生物来源，超过90％以虾青素酯的形式存在，脂肪酸的羧基可以和虾青素共轭双键末端的羟基结合形成酯，根据结合的脂肪酸的数量，可以分为虾青素单酯和虾青素双酯。相关研究表明南极磷虾中虾青素单酯占25％～35％，双酯占55％～64％。南极磷虾油作为新资源食品，急需制备参考物质对虾青素酯的组成和含量进行准确测定。目前我国缺少南极磷虾中虾青素双酯参考物质的制备方法，无法对虾青素双酯的组成和含量进行准确测定。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种南极磷虾中虾青素双酯参考物质的制备方法。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

1)取冰冻南极磷虾冻干后磨粉，获得含有天然虾青素的南极磷虾粉原料；(该步骤可以确保磷虾中虾青素酯的组成不变)

2)按照南极磷虾粉原料和水1:5的料液比，采用冷丙酮超声波提取20分钟，抽滤过膜后，减压浓缩，在浓缩后的样品中加入3倍体积的异丙醇溶解，然后加入等体积的蒸馏水，混匀后，放入-20℃冰柜中静置过夜，取上层溶液，减压浓缩后，用少量石油醚溶解，待净化；(该步骤可以去除水溶性脂质干扰)

3)称取200～300目的硅胶，120℃活化4h，冷却至室温后在石油醚中浸泡过夜，采用湿法装柱，层析柱规格5cm×60cm，硅胶用量为上样量的30倍，层析柱用石油醚冲洗1h，待硅胶柱高度不变后，将待净化的样品倒入，先用一半柱体积的石油醚淋洗，然后用一倍柱体积的2％丙酮-石油醚淋洗，最后用5％丙酮-石油醚淋洗，收集第一条红色色带，浓缩一半体积后，放置于-20℃冰柜中静置过夜，收集上清液浓缩后冻干，即得虾青素双酯；(该步骤可以纯化虾青素酯，去除甘油三酯和游离脂肪酸等杂质的干扰)

4)准确称取少量上述冻干后的虾青素双酯，采用丙酮溶解后定容，采用液相色谱法，低温皂化过夜，将虾青素双酯全部转化为游离态虾青素后，计算总虾青素含量；(该步骤用于总虾青素的含量测定)

5)采用正相液相色谱，利用手性色谱柱确定虾青素的立体结构组成；(该步骤用于虾青素立体结构的组成分析)

6)采用液相色谱-串联质谱/高分辨质谱(lc-hrms)技术，解析虾青素双酯的脂肪酸结构，鉴定了17种虾青素双酯，测定每种虾青素酯的质量百分含量，得到虾青素双酯参考物质的纯度定值。(该步骤用于虾青素双酯组成和定量测定)

本发明解决的问题：发明了制备南极磷虾中虾青素双酯参考物质的方法，并对虾青素双酯的结构、组成和含量进行了确定，本发明有益效果是能作为参考物质用于海洋资源中活性物质的检测，为在保健食品、医药和饲料等领域的应用提供技术支持与物质保证。

附图说明

图1是液相色谱法测定总虾青素含量示意图；

图2是正相液相色谱测定虾青素光学异构体的组成谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明用溶剂分级和硅胶柱层析提取纯化步骤，通过高分辨质谱结构定性定量，获得高纯度的虾青素双酯混合标准物质。

一、参考物质的制备

1、原料

南极磷虾购自辽宁省大连海洋渔业集团公司，运输到实验室后于-80℃保存，取出10kg冰冻磷虾经过冷冻干燥后，置于磨粉机中磨粉，密封后放置于-20℃下保存。

2、纯化过程

按照1:5的料液比，采用冷丙酮超声波提取20分钟，抽滤过膜后，减压浓缩，在浓缩后的样品中加入3倍体积的异丙醇溶解，然后加入等体积的蒸馏水，混匀后，放入-20℃冰柜中静置过夜，取上层溶液，减压浓缩后，用少量石油醚溶解，待净化；称取200～300目的硅胶，120℃活化4h，冷却至室温后在石油醚中浸泡过夜，采用湿法装柱，层析柱规格5cm×60cm，硅胶用量为上样量的30倍，层析柱用石油醚冲洗1h，待硅胶柱高度不变后，将待净化的样品倒入，先用一半柱体积的石油醚淋洗，然后用一倍柱体积的2％丙酮-石油醚淋洗，最后用5％丙酮-石油醚淋洗，收集第一条红色色带，浓缩一半体积后，放置于-20℃冰柜中静置过夜，收集上清液浓缩后冻干，称重充氮密封冷藏保存备用。

二、参考物质组成、含量的测定

1、总虾青素含量测定：

将虾青素双酯溶于丙酮溶剂中，配成1mg/ml的溶液。稀释100倍后移取2ml于离心管中，加入适量0.02mol/lnaoh甲醇溶液4℃条件下反应过夜，然后在试样溶液中加入0.6mol/l磷酸甲醇溶液中和剩余的碱，最后加入n-丙基乙二胺(psa)填料净化，涡旋静置后过微孔滤膜，液相色谱法测定总虾青素含量，谱图见图1。

色谱条件：c30色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相a：甲醇溶液，流动相b：叔丁基甲醚，流动相c：1％磷酸溶液；洗脱流速为1ml/min；柱温：25℃；进样量：20μl。线性梯度洗脱条件：0min～15min，b由15％上升到30％、c为4％；15min～23min，b由30％上升到80％、c为4％；23min～27min，b为80％、c为4％；27min～30min，b由80％上升到15％、c为4％；30min～35min，b为15％、c为4％。实验以全反式虾青素标准进行定量，但皂化过程中会有一部分全反式虾青素转化为13-顺虾青素和9-顺虾青素，具体计算公式如下：

总虾青素含量＝1.3×13-顺式虾青素+全反式虾青素+1.1×9-顺式虾青素。

2、光学异构体鉴定

将上述皂化后的溶液，采用正相液相色谱测定虾青素光学异构体的组成，谱图见图2，3s,3′s、3s,3′r及3r,3′r的比例为7:20:73。

色谱条件：chiralpakic手性柱(250mm×4.6mm，5μm)；以甲基叔丁基醚-甲醇(50:50，v/v)为流动相，采用等度洗脱，洗脱流速为1ml/min；柱温：25℃；进样量：20μl。

3、虾青素双酯的组成和含量测定

配置浓度为10μg/ml的虾青素双酯溶液，采用lc-hrms技术对虾青素双酯的组成和含量进行测定，制备的参考物质中含有17种虾青素双酯，其分子式和含量见表1。

表1

色谱条件为：c30色谱柱(250mm×2.1mm，3.0μm)；流动相a：90％异丙醇乙腈溶液+10mm甲酸铵+0.1％甲酸；流动相b:60％乙腈水溶液。洗脱流速为300μl/min，柱温：45℃，进样量：2μl。质谱条件为：采用hplc-esi-ms/ms技术电喷雾电离离子源，采用正离子模式，碰撞能量12～20v；采用正离子模式，在m/z300～1400范围内扫描。

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。