一种鼠李糖乳杆菌JYLR-005及其降血糖制品和应用的制作方法

本发明涉及益生菌及其应用
技术领域：
，特别是涉及一种鼠李糖乳杆菌jylr-005及其降血糖制品和应用。
背景技术：
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。目前主要有以下几种治疗方式：西药治疗：主要是胰岛素和口服降糖药，大致分为磺脲类、双胍类、中药制剂、其他降糖药及辅助用药类，以控制血糖升高，减轻糖尿病的症状，延缓糖尿病进一步恶化及并发症的出现。但长期服用这类药物，会有强烈的副作用。中药治疗：中医药治疗糖尿病，与治疗其他疾病一样，其特点是重视患者的个体差异性和复方的使用。中医药治疗糖尿病不仅在于降低血糖，更重要的是注重防治糖尿病并发症，起到提高生活质量和延长寿命的作用。但降糖中药分类比较复杂，传统中药方剂的抓取、存放、煎煮都比较麻烦。饮食运动治疗：该治疗方法简便，无副作用，但只能对血糖高的病症进行辅助治疗，作用效果有限，并不能单方面实现痊愈。降糖益生菌固体饮料：市面上的降糖益生菌固体饮料，主要以益生菌与益生元复配制得，大多数益生元的长期使用对肠道菌群有正向作用。但产品中的益生菌只对短期的使用效果进行评估，并未对患者进行长期跟踪观察。乳酸菌的服用量和服用时间并没有进行详细的临床实验，菌粉用量和服用时间参差不齐。益生菌发酵中草药的降糖产品：主要是通过益生菌发酵中草药，实现中药中有效成分的释放。但有效成分的释放可能会伴有不良成分的产生，在治愈病症的同时，对身体其他部位造成安全隐患。因此，一种能够安全解决高血糖人群的降糖问题，避免用药对身体造成不适症状的降血糖制品，是本发明要解决的技术问题。技术实现要素：本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一种鼠李糖乳杆菌jylr-005及其降血糖制品和应用。本发明主要解决高血糖人群的降糖问题，避免用药对身体造成不适症状，降低了高血糖病症复发的风险。利用保藏菌株鼠李糖乳杆菌jylr-005，制成内服产品使用。该菌种有较强的胃肠道存活率和肠道定植能力，能够影响肠道中多种短链脂肪酸的产生，抑制α-淀粉酶的活性。本发明的一种鼠李糖乳杆菌jylr-005及其降血糖制品和应用技术方案为，鼠李糖乳杆菌jylr-005，其分类命名为鼠李糖乳杆菌lactobacillusrhamnosus，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为:cgmccno.16103，保藏日期为2018年7月12日，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101。所述的鼠李糖乳杆菌jylr-005在制备降血糖制品方面的应用。一种降血糖制品，含有鼠李糖乳杆菌jylr-005菌粉。所述的降血糖制品中含有鼠李糖乳杆菌jylr-005有效菌50-1000亿/g。所述的降血糖制品中含有鼠李糖乳杆菌jylr-005有效菌150亿/g。所述鼠李糖乳杆菌jylr-005菌粉是将鼠李糖乳杆菌jylr-005发酵得到菌液，菌液经过离心，真空冷冻干燥，得到菌粉。发酵培养基为mrs培养基：蛋白胨10g，牛肉粉5g，酵母粉4g，k2hpo4·7h2o2g，柠檬酸三铵2g，醋酸钠·3h2o5g，葡萄糖20g，吐温801.0ml，mgso4·7h2o0.2g，mnso4·4h2o0.05g，蒸馏水1000ml。发酵培养条件：活化好的鼠李糖乳杆菌jylr-005按1％接种量，37℃培养12～14h。将鼠李糖乳杆菌jylr-005菌粉与低聚异麦芽糖混合复配制得降血糖制品。本发明的有益效果为：本发明菌种有较强的胃肠道存活率和肠道定植能力，能够影响肠道中多种短链脂肪酸的产生，抑制α-淀粉酶的活性，能够缓解高血糖症状，并停用一定时间后无复发迹象。利用保藏菌株鼠李糖乳杆菌jylr-005，制成内服产品使用主要解决高血糖人群的降糖问题，避免用药对身体造成不适症状，降低了高血糖病症复发的风险。避免使用药物造成的负面影响。优化了服用时间和服用量，减少了菌粉使用过量和使用不当造成的浪费和对身体的不良影响，降低了生产成本和销售成本。附图说明：图1所示为实施例2中对菌株cicc22700、atcc8014、atcc39392、cicc6236以及本发明菌株进行模拟胃肠消化液的存活率实验，存活率对照图；图2所示为实施例3中不同菌株对caco-2的粘附率对照图；图3所示为实施例4中正常组(n)，糖尿病组(dc)，药物组(p)，益生菌组(jylr-005)中短链脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)的含量图；图4所示为实施例5中不同菌株对α-淀粉酶抑制率图；图5所示为乳酸菌对空腹血糖和餐后血糖的影响图；图6所示为乳酸菌停用后血糖的变化情况图；图7所示为不同乳酸菌用量对空腹血糖的影响图。具体实施方式：为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。实施例11、采集无高血糖家族史的健康青壮年粪便，分离乳酸菌菌株①菌种来源：无高血糖家族史的健康青壮年粪便②平板培养基：蛋白胨10g牛肉粉5g酵母粉4gk2hpo4·7h2o2g柠檬酸三铵2g醋酸钠·3h2o5g葡萄糖20g吐温801mlmgso4·7h2o0.2gmnso4·4h2o0.05g琼脂15g蒸馏水1000ml③菌株的分离广西省巴马县对无血糖家族史的青壮年粪便进行采样，用粪便取样器对样品进行取样，取样过程戴手套消毒操作，避免接触样品以防污染。取出后立即冷藏盒保存，并编号记录。对样品液体做十倍梯度稀释，每个梯度取100μl均匀涂布于mrs固体平板培养基上，随后取出置于厌氧罐中，37℃厌氧培养过夜。次日可见平板上长有形态大小各异的菌落，挑取若干乳酸菌的特征菌落(乳酸菌菌落特征：圆形凸起，表面光滑，乳白色，边缘界限明显，直径0.5-1mm)作二代划线纯化处理，平板厌氧活化1天，得培养物，得到的培养物命名为乳杆菌jylr-005，随后做菌株鉴定。2、16srrna鉴定分离的乳酸菌16srrna扩增引物使用的是27f：5'-agagtttgatcmtggctcag-3'和1492r：5'-ggttaccttgttacgactt-3'。产物委托有资质的第三方实验室进行sanger测序。应用blast算法在genbank数据库中把序列sequencejylr-005和16srrna基因进行比较，应用mega4.0程序建立邻接树。blast分析，表明jylr-005十分接近鼠李糖乳杆菌(99％亲缘)sequencejylr-005：cttcgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgtaggcgagttgcagcctacagtccgaactgagaatggctttaagagattagcttgacctcgcggtctcgcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttactagagtgcccaactaaatgctggcaactagtcataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcattttgcccccgaaggggaaacctgatctctcaggtgatcaaaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcggcactgaagggcggaaaccctccaacacctagcattcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctacccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgcttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgcgcttcctcggttaagccgagggctttcacatcagacttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttggataccgtcacgccgacaacagttactctgccgaccattcttctccaacaacagagttttacgacccgaaagccttcttcactcacgcggcgttgctccatcagacttgcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgatcaacctctcagttcggctacgtatcatcgccttggtgagccattacctcaccaactagctaatacgccgcgggtccatccaaaagcgatagcttacgccatctttcagccaagaaccatgcggttcttggatctatgcggtattagcatctgtttccaaatgttatcccccacttaagggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccactcgttccatgttgaatctcggtgcaagcaccgatcatcaacgagacactcgtcgactgca2018年7月12日将乳杆菌jylr-005做菌种保藏，其分类命名为鼠李糖乳杆菌lactobacillusrhamnosus，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为:cgmccno.16103，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101。实施例2菌株通过模拟胃肠消化液的存活率模拟胃液的配制：取9.5％盐酸16.4ml，加蒸馏水稀释，使ph值达到2.0，按照每100ml加入1.0g胃蛋白酶，混匀，0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。取jylr-005菌株的100亿/g菌粉1g，转移到预热的装有9ml模拟胃液试管中，37℃80r/min处理1h、2h、3h。对样品溶液进行梯度稀释，倾注法活菌计数，每个处理3个重复。模拟肠液的配制：取kh2po46.8g，加入500ml蒸馏水溶解，用4g/lnaoh溶液调ph至6.8，蒸馏水定容至1l，加胆盐0.3％，按照100ml加1g胰蛋白酶，混匀，0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。取jylr-005菌株的100亿/g菌粉1g，转移到装有9ml模拟肠液试管中，37℃80r/min处理1h、2h、3h。对样品溶液进行梯度稀释，倾注法活菌计数，每个处理3个重复。jylr-005菌株通过模拟胃肠消化液的存活率如表1所示：表1100ml菌数ph＝20.3％牛胆盐总存活率0h100亿100亿100％1h99亿94亿93.06％2h92亿88亿80.96％3h82亿84亿68.88％根据上述操作方法，对菌株cicc22700、atcc8014、atcc39392、cicc6236进行模拟胃肠消化液的存活率实验，存活率对照图如说明书附图图1所示。结论：本发明菌株jylr-005在体外模拟胃肠道实验时，存活率超过三分之二，大大超过其他对照菌株的存活率。实施例3不同菌株对caco-2的粘附率对照实验在40个视野下的粘附数量试剂mrs培养基：蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温801.0ml、k2hpo4·7h2o2.0g、醋酸钠·3h2o5.0g、柠檬酸三铵2.0g、mgso4·7h2o0.2g、mnso4·4h2o0.05gdmem培养基(购于gibco公司)pbs1l配方ph7.4：磷酸二氢钾(kh2po4)：0.27g，磷酸氢二钠(na2hpo4)：1.42g，氯化钠(nacl)：8g，氯化钾(kcl)0.2g，加去离子水约800ml充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调ph至7.4，最后定容到1l粘附操作将caco-2细胞分别置于含10％热灭活新生牛血清和双抗(青霉素浓度100u/ml、链霉素1.0μg/ml)的dmem培养液中，于37℃、5％co2、相对湿度95％的二氧化碳培养箱中孵育，每天换1次培养液，3～4d传代1次，15～20d后将细胞接种于24孔培养板中，接种密度约为5×105cfu/ml，待细胞长至单层后进行黏附试验。将活化好的jylr-005及其他对照菌株(cicc22700、atcc39392、cicc6126、atcc4357、cicc6236、atcc8014、atcc11443)分别按体积分数为1％的接种量接种于mrs液体培养基中，37℃培养12～14h，离心收集菌体(4000g，4℃，10min)。后用无菌pbs(ph7.4)洗涤3次，将菌体重悬于pbs中，用pbs将菌悬液稀释调整至所需要的浓度(3×108cfu/ml)。将已长成单层的细胞用灭菌pbs(ph7.4)漂洗2次，每孔加入0.5ml菌悬液[细菌浓度(3×108cfu/ml)]和0.5ml新鲜的dmem培养液。置37℃、5％co2、相对湿度95％的二氧化碳培养箱中孵育1h，用灭菌的pbs漂洗细胞5次，以除去未黏附的细菌。漂洗完后，用甲醛固定，革兰染色，镜检，倒置显微镜下计算40个随机视野下100个细胞上黏附的细菌数。以不加菌液细胞培养为对照。计算每个细胞黏附的平均细菌数。每个处理做3个平行，具体如说明书附图图2所示。通过图2可以看出，筛选出的菌株jylr-005，有较高的粘附率。实施例4对小鼠粪便中短链脂肪酸含量的影响在结肠中，乙酸、丙酸和丁酸占短链脂肪酸的90-95％，它们是微生物发酵的主要产物，对于调节肠道ph和保护肠道微生态平衡具有重要的作用。小鼠特征：3周龄的c57bl/6j雄性小鼠小鼠来源：上海斯莱克动物中心饲养环境：无特定病原体、22℃±2℃恒温、55％±5％恒湿和12h光照饲养量：每组30只，共4组。即正常组(n)，糖尿病组(dc)，药物组(p)，益生菌组(jylr-005)正常组：在第1周，适应新的环境，自由饮食和饮水。在第4周的第1d，正常组小鼠用50mmol/l柠檬酸盐缓冲溶液(ph4.5)进行腹腔注射。在第2到12周，正常小鼠喂食正常饲料和灌胃3％的蔗糖溶液。糖尿病组、药物组、益生菌组：第1周，和空白组一样，这三组小鼠适应新的环境。第2-3周，三组小鼠接受高脂饮食，并且在第4周的第1d，这四组小鼠按照100mg/(kgbw)的剂量进行腹腔注射stz。从第4-12周开始，这四组小鼠接受普通饲料。在stz注射的7d后，糖尿病组小鼠的fbg水平≥7.0mmol/l和pbg水平≥11.1mmol/l被认定为糖尿病。从第2周开始至试验结束，小鼠每天灌胃1次，灌胃量为0.2g。各组小鼠灌胃样品如下：(1)正常组和糖尿病组：灌胃3％的蔗糖；(2)药物组：10mg/(kgbw)吡格列酮；(3)益生菌组：1×1010cfu/gjylr-005；在试验结束前1d，收集小鼠粪便，然后迅速转移至-20℃冷冻保藏备用。小鼠粪便中短链脂肪酸的萃取和测定步骤如下：(1)称取50mg粪便样品放置于2mlep管中，然后加入500μl饱和nacl溶液浸泡，并用打碎头均质至无明显块状物；(2)然后加入20μl酸水(10％的h2so4溶液)酸化，旋涡振荡仪振荡30s，混匀；(3)在通风橱中加入800μl乙醚(为了减少挥发，冰上操作)，旋涡振荡30s，混匀；(4)18000g离心15min，将上清转移至含有0.25g无水na2so4的2mlep管中，再以同样的条件离心；(5)离心后取上层乙醚相，加入到气相样品瓶中，用gc-ms仪器分析样品中短链脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)的含量如说明书附图图3所示。结论：益生菌组的短链脂肪酸总量明显超过其他组的含量，对调节肠道ph和保护肠道微生态平衡有良好的促进作用。实施例5不同菌株对α-淀粉酶抑制率实验乳酸菌对α-淀粉酶活性抑制测定选取粘附性较好几株菌株jylr-005、cicc6126、atcc39392、atcc4357、atcc8014，进行α-淀粉酶活性抑制测定。将待测菌株接种在mrs液体培养基中，菌株接种量为1％，温度37℃发酵培养。取质量浓度为2mg/ml用ph值为7.0的磷酸缓冲液配制的α-淀粉酶溶液2ml，加2ml样液(不同菌株的发酵液每隔8h取样作为样液)，37℃下反应30min，后加2ml质量分数为1％的可溶性淀粉，37℃下反应15min，最后再加入碘液显色。同时设定样品对照组与空白对照组清除干扰，与不加样品用无菌水对照进行比较，测定样品对α-淀粉酶的抑制率，抑制率计算公式为：式中：a为样品空白组含有样品溶液不含α-淀粉酶溶液；b为样品组含有样品溶液以及α-淀粉酶溶液；c为空白组不含有样品溶液以及α-淀粉酶溶液；d为对照组不含有样品溶液含α-淀粉酶溶液。不同菌株对α-淀粉酶抑制率如说明书附图图4所示。总结：菌株jylr-005发酵液对α-淀粉酶抑制率，在发酵3d时有近70％的抑制率，有明显的降低α-淀粉酶酶活的作用，与其它菌株相比，发酵时间越长，抑制效果越明显。实施例6临床试验本发明的降血糖菌粉，将鼠李糖乳杆菌jylr-005菌粉与与低聚异麦芽糖混合复配制得。低聚异麦芽糖：购自保龄宝生物股份有限公司。选取自愿服用本发明的一种降糖菌粉(jylr-005)的成年糖尿病患者700名，且检测空腹血糖含量在7.5mmol/l以上。试验期间，每位患者仍然按照原来的生活饮食习惯(包括一直服用的降糖药物等)不变。为了保证服用乳酸菌菌粉的活性，服药时间和乳酸菌粉的服药时间间隔2h。试验一：乳酸菌对空腹血糖和餐后血糖的影响试验组：正常服药+jylr-005菌粉对照组：正常服药每组试验人数：100人试验内容：试验组每天按时服药2h后服用jylr-005菌粉150亿，对照组正常服药即可。试验进行时间30天，检测服药前后空腹血糖和进食2h后的血糖试验结果如说明书附图图5所示。结论：鼠李糖乳杆菌jylr-005对血糖含量有明显的调节作用。试验二：乳酸菌停用后血糖的变化情况试验组：实验一试验组患者停用jylr-005菌粉30天后对照组：实验一对照组患者每组试验人数：100人试验内容：在实验一结束后，试验组停用jylr-005菌粉30天后和对照组同时进行空腹血糖和餐后血糖的检测试验结果如说明书附图图6所示。结论：鼠李糖乳杆菌jylr-005在人体定植后，可对血糖具有持续的调节作用。试验三:乳酸菌用量对空腹血糖的影响试验组：(1)正常服药+50亿jylr-005菌粉(2)正常服药+150亿jylr-005菌粉(3)正常服药+250亿jylr-005菌粉(4)正常服药+500亿jylr-005菌粉(5)正常服药+1000亿jylr-005菌粉对照组：正常服药每组试验人数：100人试验内容：试验组在正常服药的情况下，按时服用一定量的jylr-005菌粉。对照组正常服药。在试验组服用益生菌后的30天之内，跟踪检测试验组和对照组的空腹血糖试验结果如说明书附图图7所示。结论：通过实验对照发现，每天服用量超过150亿后，与服用150亿的实验组相比，血糖的变化趋势并没有明显区别。所以鼠李糖乳杆菌jylr-005的每天服用150亿最为合适。序列表<110>山东中科嘉亿生物工程有限公司<120>一种鼠李糖乳杆菌jylr-005及其降血糖制品和应用<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1agagtttgatcmtggctcag20<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggttaccttgttacgactt19<210>3<211>1403<212>dna<213>鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)<400>3cttcgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgta60ttcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgtaggcgagttgc120agcctacagtccgaactgagaatggctttaagagattagcttgacctcgcggtctcgcaa180ctcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgattt240gacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttactagagtgcccaactaa300atgctggcaactagtcataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacga360cacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcattttgcccccgaaggggaaacctgatc420tctcaggtgatcaaaagatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaa480ccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggt540cgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcggcactgaagggcggaaaccctc600caacacctagcattcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgcta660cccatgctttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgcttcgccactggtgtt720cttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcact780caagtttcccagtttccgatgcgcttcctcggttaagccgagggctttcacatcagactt840aaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggataacgcttgccacctacgt900attaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttggataccgtcacgccg960acaacagttactctgccgaccattcttctccaacaacagagttttacgacccgaaagcct1020tcttcactcacgcggcgttgctccatcagacttgcgtccattgtggaagattccctactg1080ctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgatcaacctctcag1140ttcggctacgtatcatcgccttggtgagccattacctcaccaactagctaatacgccgcg1200ggtccatccaaaagcgatagcttacgccatctttcagccaagaaccatgcggttcttgga1260tctatgcggtattagcatctgtttccaaatgttatcccccacttaagggcaggttaccca1320cgtgttactcacccgtccgccactcgttccatgttgaatctcggtgcaagcaccgatcat1380caacgagacactcgtcgactgca1403当前第1页12