一种基于磁珠法阴性去除血尿白细胞富集上皮细胞的方法与流程

本发明属于采样、接种或扩散样品的方法；物理分离完整细胞的方法领域，尤其涉及一种基于磁珠法阴性去除血尿白细胞富集上皮细胞的方法。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：膀胱癌、输尿管癌的诊断往往借助于膀胱镜或输尿管镜及病理或组织检查，病人依从度不高，传统的影像学(超声、ct等)发现肿瘤时往往处于中、晚期，治疗效果不好，预后较差。如何对泌尿系统移行细胞癌做出早期诊断和复发监测，已成为当前迫切需要解决的问题。膀胱癌在其发生发展过程中存在某些染色体的畸变，国内外研究显示，与膀胱癌有关的染色体异常主要有3、7、8、9、11、13、16、17号及y染色体等，膀胱癌的形成与发展在分子水平上主要表现为染色体多体改变或染色体上基因缺失，如3、7、17号染色体多体，9号染色体上p16基因缺失等。荧光原位杂交(fish)技术作为细胞分子遗传学的研究方法之一，近年来被用于染色体数目和结构畸变的检测，fish技术在膀胱癌的早期诊断与复发监测的临床应用亦成为近年研究的热点。fish脱落细胞染色体检查敏感性低、特异性高，无创尿液fish检查用于膀胱癌、输尿管癌的早期诊断尚有如下问题：尿液常受到血液细胞的干扰，这是制约检测方法灵敏度和特异性的瓶颈，需要建立稳定的去除尿液血细胞、富集上皮细胞的新技术。

综上所述，现有技术存在的问题是：尿液常受到血液细胞的干扰，血液细胞的增多，使得上皮细胞在所有细胞中的比例减少，如果不富集上皮细胞，最后经过前处理及荧光原位杂交后，在荧光显微镜下进行判读时，每个视野观察到的细胞中大多数均为白细胞，很难看到上皮细胞，上皮细胞数量不足导致很难观察到上皮细胞中的阳性细胞，即可能出现假阴性的情况，降低了fish方法检测脱落细胞染色体异常的敏感性。

解决上述技术问题的难度和意义：要想富集到更多的上皮细胞用于后续fish检测，很难采用阳性富集的方法，因为泌尿系统上皮细胞特异性标志物较少，不能通过阳性标志物进行富集；而阴性去除如果通过流式细胞仪等则很容易同时去除阳性细胞。因此，需要选择一种既能很好去除血源性细胞、又能很好保留上皮细胞的方法，才能提高后续fish检测的灵敏度。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于磁珠法阴性去除血尿白细胞富集上皮细胞的方法。

本发明是这样实现的，一种基于磁珠法阴性去除血尿白细胞上皮细胞富集的方法，所述基于磁珠法阴性去除血尿白细胞上皮细胞富集的方法，加红细胞裂解液，10分钟；1500g离心，10分钟，去上清液；细胞沉淀中加入cd45磁珠20微升，混匀，常温孵育1小时；磁场下处理5分钟，全部吸出液体到ep管中。cd45是白细胞特异的标志物，细胞沉淀中加入cd45磁珠进行孵育，通过抗原抗体反应，白细胞可以和cd45发生特异性结合，在磁场作用下，吸附了白细胞的磁珠被固定，而液体中上皮细胞和极少量(由上亿个白细胞减少到1000个以下)的白细胞保存下来进行后续检测，这极大去除了白细胞的干扰。

进一步，所述加红细胞裂解液之前需要：标本采集，收集至少200ml血尿标本置于离心管中，标本体积较多可反复离心；收集细胞，1500rpm，离心10分钟。

进一步，所述加红细胞裂解液之后需要：

步骤一，对液体进行胶原酶消化，即去上清，加入5ml胶原酶b溶液，用力吹打悬浮细胞，37℃水浴温育20-40分钟；

步骤二，对液体进行1500rpm，离心10分钟，并进行低渗；

步骤三，对细胞液体进行预固定，且1500rpm，离心10分钟；

步骤四，对细胞液体进行固定处理；

步骤五，重复步骤二；

步骤六，制备并保存细胞悬液；

步骤七，制片并老化玻片；

步骤八，对玻片进行预处理；

步骤九，在玻片上对细胞进行变性杂交；

步骤十，对玻片进行洗涤；

步骤十一，对玻片进行复染；

步骤十二，在显微镜下观察fish结果。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明通过引入磁珠去白细胞技术，可以将fish技术检测尿液脱落细胞诊断膀胱癌的灵敏度从80％提高到90％左右，具有重要临床意义。fish技术本身在检测膀胱癌方面具有一定优势，它利用荧光标记探针进行原位杂交，对晨尿标本脱落细胞进行检测，通过荧光显微镜进行观察，在以往膀胱癌筛查技术上提高了灵明度。但如果有白细胞的干扰，荧光显微镜一个视野下可能只能找到一个或几个上皮细胞，有时候甚至找不到上皮细胞，达不到计数要求，因此需要观察数个视野，才能找到足够的上皮细胞，这大大增加了工作量。本发明通过引入磁珠去白细胞技术，尽量减少白细胞的干扰，处理后白细胞从10⁷个降至1000个以下，这大大降低了白细胞的干扰。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于磁珠法阴性去除血尿白细胞上皮细胞富集的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的基于磁珠法阴性去除血尿白细胞上皮细胞富集的方法实现流程图。

图3是本发明实施例提供的本发明实施例提供的基于磁珠法阴性去除血尿白细胞上皮细胞富集密度对比示意图。

图中：a、处理前；b、处理后。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明建立基于磁珠法阴性去除血尿白细胞上皮细胞富集的方法技术，减少白细胞对上皮细胞的稀释干扰作用，提高尿液用于膀胱癌等泌尿系统肿瘤早期诊断的灵敏度和特异性。

如图1所示，本发明实施例提供的基于磁珠法阴性去除血尿白细胞上皮细胞富集的方法包括以下步骤：

s101：在采集的标本上收集细胞，并加入红细胞裂解液，放置10分钟；

s102：去样本1500g，10分钟后去上清液；

s103：细胞沉淀中加入stemcell公司cd45磁珠20微升，混匀，常温孵育1小时；

s104：磁场下处理5分钟，全部吸出液体到ep管中；

s105：对液体进行胶原酶消化，即去上清，加入5ml胶原酶b溶液，用力吹打悬浮细胞，37℃水浴温育20-40分钟；

s106：对液体进行1500rpm，离心10分钟，并进行低渗；

s107：对细胞液体进行预固定，且1500rpm，离心10分钟；

s108：对细胞液体进行固定处理；

s109：重复s106；

s110：制备并保存细胞悬液；

s111：制片并老化玻片；

s112：对玻片进行预处理；

s113：在玻片上对细胞进行变性杂交；

s114：对玻片进行洗涤；

s115：对玻片进行复染；

s116：在显微镜下观察fish结果。

作为本发明的优选实施例，所述s101的标本采集如下：收集至少200ml血尿标本置于离心管中，标本体积较多可反复离心。

作为本发明的优选实施例，所述s101收集细胞后对细胞进行1500rpm，离心10分钟。

作为本发明的优选实施例，所述s107的预固定过程为：直接于细胞低渗混合液中缓慢加入2ml固定液，混匀。

作为本发明的优选实施例，所述s108的固定过程为：去上清，加入5ml固定液，混匀，静置10分钟。

作为本发明的优选实施例，所述s108固定处理后，对细胞液体进行1500rpm，离心10分钟。

作为本发明的优选实施例，所述s110制备和保存过程如下：去上清，根据细胞量加适量固定液，制成浓度合适的细胞悬液，混匀后滴片，此细胞悬液置于-20℃冰箱中可保存1个月，在此期间可随时取出，离心去上清加入新鲜固定液，制片供fish检测之用。

作为本发明的优选实施例，所述s111的制片过程如下：用吸管将细胞悬液轻轻吹打混匀后吸取少量，滴至干净的载玻片上，自然晾干。剩余标本置于-20℃冰箱备用。

作为本发明的优选实施例，所述s111的老化玻片过程如下：室温放置过夜或56℃烤片至少30分钟，玻片放入片盒中，室温干燥保存。

作为本发明的优选实施例，所述s112的预处理过程如下：

(1)将40ml0.01mhcl倒入一考普林瓶中并置于37℃水浴箱中预热；

(2)室温下于2×ssc溶液中漂洗玻片2次，每次5分钟；

(3)将0.8mg胃蛋白酶粉剂溶于预热至37℃的40ml0.01mhci，混匀，制备成最终浓度0.02mg/ml的胃蛋白酶工作液。将玻片置于37℃胃蛋白酶工作液中浸泡10分钟；

(4)室温下于2×ssc溶液中漂洗玻片2次，每次5分钟；

(5)室温下于甲醛固定液中固定10分钟；

(6)室温下将玻片依次置于70％乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2分钟脱水，自然干燥玻片；

(7)加热玻片至56℃。

作为本发明的优选实施例，所述s113的变性杂交过程如下：

(1)将10μl探针混合物(7.0μl杂交缓冲液+1.0μl去离子水+2.0μl探针涡旋混匀后短暂离心)滴加于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边；

(2)准备杂交仪器和提供共变性条件：75℃，5分钟；杂交条件：42℃，16小时。

作为本发明的优选实施例，所述s114的玻片洗涤过程如下：

(1)移去盖玻片，立即将玻片置于3瓶50％甲酰胺/2×ssc溶液(46±1℃水浴箱中)中各漂洗10分钟，振荡1-3秒；

(2)将玻片置于2×ssc溶液中(46±1℃水浴箱中)，漂洗10分钟，振荡1-3秒；

(3)将玻片置于0.1％np-40/2×ssc溶液中(46±1℃水浴箱中)，漂洗5分钟，振荡1-3秒；

(4)将玻片室温浸泡在70％乙醇中(室温下)，漂洗3分钟。

作为本发明的优选实施例，所述s115的复染过程如下：

(1)暗处自然干燥玻片；

(2)将15μldapi复染剂滴加于杂交区域位置，立即盖上盖玻片，暗处放置10-20分钟后，在荧光显微镜下选用合适的滤光片组观察玻片；

(3)完成杂交的玻片置于-20℃避光储存，为了长期保存还可以用中性树胶将加盖的盖玻片四周密封，防止反复观察移动盖片。

作为本发明的优选实施例，所述s116的观察过程如下：

(1)在10×物镜下，于fish标本玻片上找到细胞区域；

(2)在40×物镜下扫描整个杂交区域，观察标本的质量，满意的标本应是75％以上细胞核中都有杂交信号；

(3)在100×物镜下观察膀胱上皮脱落细胞的fish；

(4)结果并进行信号计数：glpp16(红色)，csp17(绿色)；或者csp3(绿色)，csp7(红色)。

(5)计数细胞：100个膀胱上皮脱落细胞。

证明部分(具体实施例/实验/仿真)

如图3所示，处理前箭头所示为脱落的上皮细胞，其他均为混入的血液细胞，而标本经磁珠去白细胞技术处理后，白细胞大量减少，上皮细胞所占比例明显增加，明显有助于结果的判断。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。