一种与鸡生长肉用形状相关的SNP及其应用的制作方法

本发明涉及基因检测
技术领域：
，特别涉及一种与鸡生长肉用性状相关的snp分子标记及其应用。
背景技术：
：microrna(mirna)是一类约有22个左右核苷酸的内源性非编码单链rna。随着分子生物研究技术与方法的快速发展，研究人员发现了越来越多的mirna。mirna是由一段长度为70～80个核苷酸的且包含一段发夹结构的mirna前体(pre-mirna)剪切后生成。mirna通过与其靶标基因mrna的3’端非编码区域(3-untranslatedregion，3’utr)互补导致该mrna的翻译受到抑制实现对基因的调控。mirna虽然不直接编码蛋白质，但其编码的rna在生物的整个生命过程中发挥着重要作用。目前发现mirnas能够参与许多调节途径，包括骨骼肌发育、病毒防御机制、造血过程、器官形成分化、细胞增殖和死亡、脂肪代谢等。近些年来，随着基因组学和全基因组关联分析等技术的迅速发展，mirna已然成为国内外动物遗传育种研究中的热门领域。在国内，金晶等利用高通量测序技术对荷斯坦牛泌乳期高乳品质奶牛(h)和泌乳期低乳品质奶牛(l)乳腺组织进行了mirna测序，通过差异表达分析筛选组间差异mirnas，获得56个差异表达mirna(p<0.05)，并对差异表达mirna进行靶基因预测，经过对靶基因筛选，发现了4个已报道与乳蛋白、乳脂紧密相关的功能基因：csn3、scd、lalba和dgat2。靶基因聚集的生物学功能多数参与了蛋白质和脂肪代谢，乳腺发育和分化，以及免疫功能。凌英会等对山羊肌肉组织进行solexa测序并进行生物信息学分析，共鉴定出517个物种间保守的和2个山羊基因组特有的mirna。本课题组前期通过靶标预测软件预测并通过双荧光素酶靶标验证系统验实ghr与igf2bp3为let-7b的靶标位点，let-7b的过表达会导致ghr、igf2bp3的mrna表达量明显下调，证明let-7b对ghr、igf2bp3基因具有负向调控作用，同时，发现let-7b通过介导ghr基因来影响jak-stat信号通路，从而调控骨骼肌的生长发育。还有许多报道表明，mirnas广泛的参与到鸡胚的生长发育、性成熟、神经细胞和肌肉细胞的增殖和分化和细胞迁移[29-33]等一系列生命活动中。单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，snp)是指生命个体基因组序列中单个核苷酸发生的突变。snps在dna水平上出现的频率非常高，在所有突变形式中高达九成以上，但其中很多突变都集中在非编码区，其他很少的突变分布在基因的编码区。有证据显示，snp可以对rna、dna和蛋白水平对基因的表达及功能产生影响，是导致个体与群体之间的包括疾病发生，药物敏感与表型差异等的重要因素，其成熟体和前体序列上的snp有改变其形成过程甚至改变成熟体的靶标位点或改变与靶基因的结合强度，致使mirna的功能发生变化，从而致使动物性状的变异。每个mirna都有不止一个靶标位点，这就意味着位于mirna上的snp有着重要的意义，因此筛选mirna成熟体序列和前体序列上的snps，揭示其功能是很有研究意义的。当前查找筛选snp是用sanger测序或者pcr-rflp法来进行的，由于这些技术方法的效率较低，近些年来迅速发展的genechip技术和high-throughputsequencing能够在基因组水平上进行高效率的筛查突变位点。研究表明位于mirna种子区的snp更是稀缺，而存在于mirna前体区的snp数量较多被广泛应用于遗传学诊断、肿瘤易感性等领域。mirna的基因多态可通过改变mirna的靶标位点和改变mrna的稳定性来影响转录前和转录后的调控，随后影响基因的表达以及表型的不同。这些多态位点可望作为分子标记用于育种中的辅助选择。zhao等在研究313只位于绵羊外显子2的rxrg基因突变及其与双胎性状的关系，通过pcr-sscp分析了rxrg基因第1外显子、第2外显子、第10外显子的基因多态性，结果表明，3种p2片段基因型与群体中的双胎性状显著相关(p＜0.05)。蓝贤勇等通过45份内蒙古白绒山羊α-乳白蛋白(lalba)基因进行测序和分型，并与羊绒量、羊绒厚、羊绒长和体重性状进行关联分析。结果显示，其外显子3区域存在1个突变位点g.1897t>c。该位点不同基因型与产绒量存在显著相关(p＜0.05)，其tc基因型个体产绒量比tt基因型个体多产绒142.68g，高达26.21％(p<0.05)。lei等(2010)实验证明mir27a基因上的t/c突变与猪的每窝产仔数有关。huang采用pcr限制性片段长度多态性和微测序方法对187只鸭进行了snp基因分型。cc基因型和tt基因型的孵化率分别为79.59±3.40和76.35±1.77，显著高于ct基因型(65.77±2.07)(p<0.05)。let-7家族是由reinhart等人在本世纪初发现的一类mirna。let-7家族成员分别位于几个不同的染色体上。研究发现let-7家族成员之一的let-7b靶向调节的基因在许多信号通路中的扮演重要角色，许多信号通路与细胞的增殖凋亡有关，因此有许多研究者研究let-7b与细胞增殖之间的关系。schμltz等研究发现let-7b抑制了黑色素瘤细胞的细胞周期进程和不依赖于锚定的生长。zhao等在研究中发现let-7b可以通过靶向干细胞调节因子tlx与细胞周期调节因子cyclind1来调节神经干细胞的增殖与分化；敲除则促进神经干细胞增殖，促进神经分化；而过量表达let-7b可降低神经干细胞增殖。陈楠在斑马鱼实验中发现，抑制低氧诱导因子1(hif-1a)会导致let-7b的表达下调，在zf4细胞中过表达let-7b会改变细胞周期过程，阻滞细胞周期中g1期到s期的过度，停止或减缓细胞的增殖；还通过体外实验鉴定了let-7b的靶基因foxh1也直接或间接的参与了细胞增殖过程。曲杰通过将mirlet-7b与anti-mirlet-7b转染至乳腺癌mcf-7细胞后进行划痕实验，结果显示let-7b能够显著抑制乳腺癌mcf-7细胞的迁移能力，而anti-mirlet-7b组能够显著促进乳腺癌mcf-7细胞的迁移，证明let-7b能够抑制乳腺癌mcf-7细胞的迁移能力。技术实现要素：本发明的目的在于确定鸡let-7b前体区基因序列中突变位点g.678t>c的基因型以便对鸡生长肉用性状进行早期选择，节省生产成本并加快遗传进展，提出一种与鸡生长肉用性状相关的分子标记及其应用。本发明所采取的技术方案是：一种与鸡生长肉用性状相关的snp分子标记，其所述snp分子标记对应于鸡let-7b前体区基因序列中的突变位点g.678t>c，该snp位点的基因型为tt、tc和cc。所述的snp分子标记在鸡遗传育种中的应用。一种鸡生长肉用性状早期选择的方法，其根据上述snp位点的基因型对鸡的屠体性状、肉质性状和体尺性状进行早期选择，包括如下步骤：1)提取待测鸡血液dna；2)从待测鸡血液dna中获得鸡let-7b前体区基因序列；3)采用dna混池测序方法检测鸡let-7b前体区基因序列上snp突变位点g.678t>c的基因型；4)基于步骤2)snp位点的基因型对鸡的屠体性状、肉质性状和体尺性状进行早期选择，其中屠体性状中cc和tt基因型个体腿胸比大于tc基因型个体；肉质性状中tc基因型个体腿肌ph大于cc和tt基因型个体；体尺性状中tc基因型个体56d胫长大于cc和tt基因型个体。本发明的有益效果是：本发明的snp分子标记，即鸡let-7b前体区基因序列中的突变位点g.678t>c与鸡屠体性状、肉质性状和体尺性状相关，是一个新的分子标记，通过确定该鸡snp位点的基因型对鸡屠体性状、肉质性状和体尺性状进行早期选择，可以节省生产成本并加快遗传进展，更好地应用于鸡的育种中，具有很大的经济应用价值和科研价值。附图说明图1为snp检测中引物特异性测试结果；图2为鸡let-7b前体区基因序列上snp位点突变信息。具体实施方式下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属
技术领域：
的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述
发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。实施例待测鸡为杏花鸡和隐性白洛克鸡杂交出来的f2代肉鸡，数量为320只，采用平养的饲养方式，饲喂符合国际配方标准的玉米-豆粕型饲料，隐性白洛克鸡是一种快大型肉鸡，而杏花鸡是中国广东本土的品种肉鸡。然后分别在雏鸡1～8周龄时测量其体重(bw，bodyweight，单位为g)。在3月龄时进行屠宰取样，分别记录它们的胫长、头宽、胸宽、胸深、体长、胸角宽、屠宰重量、皮质厚度、去内脏重、全半净膛重、胸肌腿肌重、羽重、腹脂重、头颈重、心脏重、肝重、胃重和小肠长。其中胸角用胸角器测量；皮下脂肪厚胫长、脂肪宽、头宽、胸宽、胸深、体长用游标卡尺测量；所有个体的基因组dna按照常规酚/氯仿法提取，检测质量和浓度后稀释至50ng/μl，4℃保存备用。一、提取杏花×隐性白f2代资源群全同胞家系待测鸡血液dna(1)抽取100μl血液，加入500μlbufferte和10μl蛋白酶k，振荡30min，加入2μl裂解液55℃消化过夜；(2)加入600μltris饱和酚，随后振荡15s，10000rpm离心8min；(3)取上清，加入等体积tris饱和酚，随后振荡15s，10000rpm离心8min；(4)取上清液，加入等体积比例为酚/氯仿/异戊醇＝25：24：1的混合液，振荡10s，10000rpm离心8min；(5)取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)，振荡10s，10000rpm离心8min；(6)取上清液，加入2倍体积预先冷却的无水乙醇，12000rpm离心10min；(7)弃上清液，加入1ml70％乙醇进行冲洗，12000rpm离心10min；(8)弃上清，自然干燥2h，加入适量的bufferte于4℃保存备用。二、snp检测及dna混池测序1、snp检测：从https://www.ncbi.nlm.nih.gov/找到let-7b前体区基因序列，两翼序列各扩展500bp，利用primerpremier5.0软件设计出引物对，引物对信息如表1所示(引物序列5’→3’)，将设计的引物对序列发往擎科生物公司合成，并用该引物对对血液dna进行pcr，测试引物的特异性，结果附图1所示。表1let-7b前体区snp筛选的引物信息f：gtaaatccacctagcgtr：gcccaggaaatatgaa2、dna混池测序：从提取的dna总样品中随机挑选30个dna样品构建混池，每三个样品(每个样品约0.33μl)混合为一个混合样品，共计10个。将混池样品进行pcr扩增，所用引物与上述snp检测中所用的引物对相同，将获得的pcr产物送往生工生物公司测序，测序结果检测得到鸡let-7b前体区基因序列上snp突变位点g.270g＞a，其测序结果分析如附图2所示。三、确定let-7b前体区突变位点g.678t＞c的基因型将实施例所有待测鸡共320份血液dna全部进行pcr特异性扩增得到let-7b前体的pcr产物，所用到的引物对信息如表1所示)，通过对各个基因型的个体进行统计分析可得到该位点的基因型频率和等位基因频率。该snp突变位点g.678t＞c的基因及基因型频率统计结构如下表2所示。其中：(1)基因型频率是指群体中某一基因型个体数占基因型综述的比值：基因型频率＝某基因型总数/该群体总数×100％；(2)基因频率是指群体中某一基因占其同一位点全部基因的比值：基因频率＝某基因个数/群体中同一位点基因总数×100％。表2let-7b前体区突变位点g.678t＞c的基因及基因型频率统计由表2结构可以看出，tt基因型为待测鸡群体优势基因型。四、snp突变位点g.678t＞c与鸡的屠体性状、肉质性状和体尺性状的关联分析1、let-7b前体区g.678t＞c位点屠体性状关联分析如下表3所示。通过将g.678t＞c位点突变信息与屠体数据关联分析，其中该位点与腿胸比呈现极显著相关。多重比较结果显示cc基因型个体与tt基因型个体腿胸比极显著大于tc基因型个体。表3let-7b前体区g.678t＞c位点屠体性状关联分析2、let-7b前体区g.678t＞c位点肉质性状关联分析如下表4所示。通过将g.678t＞c位点突变信息与肉质数据关联分析，其中该位点与腿肌ph呈现显著相关。多重比较结果显示tc基因型个体腿肌ph极显著大于cc和tt基因型个体。表4let-7b前体区g.678t＞c位点肉质性状关联分析3、let-7b前体区g.678t＞c位点体尺性状关联分析如下表5所示。通过将g.678t＞c位点突变信息与体尺性状数据关联分析，其中该位点与56d胫长呈现显著相关。多重比较结果显示tc基因型个体56d径长显著大于cc和tt基因型个体。表5let-7b前体区g.678t＞c位点体尺性状关联分析上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。当前第1页12