一种酿酒用海洋产酸菌株及其应用的制作方法

本发明属于白酒酿造菌株筛选技术领域，具体涉及一种酿酒用海洋产酸菌株及其应用。

背景技术

在白酒的传统酿造工艺中，一直有“老窖出好酒”的说法，是因为在作为发酵场所的窖池中，存在着常年驯化富集的窖泥，窖泥中富含各类厌氧微生物，其代谢产生的各种有机酸与乙醇可以生成脂肪酸酯，成为白酒的主体香型成分。优质白酒中酯含量可以达到0.6％左右，主要为乙酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯等。窖泥中微生物的产酸能力决定了产酯能力，继而影响白酒的质量。随着白酒产业规模的扩大，窖池数量也在不断增加，但窖池中的优质窖泥制备方法相对落后，获得的原酒质量参差不齐，难以稳定，成了限制白酒产业发展的瓶颈。传统白酒酿造的优质窖泥主要来源于老窖，不仅资源稀缺，人工不断的传代也容易引起菌系比例改变，产酸能力退化，需要不断在窖泥中添加外源产酸菌剂，用于提高酿酒窖泥品质的菌剂的核心成分为产己酸的厌氧菌。目前各白酒企业使用的己酸菌剂大都来源于老窖窖泥自身筛选富集，来源较为单一，菌株常年生长过程中，适应已有老窖窖池环境，接种至新窖池后，表现出对温度、酸度、溶氧耐受性差，产酸低，影响白酒主体香味。因此如何获得生命力旺盛、产酸能力高的新型微生物菌剂，提升白酒品质，是酿酒行业急需解决的问题之一。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种酿酒用海洋产酸菌株及其应用，所述的微生物来源于海洋底泥，该微生物产酸能力强，不易退化，在白酒酿造过程中应用，能有效增加酿造白酒的风味。

本发明所提供的菌株，为梭菌(clostridiumsp.)sb2株，于2018年9月14日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2018621。

本发明所提供的梭菌clostridiumsp.sb2株在白酒酿造中的应用；

本发明再一个方面提供一种人工窖泥，是使用上述的梭菌clostridiumsp.sb2株制备的；

所述的人工窖泥，其一种制备方法如下：

1)将梭菌clostridiumsp.sb2株用培养基进行发酵扩大培养获得发酵液；

所述的培养基为强化梭菌培养基(rcm)；

2)取发酵窖池池壁窖泥和池底窖泥，按体积比2:1的比例混合均匀制成混合窖泥，然后按照质量比3:3:1的比例将黄水、步骤1)中制成的发酵液、混合窖泥混合制成悬液；

3)把混合窖泥、黄泥按照2:1比例混合均匀制成窖泥混合物，然后加入窖泥混合物体积2％的酒精、再加入混合物重量2％的酒精、0.3％的乙酸钠、2％的中温大曲粉、5％的酒糟、0.03％的糖化酶、0.02％的干酵母混匀制成混合物；

4)将步骤2)获得的悬液加入到步骤3)的混合物中，控制含水量在50％左右在30-35℃密封发酵培养20天，制得种子窖泥；

5)把黄泥、种子窖泥按照2:1比例混合均匀，加入2％的酒精、0.3％的乙酸钠、2％的中温大曲粉、5％的酒糟、0.03％的糖化酶、0.02％的干酵母制成混合物；

6)将步骤2)获得的悬液加入到步骤5)的混合物中，控制含水量在50％左右，在30-35℃密封发酵培养20天，制得人工窖泥。

其中，步骤1中强化梭菌培养基(rcm)配方如下：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏3g，葡萄糖5g、可溶性淀粉1g，氯化钠5g，醋酸钠3g，半胱胺酸盐酸盐0.5g，去离子水1000ml，高温灭菌后制成。

其中，步骤1)中发酵温度为32-35℃，厌氧培养10天。

本发明所提供的菌株的产酸能力强，生长旺盛，对环境适应性强，传代过程中产酸性能稳定，窖泥不易老化。将海洋己酸菌作为主要微生物菌剂，添加于人工窖泥中，提高了初始微生物含量。在窖泥制备过程中，除了黄水、大曲粉之外，还配合加入了酒精、乙酸钠、酒糟、糖化酶、干酵母，增加了营养源，缩短了制备时间。

附图说明

图1：菌株clostridiumsp.sb2的产酸气相图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：海洋己酸菌株的筛选

对黄海、马里亚纳海沟等区域的海洋底泥样品进行采集，将采集的样品放入到无菌样品袋中，-80℃保存。

取海洋底泥样品加入到无菌水中，混合均匀获得悬浮液；将悬浮液接种到50ml的rcm液体培养基中，厌氧培养30℃富集20d。将富集培养液在80℃热激15分钟，杀死微生物营养体，富集芽孢，继续接种至50ml的rcm液体培养基中，厌氧培养30℃富集15d。连续富集三次后，进行梯度系列稀释，吸取10^-4—10^-7稀释度的悬菌液100μl涂布在rcm培养基平板上，每个稀释度涂布两个平板。接种的平板置于密封厌氧袋内，30℃培养10-15d。对出现的单个菌落进行液体转接并保存。

其中使用的强化梭菌液体培养基(reinforcedclostridiummedium,rcm)的配方如下：

蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏3g，葡萄糖5g、可溶性淀粉1g，氯化钠5g，醋酸钠3g，半胱胺酸盐酸盐0.5g，去离子水1000ml，高温灭菌后制成。

rcm固体平板培养基是在rcm液体培养基中添加2％的琼脂。

三轮热处理富集后，共获得单菌落279个，经过产酸初步筛选，对获得的具有较高产酸能力的17株菌进行二次定向筛选。

筛选方法：将分离得到的菌株转接至筛选液体培养基，筛选液体培养基配方如下：乙酸钠5g，酵母膏1g，磷酸氢二钾0.4g，硫酸镁0.2g，硫酸铵0.5g，碳酸钙10g，去离子水1000ml，ph调整为7，高温灭菌后制成，使用前需要加入乙醇作为碳源。乙醇添加量分别为2％、5％和10％，35℃培养10天后，比较在不同乙醇浓度下，各个菌株产酸能力的稳定性。

检测结果如下表1.

表1：不同菌株在不同乙醇浓度下产酸能力比较

nd：低于检测限。

经过筛选，最终获得了一株产酸量高的菌株sb2。经过气相色谱定量分析，其最大产酸量可以达到856mg/100ml。即使在较高乙醇浓度(10％)条件下，其产酸量也可以达到234mg/100ml，对环境的适应性强于一般菌株，图1为菌株sb2的产酸气相图。

sb2菌株形态特征：菌落圆形，乳白色，光滑粘稠容易挑取，边缘整齐。显微镜下细胞呈杆状，芽孢椭圆形，顶端生，芽孢囊膨大呈棒槌状，革兰氏染色阴性，淀粉粒阳性，周生鞭毛。

生理生化特性如下：厌氧，兼性，能发酵乙醇和乙酸盐产生乙酸，不利用果糖、核糖及纤维二糖，不分解淀粉，不能分解明胶，不能凝固和胨化牛奶，vp及甲基红阴性，不产吲哚，硫化氢试验阳性，硝酸盐试验阴性。

根据以上生理生化特征，对照伯杰氏细菌鉴定手册检索，归类为梭菌属(clostridiumsp.)的菌株，命名为梭菌(clostridiumsp.)sb2株，于2018年9月14日保藏在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccm2018621。

实施例2：制备人工窖泥

1、菌株clostridiumsp.sb2在100l发酵罐中在强化梭菌培养基(rcm)中接种发酵，使用的培养基配方为蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，酵母膏3g/l，葡萄糖5g/l、可溶性淀粉1g/l，氯化钠5g/l，醋酸钠3g/l，半胱胺酸盐酸盐0.5g/l，115℃灭菌30min。发酵罐装液量60l，接种量15％，温度30-35℃，厌氧发酵12天，得到海洋己酸菌发酵液。

2、取正常发酵窖池池壁窖泥700kg和池底窖泥350kg，混合均匀制成混合窖泥，取60kg黄水、60kg海洋己酸菌液、20kg混合窖泥混合，制成悬液。

3、把混合窖泥200kg、黄泥100kg混合均匀，然后加入6kg酒精、0.9kg乙酸钠、6kg的中温大曲粉、15kg的酒糟、0.09kg的糖化酶、0.06kg的干酵母混匀，含水量大约23％

4、将步骤2获得的悬液加入到步骤3的混合物中，一边加，一边混合，控制含水量在50％左右，在30-35℃密封发酵培养20天，制得种子窖泥约500kg。

5、在种子窖泥中加入黄泥1000kg，混合均匀，加入20kg的酒精、3kg的乙酸钠、20kg的中温大曲粉、50kg的酒糟、0.3kg的糖化酶、0.2kg的干酵母。

6、将步骤2获得的悬液加入到步骤5的混合物中，控制含水量在50％左右，在30-35℃密封发酵培养20天，制得人工窖泥1500kg。

采用海洋梭菌制备人工窖泥，与传统方法制备的窖泥窖池相比，对所产酒的几种主体香味进行检测分析，结果如下表2。

表2：主体香味物质含量mg/ml

上述结果表明己酸、己酸乙酯和乙酸乙酯含量都高于传统方法。总酯量可达10.15mg/ml，且主要由己酸乙酯构成，约占1/3，因此更加喷香浓郁。