一种水牛精原干细胞样细胞纯化过程中细胞类型的鉴定方法与流程

本发明涉及一种细胞鉴定的
技术领域：
，尤其涉及一种水牛精原干细胞样细胞纯化过程中细胞类型的鉴定方法。
背景技术：
：水牛主要分布我国南部地区，主要应用于役力、肉食和产奶。水牛奶营养尤为丰富，其蛋白、维生素及微量元素等均高于普通的牛奶，据统计，1公斤水牛奶所含营养价值相当于1.85公斤黑白花牛奶。但是，水牛低繁殖率和低产奶量制约着水牛奶业的发展，因此亟待通过基因技术对水牛品种进行改良。目前，精原干细胞的分离纯化方法有免疫磁珠分离法、流式细胞仪分选法、差异贴壁分选法、不连续密度梯度离心法以及差异贴壁结合不连续密度梯度离心法。现有研究的水牛品种改良过程中常采用差异贴壁分选法对水牛的精原干细胞进行分离纯化，差异贴壁分选法是根据精原干细胞和其他体细胞在不同细胞外基质的贴壁速度不同设计的。精原干细胞容易在层粘连蛋白上粘附，而其他细胞容易在明胶上粘附，所以使睾丸细胞分别在明胶和层粘连蛋白上培养，可以将精原干细胞和其他细胞分开。然而，对水牛精原干细胞分离纯化过程中得到的细胞类型并没有进行鉴定，且采用传统方法判断最后纯化得到的细胞类型是否为试验所需要的精原干细胞比较困难，易导致判断不准确。技术实现要素：本发明的目的在于：针对上述存在的问题，提供一种准确、灵敏、方便的水牛精原干细胞样细胞纯化过程中细胞类型的鉴定方法。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种水牛精原干细胞样细胞纯化过程中细胞类型的鉴定方法，包括包括以下步骤：(1)采用差异贴壁分选法对水牛睾丸单细胞悬液进行分离纯化，并收集纯化过程中得到的不同类型细胞；(2)用总rna试剂盒提取步骤(1)收集到的不同类型细胞的总rna，然后使用反转录试剂盒进行反转录生成cdna；(3)再用步骤(2)得到的不同类型细胞的cdna作为样本，并分别以特定基因的引物，做定量pcr，再绘制相应的图谱即可。较佳地，所述差异贴壁法分选法对水牛睾丸单细胞悬液进行分离纯化的具体步骤为：(1)将获得的水牛睾丸单细胞悬液接种在铺有明胶的培养皿中，使用干细胞培养液过夜培养，然后将悬浮及贴壁不牢的细胞转移至提前铺有鼠尾胶原蛋白的培养皿中，培养4h，同时收集贴在明胶上的细胞为g-cell；(2)将接种在铺有鼠尾胶原蛋白的培养皿中未贴壁的细胞转移至层粘连蛋白的培养皿中，培养40min，同时收集贴在鼠尾胶原蛋白上的细胞为c-cell；(3)将接种在铺有层粘连蛋白的培养皿中的细胞培养40min，丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞为l-cell，即可。较佳地，所述干细胞培养液的主要成分为：imdm基础培养液、ksr、fetuin、neaa、chemicallydefinedlipidmixture1、b-27、gdnf、gfrα1、bfgf、lif和β-me。较佳地，所述干细胞培养液的具体配比为：以imdm为基础培养液，ksr的体积比为10％，fetuin的体积比为10％，neaa的终浓度为10μl/ml，chemicallydefinedlipidmixture1的终浓度为10μl/ml，b-27的终浓度为20μl/ml，gdnf的终浓度为20ng/ml，gfrα1的终浓度为100ng/ml，bfgf的终浓度为10ng/ml，lif的终浓度为10u/ml，β-me的终浓度为0.1mm。较佳地，所述培养为在37℃的培养箱中进行培养。较佳地，所述水牛睾丸单细胞悬液的制备方法为：(1)原料预处理：取水牛睾丸消毒后在超净台中剪去白膜，清洗干净后置于培养皿中剪成小块，再转移至ep管中剪碎；(2)消化：将步骤(1)中剪碎后的睾丸组织转移至培养皿中，加入一级消化液置于培养箱中消化至睾丸组织基本消化呈单个精细小管后，转移至离心管离心，并弃去上清液得到下层浊液；(3)一级重悬：将步骤(2)得到的下层浊液用pbs重悬沉淀，离心去除上清液，重复两次后得到底层的重悬液；(4)细胞分离：将步骤(3)的重悬液转移至培养皿中加入二级消化液消化2-5min将精细小管内部精原干细胞释放出来，放置于显微镜下观察并用移液器吹成单个细胞，使用含血清的imdm将其中和后使用移液器将细胞收集至离心管中，离心后去除上清液得到初级细胞悬浮液；(5)二级重悬：将步骤(4)的初级细胞悬浮液使用干细胞培养液进行重悬后，使用细胞网过滤后获得水牛睾丸单细胞悬液。较佳地，在步骤(2)，所述一级消化液为质量比1-3％的胶原酶和质量比0.001-0.005％的dnasei酶，所述消化时间为5-15min，所述培养箱为二氧化碳培养箱，培养箱的培养条件为37℃、5％的二氧化碳浓度。较佳地，在步骤(4)，所述二级消化液为0.1-0.4％的trypsin-edta和0.003-0.007％的dnasei酶，所述血清为胎牛血清fbs和血清替代物ksr中任意一种或两种的混合物，所述血清的添加量为imdm的10％。较佳地，在步骤(5)，所述干细胞培养液的具体配比为：以imdm为基础培养液，ksr的体积比为10％，fetuin的体积比为10％，neaa的终浓度为10μl/ml，chemicallydefinedlipidmixture1的终浓度为10μl/ml，b-27的终浓度为20μl/ml，gdnf的终浓度为20ng/ml，gfrα1的终浓度为100ng/ml，bfgf的终浓度为10ng/ml，lif的终浓度为10u/ml，β-me的终浓度为0.1mm。较佳地，所述特定基因为oct4、nanos2、ddx4、β1-integrin和gdnf。综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：(1)本发明的水牛精原干细胞样细胞纯化过程中细胞类型的鉴定方法，采用分子特异性检测，可以快速地鉴定差异贴壁过程中细胞的类型，并准确判断出最终富集到的细胞大部分为具有干性的精原干细胞样细胞，去除掉的基本均为体细胞。(2)本发明的差异贴壁分选过程中使用的是无血清的干细胞培养液，相对于传统的加血清的体细胞培养液，精原干细胞样细胞损失量少，且更利于精原干细胞样细胞干性的维持。附图说明图1为水牛睾丸细胞纯化前后ssc-likecells的比例图，其中1(a)是差异贴壁前的ddx4阳性细胞，1(b)是差异贴壁后的ddx4阳性细胞，1(c)是差异贴壁前的pgp9.5阳性细胞，1(d)是差异贴壁后的pgp9.5阳性细胞；图2为差异贴壁前后ddx4阳性细胞和pgp9.5阳性细胞所占比例的汇总；图3为纯化过程中各部分细胞类型分子水平的验证图；其中3(a)为oct4基因在三类细胞中的分布情况；3(b)为nanos2基因在三类细胞中的分布情况；3(c)为ddx4基因在三类细胞中的分布情况；3(d)为β1-integrin基因在三类细胞中的分布情况；3(e)为gdnf基因在三类细胞中的分布情况。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。本发明所涉及到的英文名称解释如下：ssc-likecell：精原干细胞样细胞；imdm：iscove'smodifieddulbecco'smedium即dmem的改良版培养液；ksr：knockoutserumreplacement，血清替代物；fetuin：胎球蛋白；neaa：非必需氨基酸；chemicallydefinedlipidmixture1：脂质混合物；gdnf：glialcellline-derivedneurotrophicfactor，胶质细胞源性神经营养因子；gfrα1：gdnffamilyreceptoralpha-1，胶质细胞源性神经营养因子家族受体α-1；bfgf：basicfibroblastgrowthfactor，碱性成纤维细胞生长因子-2；lif：leukemiainhibitoryfactor，白血病抑制因子；β-me：2-mercapto-ethanol，β-琉基乙醇；dnasei：deoxyribonuclease，脱氧核糖核酸酶i；fbs：胎牛血清。本发明采用的总rna试剂盒为totalrnakitⅰ(omega,r6834-02)试剂盒。反转录试剂盒为primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(takara,codeno.rr047a)。实施例1.水牛睾丸单细胞悬液的制备(1)从屠宰场取3-7月龄的水牛睾丸，使用75％的酒精消毒10min，pbs洗三次，在超净台中剪去白膜，使用含有双抗的pbs洗三次，将睾丸组织放入洁净的培养皿中剪成小块，然后转移到无菌的ep管中将其剪碎；(2)将剪碎后的组织转移至洁净的培养皿中，并添加胶原酶(20mg/ml)和dnasei酶(1mg/ml)消化液，放置37℃、5％二氧化碳培养箱中消化，直至绝大部分组织块消化成单个精细小管，此过程保持在10min左右，转移组织至50ml的离心管中，2000rpm水平离心5min，弃上清；(3)用pbs重悬沉淀，2000rpm水平离心5min，弃上清，重复2次；(4)使用精细小管将沉淀物转移至100mm的大皿中，添加0.25％的trypsin-edta和dnasei酶(1mg/ml)消化3min，放置显微镜下观察并用移液器将其吹成单个细胞，使用含10％fbs的imdm将其中和，收集细胞至50ml的离心管中，2000rpm水平离心5min，弃上清；(5)使用培养液将细胞重悬，分别用70μm和40μm的细胞网过滤，获得水牛睾丸单细胞悬液。2.差异贴壁分选法进行分离纯化(1)将获得的水牛睾丸单细胞悬液接种在铺有明胶的培养皿中，37℃培养箱中，使用干细胞培养液过夜培养，然后将悬浮及贴壁不牢的细胞转移至提前铺有鼠尾胶原蛋白的培养皿中，放置37℃培养箱中培养4h，同时收集贴在明胶上的细胞为g-cell；(2)将接种在铺有鼠尾胶原蛋白的培养皿中未贴壁的细胞转移至层粘连蛋白的培养皿中，放置37℃培养箱中培养40min，同时收集贴在鼠尾胶原蛋白上的细胞为c-cell；(3)将接种在铺有层粘连蛋白的培养皿中的细胞放置37℃培养箱中培养40min，丢弃漂浮细胞，收集贴壁细胞为l-cell，即可。如图1为水牛睾丸细胞纯化前后ssc-likecells的比例图，其中1(a)是差异贴壁前的ddx4阳性细胞，1(b)是差异贴壁后的ddx4阳性细胞，1(c)是差异贴壁前的pgp9.5阳性细胞，1(d)是差异贴壁后的pgp9.5阳性细胞；图2为差异贴壁前后ddx4阳性细胞和pgp9.5阳性细胞所占比例的汇总。差异贴壁前是指将睾丸组织消化成单个细胞之后染色，ddx4和pgp9.5的阳性细胞。差异贴壁后是指用差异贴壁法纯化细胞之后，在用这两种抗体染色得到一个阳性细胞数。由图1-2可知差异贴壁前的ddx4阳性细胞比例为18.1％，差异贴壁后的ddx4阳性细胞比例为58.2％；差异贴壁前的pgp9.5阳性细胞比例为11.3％，差异贴壁后的pgp9.5阳性细胞比例为49.8％，因而差异贴壁后阳性细胞数目增多，差异贴壁法可以起到纯化细胞的目的。3.分离纯化过程中细胞类型的鉴定(1)用总rna试剂盒分别提取收集到的g-cell、c-cell及l-cell的总rna，然后使用反转录试剂盒进行反转录生成cdna；(2)再分别将得到的不同类型细胞的cdna作为样本，加入相应的试剂，并分别以基因oct4、nanos2、ddx4、β1-integrin和gdnf的引物，做定量pcr，然后根据得到的各个基因表达的循环数，进行计算再绘制相应的图谱即可。绘制所得图谱如图3所示。3.1总rna的提取过程为：a、分别收集g-cell、c-cell及l-cell细胞并离心，加入适量的trk。b、使用rnahomogenizerspin柱子在最大转速下离心2分钟，收集离心管中的液体。c、向收集的液体中加入等体积的70％的酒精并混匀，但不离心。d、使用hibindrnamini柱子放入新的离心管中。e、将700ul的步骤3中的样品加入柱子当中，10000g离心1分钟，丢弃废液。重复步骤e，直到样品全部过滤完。f、继续向柱子中加入500ul，rnawashbufferⅰ，10000g离心30秒，丢弃废液。g、继续向柱子中加入500ul，rnawashbufferⅱ，10000g离心1分钟，丢弃废液。重复步骤g再洗一次。h、以最大转速离心2分钟完全甩干离心柱。i、将hibindrnamini柱子放入新的1.5ml的离心管中，加入30ul的decp水，以最大转速离心2分钟，丢弃柱子，离心管中的即为收集到的总rna。3.2反转录生成cdna的过程为：a、去除基因组dna反应按表1所示的成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液的配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2量配制反应混合液，然后再分装到每个反应管中，最后加入总rna样品(42℃，2min)。表1试剂使用量5×gdnaeraserbuffer2.0ulgdnaeraser1.0ultotalrna*1rnasefreedh2oupto10ul*1：20ul反转录反应体系中，sybrgreenqpcr法最多可使用1ug的totalrna，探针qpcr分析法最多可使用2ug的totalrna。b、反转录反应按表2所示的成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液的配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2量配制反应混合液，然后再分装10ul到每个反应管中，轻柔混匀后立即进行反转录反应(37℃，15min；85℃，5s)。表23.3本发明检测转录组基因表达所用的pcr序列见表3。表3参见附图3为分离纯化过程中各部分细胞类型分子水平的验证图(即鉴定)，其中3(a)为oct4基因在三类细胞中的分布情况；3(b)为nanos2基因在三类细胞中的分布情况；3(c)为ddx4基因在三类细胞中的分布情况；3(d)为β1-integrin基因在三类细胞中的分布情况；3(e)为gdnf基因在三类细胞中的分布情况。精原干细胞属于生殖干细胞，既有干细胞特性，又有生殖细胞特性；oct4及nanos2是多能性细胞的标记，此处可以作为水牛精原干细胞的标记，ddx4时生殖细胞的标记，β1-integrin和gdnf属于支持细胞的标记。图3的纵坐标是g-cell、c-cell及l-cell细胞中基因的表达量，图中的三个柱状图表明，最有一部分的l-cell中的细胞具有很强的多能性同时又具有精原干细胞特性还具有生殖细胞特性，综合来说就是本发明最终纯化所需要的精原干细胞样细胞；β1-integrin和gdnf是支持细胞的标记，就是体细胞，其在g-cell和c-cell细胞的表达量比较高，说明大部分的体细胞都去除掉了。因而由本发明的鉴定方法可知，g-cell这一部分细胞主要是体细胞；c-cell这一部分细胞主要是在明胶上未贴壁完全的体细胞和分化的细胞；l-cell这一部分细胞主要是精原干细胞样细胞。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12