一种金黄色葡萄球菌显色培养基及检测测试片的制作方法

本发明属于微生物检验及食品安全监测技术领域，尤其涉及一种金黄色葡萄球菌显色培养基及检测测试片。

背景技术：

随着人们生活水平的提高，食品安全事件越来越受到人们的重视。金黄色葡萄球菌广泛存在于自然界中，并且是人类身体上存在的微生物种类之一，大约25-50％的金黄色葡萄球菌存在于人类的鼻腔当中。金黄色葡萄球菌是世界公认的食源性致病菌之一，其产生的肠毒素会导致急性胃肠炎，严重的会引起重大的系统性疾病导致死亡。在我国的细菌性食物中毒事件中，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性中毒事件的四分之一。

建立快速而准确的检测手段是控制食源性病原菌污染的关键。目前，金黄色葡萄球菌的检测方法主要有bp平板法、免疫学、分子生物学快速检测方法。bp平板法虽成本较低，敏感性好，但操作较繁琐，工作量大，而且检测时间较长，需要3～5天才能出结果，无法满足食品中病原菌快速检测的现实需要。免疫学、分子生物学检测方法虽然检测时间短，灵敏度高，但是检测成本高，且对于检测设备和技术人员操作要求较高，一般只是在实验室中应用较多，不能完全普及。

技术实现要素：

为了解决金黄色葡萄球菌检测时间长、成本高、操作难度大的问题，本发明提供了一种金黄色葡萄球菌显色培养基及检测测试片。

本发明的技术方案：

一种金黄色葡萄球菌显色培养基，每1l显色培养基含有蛋白胨12～20g、酵母粉2～4g、牛肉膏2～5g、氯化钠10～20g、丙酮酸钠4～8g、甘氨酸7.5～12.5g、氯化锂3～7g、亚碲酸钠20～40mg、苯乙醇3～7ml和特异性酶显色底物0.3g和琼脂15g，培养基ph为7.4。

进一步的，每1l显色培养基含有蛋白胨20g、酵母粉3g、牛肉膏3g、氯化钠20g、丙酮酸钠8g、甘氨酸12.5g、氯化锂5g、亚碲酸钠40mg、苯乙醇3ml、特异性酶显色底物0.3g和琼脂15g，培养基ph为7.4。

进一步的，所述特异性酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯。

一种金黄色葡萄球菌检测测试片，其结构由下至上依次为底板、培养基层和盖膜，所述培养基层是将金黄色葡萄球菌显色培养基按一定体积比与吸水保湿剂混合均匀后附着在无纺布上烘干制得，其中每1l显色培养基含有蛋白胨12～20g、酵母粉2～4g、牛肉膏2～5g、氯化钠10～20g、丙酮酸钠4～8g、甘氨酸7.5～12.5g、氯化锂3～7g、亚碲酸钠20～40mg、苯乙醇3～7ml、特异性酶显色底物0.3g和琼脂15g，培养基ph为7.4。

进一步的，所述特异性酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯。

进一步的，所述吸水保湿剂包括聚丙烯酰胺和瓜尔胶，两者体积比为1:4。

进一步的，所述吸水保湿剂与显色培养基的体积比为1:20。

进一步的，底板与盖膜的同一侧边夹有长方形pep条，所述pep条具有黏性，将盖膜的一侧侧边固定在底板上。

进一步的，所述盖膜为无色透明的透氧pp薄膜。

进一步的，测试片尺寸为5cm×5cm时，烘干后显色培养基层的边长为4cm×4cm、厚度为0.5mm，进行检测时所需样品体积为1ml；36±1℃培养24h，测试片上出现蓝色菌落即为金黄色葡萄球菌阳性菌落。

本发明的有益效果：

一、本发明利用金黄色葡萄球菌自身生化特性对显色培养基进行了优化，通过金黄色葡萄球菌在代谢中产生的特异性酶与培养基中添加的显色底物使菌落呈现特定的颜色实现分离和鉴别。本发明金黄色葡萄球菌显色培养基中加入多种抑制剂，能有效抑制非目标菌的生长，对金黄色葡萄球菌选择性强，特异性强、灵敏度高。

二、本发明用金黄色葡萄球菌显色培养基制作的检测测试片，将传统的多步培养鉴定过程简化到一步完成，适用于对大通量样本中的金黄色葡萄球菌的准确快速检测和监控，检测周期短、操作简单方便，对检测环境和检测人员的要求不高，降低了检测成本，且阳性结果显色明显，检测结果准确，在对金黄色葡萄球菌进行定性检测的同时，还可进行定量分析，对食品安全快速监测具有非常重要的意义。

附图说明

图1为实施例9使用检测测试片检测稀释至10^-7的金黄色葡萄球菌菌液样品产生的阳性菌落；

图2为实施例9使用检测测试片检测稀释至10^-6的金黄色葡萄球菌菌液样品产生的阳性菌落；

图3为实施例9使用检测测试片检测稀释至10^-8的金黄色葡萄球菌菌液样品产生的阳性菌落。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1

一种金黄色葡萄球菌显色培养基，每1l显色培养基含有蛋白胨12～20g、酵母粉2～4g、牛肉膏2～5g、氯化钠10～20g、丙酮酸钠4～8g、甘氨酸7.5～12.5g、氯化锂3～7g、亚碲酸钠20～40mg、苯乙醇3～7ml和特异性酶显色底物0.3g和琼脂15g，培养基ph为7.4。本实施例培养基中蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和氯化钠是供金黄色葡萄球菌生长的基础营养物质，丙酮酸钠、甘氨酸、氯化锂、亚碲酸钠和苯乙醇为抑制非目标菌生长的抑制剂。

实施例2

一种金黄色葡萄球菌显色培养基，每1l显色培养基含有蛋白胨20g、酵母粉3g、牛肉膏3g、氯化钠20g、丙酮酸钠8g、甘氨酸12.5g、氯化锂5g、亚碲酸钠40mg、苯乙醇3ml、特异性酶显色底物0.3g和琼脂15g，培养基ph为7.4。本实施例进一步优化了显色培养基配方中基础营养物质与抑制剂的添加比例，防止抑制剂在抑制非目标菌的同时对金黄色葡萄球菌的抑制，使金黄色葡萄球菌得到保护和修复。

实施例3

一种金黄色葡萄球菌显色培养基，每1l显色培养基含有蛋白胨20g、酵母粉3g、牛肉膏3g、氯化钠20g、丙酮酸钠8g、甘氨酸12.5g、氯化锂5g、亚碲酸钠40mg、苯乙醇3ml、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯0.3g和琼脂15g，培养基ph为7.4。本实施例使用的特异性酶显色底物为5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯，其对金黄色葡萄球菌在代谢中产生的特异性酶或其他特异性物质具有高灵敏度，能使菌落呈现明显的蓝色，且特异性强，检测结果准确。

实施例4

一种金黄色葡萄球菌检测测试片，其结构由下至上依次为底板、培养基层和盖膜，所述培养基层是将金黄色葡萄球菌显色培养基按一定体积比与吸水保湿剂混合均匀后附着在无纺布上烘干制得，其中每1l显色培养基含有蛋白胨12～20g、酵母粉2～4g、牛肉膏2～5g、氯化钠10～20g、丙酮酸钠4～8g、甘氨酸7.5～12.5g、氯化锂3～7g、亚碲酸钠20～40mg、苯乙醇3～7ml、特异性酶显色底物0.3g和琼脂15g，培养基ph为7.4。

实施例5

一种金黄色葡萄球菌检测测试片，其结构由下至上依次为底板、培养基层和盖膜，所述培养基层是将金黄色葡萄球菌显色培养基按一定体积比与吸水保湿剂混合均匀后附着在无纺布上烘干制得，其中每1l显色培养基含有蛋白胨16g、酵母粉4g、牛肉膏3g、氯化钠15g、丙酮酸钠6g、甘氨酸10g、氯化锂5g、亚碲酸钠30mg、苯乙醇5ml、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯0.3g和琼脂15g，培养基ph为7.4。

实施例6

一种金黄色葡萄球菌检测测试片，其结构由下至上依次为底板、培养基层和盖膜，所述培养基层是将金黄色葡萄球菌显色培养基按吸水保湿剂与显色培养基的体积比为1:20与吸水保湿剂混合均匀后附着在无纺布上烘干制得，吸水保湿剂由聚丙烯酰胺和瓜尔胶按体积比为1:4组成，其中每1l显色培养基含有蛋白胨15g、酵母粉2g、牛肉膏4g、氯化钠17g、丙酮酸钠7g、甘氨酸9g、氯化锂6g、亚碲酸钠35mg、苯乙醇6ml、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯0.3g和琼脂15g，培养基ph为7.4。

实施例7

一种金黄色葡萄球菌检测测试片的制备方法，步骤如下：

(一)配制金黄色葡萄球菌显色培养基

按照如下配方称量各组分：每1l显色培养基含有蛋白胨20g、酵母粉3g、牛肉膏3g、氯化钠20g、丙酮酸钠8g、甘氨酸12.5g、氯化锂5g、亚碲酸钠40mg、苯乙醇3ml、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯0.3g和琼脂15g；

将蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、氯化钠、丙酮酸钠、甘氨酸、氯化锂、苯乙醇和琼脂溶于足量水中，调整培养基ph至为7.4；培养基ph值为7.4可以使特异性酶显色底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯在中性环境下保持稳定；

加热至沸腾使琼脂完全溶于培养基中；培养基降温至60～65℃加入亚碲酸钠、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯，将培养基搅拌均匀；按吸水保湿剂与显色培养基的体积比为1:20再向培养基中加入由聚丙烯酰胺和瓜尔胶按体积比为1:4组成的吸水保湿剂，搅拌均匀后立即将显色培养基倒入边长为4cm×4cm的模具中，每个模具倒入培养基的体积为5ml，室温放置使培养基凝固定型；将凝固定型的显色培养基放置在边长为4cm×4cm的无纺布上，无纺布吸水性较强，棉质较高，不影响微生物生长，将显色培养基与无纺布放入95℃烘箱内烘干，烘干后显色培养基的厚度为0.5mm。

吸水保湿剂可以在检测过程中保持显色培养基的水分以供金黄色葡萄球菌生长所需。

(二)制备检测测试片

准备边长为5cm×5cm的检测测试片底板，底板为包覆有塑料膜的硬纸板，主要作用是保持平整，起支撑作用。准备边长为5cm×5cm的无色透明的透氧pp薄膜作为盖膜，盖膜厚度为0.05mm，氧气可以自由通过，不抑制微生物生长；盖膜无色透明易于观察阳性菌落，其上印有方便菌落计数的方格。

将盖膜覆盖在底板上，在底板与盖膜的同一侧边夹入一片长方形具有uv胶的pep条，pep条的黏性将盖膜的一侧侧边固定在底板上，揭开盖膜，将带有显色培养基的无纺布贴在底板的中心位置，盖上盖膜。

制备完成的检测测试片采用辐照灭菌，具体灭菌条件为紫外线辐照灭菌60min；灭菌后将检测测试片放入无菌包装袋，包装袋内加入干燥剂并封口。

实施例8

实施例7制备的金黄色葡萄球菌检测测试片的使用方法：

打开检测测试片包装袋封口，取出检测测试片并放置在水平实验台上，缓慢揭开盖膜，将1ml样品菌液垂直均匀滴加在显色培养基的中心区域；缓慢盖上盖膜，样品菌液会自动扩散至整个培养基，样品匀液完全渗透后，在移动测试片；将测试片盖膜朝上，正置于培养箱中，36℃±1℃培养24h，观察是否产生蓝色阳性菌落，并进行菌落计数。

测试片堆叠培养室，不宜超过20片。

实施例9、灵敏度验证结果

将金黄色葡萄球菌培养液依次稀释到10^-6、10^-7、10^-8、10^-9，将1ml菌液样品分别滴加到4片实施例7制备的检测测试片上，同时将1ml菌液样品涂布到显色培养基平板上进行对照培养，36℃培养24h；结果如表1所示：

表1

由表1中数据可以看出金黄色葡萄球菌检测测试片灵敏度非常高，当菌落数待0-9之间时，仍然可以计数，从图1-图3可以看出阳性菌落明显，清晰，易于观察计数，使用金黄色葡萄球菌检测测试片在对金黄色葡萄球菌进行定性检测的同时，还可进行定量分析。

实施例10、培养时间验证结果

将金黄色葡萄球菌培养液稀释至10^-7，将菌液样品滴加到实施例7制备的检测测试片上36℃培养，每6小时观察依次阳性菌落生长情况，结果如表2所示：

表2

由表2数据可以看出，24h之后，阳性菌落的个数不再增加，这说明金黄色葡萄球菌检测测试片能够将检测时间缩短至24h，满足快速检测的现实需要；对食品安全快速监测具有非常重要的意义。

实施例11、稳定性验证结果

将实施例7制备的检测测试片分别在4℃、28℃和36℃存放7d或14d，将菌液样品滴加到上述检测测试片36℃培养24h，结果如表3所示：

表3

由表3数据可知，检测测试片分别在4℃、28℃和36℃存放7d或14d均能在24h内检测到阳性菌落，4℃和28℃存放不同时间检测结果无差异，即使36℃高温下存放，仍能保持较高的检出率。

实施例12、特异性验证结果

将包含金黄色葡萄球菌在内的17中细菌的培养液滴加到实施例7制备的检测测试片上，36℃培养24h，结果如表4所示：

表4

注：“+”表示菌落生长切显色，“-”表示菌落不生长。

由表4数据可知，除金黄色葡萄球菌呈蓝色菌落，其余15种非目标菌均未检出。这说明金黄色葡萄球菌检测测试片具有较高的特异性，金黄色葡萄球菌显色培养基中加入的多种抑制剂，能有效抑制非目标菌的生长。

实施例13数据可靠性验证结果

吸取相同浓度金黄色葡萄球菌悬液1.0ml接种实施例7制备的检测测试片、baird-parker平板和营养琼脂平板，在37℃培养24h，以营养琼脂平板作为对照，计算其他两种培养基的生长率，结果如表5所示；对两种方法进行相关性分析并建立线性回归模型，为便于统计分析，采用直观菌落数作为统计量。

表5

配对样本t检验统计结果表明，金黄色葡萄球菌在测试片培养基和baird-parker培养基都与营养琼脂培养基作对比，没有统计学差异(t＝2.201，p>0.05)，表5对数据结果分析，两种培养基具有很好的相关性(f＝0.943)，说明测试片检测结果比较可靠。

本实施例还对实施例7制备的检测测试片的检测结果和国标检测方法的测试结果进行了相关性分析并建立线性回归模型，得到线性回归方程y＝0.977x+0.184，r²＝0.994，说明两者相关性较好，测试片检测结果比较可靠。