一种分离的鱼类抗病毒蛋白基因CMPK2及其抗病毒活性的制作方法

文档序号：17068148发布日期：2019-03-08 23:05阅读：557来源：国知局

本发明属于淡水鱼类基因工程技术领域，具体涉及一种分离的鱼类抗病毒蛋白基因cmpk2及其抗病毒活性的鉴定。

背景技术：

鲤春病毒血症，是由鲤春病毒血症病毒(svcv)引起的一种重要水生动物疾病，属于国际兽疫局(oie)规定必须申报的动物疫病。在我国，农业部也将之列为二类动物疫病。svcv是一种弹状病毒。现被列为弹状病毒科、水泡口炎病属的暂定成员。该病毒感染有很高的死亡率，造成巨大的经济损失。鱼苗一旦感染此病，表现为游动缓慢，兴奋度变低，停留在池塘底部或聚集在水中，反应迟钝并直至死亡。病鱼在外观上主要表现为体内出血、腹膜炎、内脏出血斑点。同时，svcv能感染青鱼、草鱼、链鱼、鳙鱼和其他几种鲤科鱼。因此，svc一直是国际上高度关注的一种鱼类病毒性传染病。我国目前没有大规模爆发该病的报道。但已有文献报道我国已从未出现任何症状的鲤鱼、金鱼等观赏性鱼中分离鉴定出svcv。这对我国观赏鱼类的出口造成了极为严重的影响。因此，加强svcv的抗病毒研究，寻求有效的预防和治疗方法是当务之急。

天然免疫，即固有免疫或先天性免疫，是机体与生俱来的能够抵御微生物或外来异物侵袭的生理机能，是机体自身防御的第一道防线，具有快速反应性、非特异性、普遍性、多样性等特点。抗病毒蛋白是动物细胞中的一种重要的免疫组分，在抗病毒天然免疫中，其重要作用就是拮抗病毒的侵染，从动物组织和细胞中分离的抗病毒蛋白对于生物农药的应用具有重要作用。

cmpk2，即尿甘酸-胞苷酸激酶2(ump-cmpk2)，人类cmpk2是一种线粒体ump-cmp激酶，cmpk2属于一种新的核苷单磷酸激酶家族，与胞质ump-cmp激酶相比，它更接近胸苷酸激酶，其c端结构域含有核苷单磷酸激酶的所有共有基序。亚细胞定位显示ump-cmpk2位于hela细胞的线粒体中，并且线粒体靶向信号包含在n-末端22个氨基酸中。atp作为磷酸盐供体能使磷酸化dump，dcmp，cmp和ump，但动力学性质与胞质ump-cmpk相比不同，其磷酸化dump的效力最高，其次是dcmp，对而cmp和ump的磷酸化效力较弱。人类ump-cmpk2由449个氨基酸组成，约为ump-cmpk大小的两倍。根据序列特性可将其分成两个结构域：n端结构域和c端结构域。参与磷酰基转移的所有基序位于c-末端结构域，而没有可用数据显示n-末端结构域的功能。研究发现，cmpk2共有13个半胱氨酸，其中9个在聚集在最初的189个氨基酸残基中，这表明该区域可能具有复杂的三级结构，具有氧化还原活性或其他特征。cmpk2中60％以上的亮氨酸，丙氨酸，脯氨酸和甘氨酸位于n-末端结构域，但是并没有发现亮氨酸拉链结构域，并且与富含亮氨酸的性质相反，在该结构域中没有异亮氨酸，所以富含亮氨酸的n端结构域可能具有特殊的性质，如蛋白-蛋白相互作用，这将有待进一步研究。以上可知，ump-cmpk2的两个不同结构域：功能未知的n-末端结构域和具有核苷单磷酸激酶功能的c-末端结构域，表明ump-cmpk2可能除了核苷单磷酸激酶活性以外的具有其他生物学功能的双功能蛋白质，最新研究表明，cmpk2在已知抗病毒蛋白viperin抗病毒作用中起到协同的作用，并且过表达cmpk2可以增强干扰素对hiv的抑制效果。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种鱼类抗病毒蛋白cmpk2的核苷酸序列和氨基酸序列，同时研究该蛋白在鱼类抗病毒过程中的应用。

本发明通过克隆技术在黑头呆鱼(pimephalespromelas)肌肉细胞系(fhm)中分离得到一种抗病毒蛋白基因cmpk2，其核苷酸序列是seqidno:1中第1-1251bp所示的序列。

申请人同时得到该分离的黑头呆鱼抗病毒蛋白基因cmpk2，该基因编码的氨蛋白质序列如seqidno:2所示。

生物功能验证表明本发明分离克隆的cmpk2蛋白基因的表达可以影响鲤春病毒血症病毒(svcv)的增殖，且cmpk2蛋白在svcv的生活周期中发挥着重要作用。本发明的基因或蛋白为制备抗svcv药物的研究提供了新的靶点。

更详细的技术方案和发明效果参见《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表seqidno：1是黑头呆鱼抗病毒蛋白基因cmpk2的核苷酸序列(1-1251bp)，序列全长为1251bp,其中该序列的第1-1248bp也是该基因的编码区(cds)。

序列表seqidno：2是黑头呆鱼抗病毒蛋白基因cmpk2编码的蛋白质序列。

图1.cmpk2基因扩增结果。附图标记说明：泳道m：dnamarker2000；泳道1：cmpk2片段

图2.利用间接免疫荧光法检测cmpk2转染后的表达情况。附图标记说明：图2中的a图为转染pcdna4^tm-/to/-myc-hisa的对照组：图2中的b图为转染pcdna4^tm-/to/-cmpk2-myc-hisa的实验组。

图3.利用免疫印记法检测cmpk2过表达情况。

图4：病毒滴度测定结果。附图标记说明：pcdna4^tm-/to/-cmpk2-myc-hisa/pcdna4^tm-/to/-myc-hisa转染fhm细胞24小时后，用0.1moi的svcv感染，并在感染后6，12，24小时分别收取实验组和对照组的上清液，进行病毒滴度测定。

图5：是本发明应用的pcdna4^tm/to/-myc-hisa空载体的图谱(5151bp)。

图6：本发明制备的重组表达质粒pcdna4^tm-/to/-cmpk2-myc-hisa(6351bp)图谱。

具体实施方式

实施例1

(1)fhm细胞rna提取

取状态良好的fhm铺板于6孔板，24小时候弃上清，加入1mltrizol试剂，置于1.5mlrnase-freeep管中。

加入200ul氯仿溶液，涡旋振荡混匀，冰上静置5分钟。

4℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为有机相，上层为无色水相和一个中间层。

将水相转移到新管中，加入等体积的异丙醇，点到混匀，冰上静置10分钟，4℃，10000×g离心10分钟。去上清液，加入75％的乙醇洗涤沉淀。

4℃，10000×g离心5分钟，向离心管中加入适量无rna酶的水溶解rna，-80℃备用。

(2)反转录获取总cdna

采用宝生物工程大连有限公司的(即，takara)反转录试剂盒，按照试剂盒的说明书操作，具体步骤如下：

取5×gdnaeraserbuffer2ul，gdnaeraser1ul，上述所提rna1ug，加入到rna反转录专用ep管中，加入适量无rna酶水，补足体系至10ul。42℃，2分钟，马上置于冰上。

向上述10ul反应液中，加入5×primescriptbuffer24ul，primescriptrtenzymemixⅰ1ul，rtprimermix1ul，以及适量的无rna酶水补足体系至20ul。37℃，15分钟；85℃，5秒；4℃温育。即获得总cdna。

(3)黑头呆鱼cmpk2基因扩增

以genbank数据库斑马鱼cmpk2基因(genbank:xm_693963.8)和黑头呆鱼参考基因组(genbank:jnce00000000.1)为参照，设计特异性引物，以cdna为模版进行扩增。

并分别在上、下游引物中加入kpni、xhai酶切位点，下游引物去掉终止密码子，上游引物为：5'-ggggtaccatgctacggagagcaatg-3',下游引物为：5'-gctctagacaagtggcatttgttcctaat-3'(下划线部分为酶切位点)。pcr扩增程序为：98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min，共35个循环。

pcr反应体系(25μl)如下：primestarmaxpremix12.5μl，cdna模板4μl，上述上游引物(10μm)1μl，上述下游引物(10μm)1μl，，适量ddh2o补足体系至25μl。扩增结果如图1所示。

(4)cmpk2片段的纯化回收

用dna回收试剂盒(hipuregelpurednaminikitmagen，按照试剂盒的说明书操作)回收纯化cmpk2的pcr产物或酶切产物。步骤如下：

①配制合适浓度的琼脂糖凝胶，电泳分离dna片段。当dna片段分离后，把凝胶放置于紫外灯下，快速切下含目的dna片段的凝胶，并尽量去除多余的凝胶。

②称取凝胶块的重量，并转移至1.5ml离心管中。按100mg凝胶块相当

100μl体积计算，加入等倍体积buffergdp。55℃水浴5分钟，让凝胶块完全溶解。水浴期间，颠倒混匀2次加速溶胶。短暂离心收集管壁上的液滴。

③将hipurednacolumn套在2ml收集管中。把≤700μl溶胶液转移至柱子中。12,000×g离心30～60秒。

④倒弃滤液，把柱子套回收集管中。加入300μlbuffergdp至柱子中。静置1分钟。12,000×g离心30～60秒。

⑤倒弃滤液，把柱子套回收集管中。加入600μlbufferdw2(已用无水乙醇稀释)至柱子中。12,000×g离心30～60秒。

⑥重复步骤⑤。

⑦倒弃滤液，把柱子套回收集管中。12,000xg离心2分钟。

⑧打开柱子的盖子，空气干燥10～15分钟以彻底去除乙醇。

⑨把柱子套在1.5ml离心管中，加入20μlelutionbuffer至柱子膜中央。放置2分钟。12,000×g离心1分钟。丢去柱子，把dna保存于-20℃。

(5)构建重组表达质粒pcdna4^tm-/to/-cmpk2-myc-hisa

分别将pcdna4^tm/to/-myc-hisa空载体(购自invitrogen公司)，结构如图5所示，和回收的cmpk2基因用kpni/xhai双酶切，反应体系如下：pcdna4^tm/to/-myc-hisa空载体/cmpk2回收片段，2μg；kpni，1μl；xhai，1μl；10×hbuffer，2μl；以ddh2o补至20μl，置37℃反应2-3h后，回收备用。

双酶切后，将回收的pcdna4^tm/to/-myc-hisa空载体和cmpk2基因在t4dna连接酶作用下，进行连接反应，反应体系(20μl)如下：cmpk2基因，150ng；pcdna4^tm/to/-myc-hisa载体，50ng；10×t4dnaligasebuffer，2μl；t4dnaliagse(350u/μl)，1μl；以ddh2o补至20μl，22℃反应30分钟。

(6)连接产物的转化

将连接产物转化大肠杆菌感受态dh5α：取50μl冰浴融化的感受态细胞于1.5ml灭菌离心管中，加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；于42℃水浴中热激60s，快速转移到冰浴中2min(该过程不要摇动离心管)；向每个离心管中加入500μl无菌lb培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床上，180r/min培养1h，使细菌复苏；5,000r/min室温离心3min，弃去上清约300μl，剩余的重悬后，加到含amp⁺抗性的lb琼脂培养基上，均匀涂开；将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃培养过夜

(7)重组表达质粒pcdna4^tm-/to/-cmpk2-myc-hisa的小量制备

挑取平板上的单菌落，接种到3ml的lb中，加入3ul氨苄青霉素使终浓度为50ug/ml。置于37℃摇床上，180r/min培养过夜；于1.5ml离心管中，10,000g室温离心1min以收集菌种；倒出培养基，用质粒小提试剂盒(购买于omega公司)提取质粒，具体步骤如下：在沉淀中加入250μlsolutioni(omega公司质粒小提试剂盒自带)，漩涡振荡使细胞完全悬浮；在重悬液中加入250μlsolutionii(omega公司质粒小提试剂盒自带)，轻轻颠倒混匀7-10次，室温放置5-10min；加入350μlsolutioniii(omega公司质粒小提试剂盒自带)，温和地上下颠倒离心管数次混匀；10,000g室温离心10min；将柱子装在2ml的收集管上，小心转移上清液至柱子中；10,000g室温离心1min，使上述混合液完全流过柱子，弃去收集管中的液体；把柱子重新装在2ml收集管中，加入500μlhbbuffer到柱子中，10,000g室温离心1min洗涤柱子；弃去收集管中的液体，加入700μldnawashbuffer至柱子上，10,000g室温离心1min，弃去洗涤液，重复该步骤；10,000g室温离心空柱2min；把柱子置于一个干净的1.5ml离心管上，加入20μlelutionbuffer，室温下静置2min；10,000g，室温离心1min，离心管中的液体即为提取的重组表达质粒pcdna4^tm-/to/-cmpk2-myc-hisa，于-20℃保存备用。重组表达质粒pcdna4^tm-/to/-cmpk2-myc-hisa的结构如图6所示。

(8)利用重组表达质粒pcdna4^tm-/to/-cmpk2-myc-hisa/空载体pcdna4^tm-/to/-myc-hisa转染fhm细胞

按照hd转染试剂试剂盒操作步骤进行。具体步骤如下：

①转染前1天，在6孔细胞培养板接种细胞，待fhm细胞单层长至80％左右，准备转染。

②hd转染试剂恢复至室温，在1.5ml无菌ep管中加入200ulopti-mem无血清培养基，再依次加入2ug质粒和5ul转染试剂，轻轻混匀，室温静置10分钟。

③将混合液滴加到细胞单层上，轻轻摇匀。于28℃培养箱中培养。

转染24小时后，利用间接免疫荧光和免疫印记实验检测cmpk2蛋白表达情况。

具体操作如下：

(9)间接免疫荧光实验(ifa)

①将待检测的转染细胞fhm用磷酸盐缓冲液(简称pbs，购买于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)洗涤3次，每次5min。

②100％甲醇室温固定10min，pbs洗涤3次，每次5min。

③用封闭液(含1％牛血清白蛋白(bsa)的pbs)封闭60min，用pbs洗涤3次，每次5min。

④加入封闭液适宜(见后)稀释的鼠源一抗(购买于abclonal公司；抗his标签；以体积比为1：1000稀释抗体即一抗)，孵育2h，用pbs洗涤3次，每次5min。

④加入封闭液适宜(见后)稀释的兔抗鼠荧光二抗(购买于invitrogen公司；以体积比为1：500稀释抗体即二抗)，孵育45min，用pbs洗涤3次，每次5min。

⑥加入适量pbs，防止干样。在激光共聚焦显微镜下观察转染细胞的荧光并照相。结果如图2所示，表明cmpk2表达结果良好。

(10)免疫印记实验(westernblot)：

①配胶：分离胶及浓缩胶的配制参见表1。

表1sds-page分离胶配方表

表2sds-page浓缩胶(5％acrylamide)配方表

②倒胶：夹好灌制聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板，将制好的sds丙烯酰胺分离胶约5ml迅速灌入两玻板的间隙中，留出灌注积层胶所需空间，在分离胶上加入一层异丙醇，置室温聚合约45min，当分离胶聚合后，倾出覆盖层液体，用去离子水洗凝胶顶部数次，用吸水纸吸净残留液体，再将刚配好的积层胶灌入分离胶上，立即插入梳子，置室温聚合约45min，待胶全部聚合后移出梳子，用电泳缓冲液(1×tris-甘氨酸)洗去加样槽的残留液体，用针头拨掉加样槽的胶将齿弄直，固定于电泳装置。

③电泳：往电泳装置加入适量1×tris-甘氨酸电泳缓冲液(3.03g，tris；18.8g，glycine；sds,1g，溶于1l去离子水中)，取处理好的样品上样，每孔约10μl。接通电源，电压调到80v，待溴酚蓝指示剂跑到分离胶时，将电压调到120v，等溴酚蓝指示剂跑到分离胶底部时(大约需2h)断电，结束电泳。

④电转：当sds‐page电泳结束后，取sds‐page电泳后的凝胶，不经染色，直接用转膜装置将蛋白转至pvdf膜上。

⑤9v电压下转膜35分钟。

⑥封闭：将pvdf膜置于封闭液(含1.5％bsa的tbst)中，平放于摇床上室温平缓摇动温育2h。

⑦一抗(鼠源抗his标签，购买于abclonal公司)孵育pvdf膜：把pvdf膜放入新的封闭液中，一抗(鼠源抗his标签)按照体积比为1：1000稀释，平放于摇床上室温下温育2h。将pvdf膜用tbst漂洗4-6遍，每次5-10min。

⑧二抗(羊抗鼠igg)孵育pvdf膜：把pvdf膜放入新的封闭液中，加入适宜稀释的二抗(羊抗鼠igg；体积比为1：1000)，平放于摇床上室温温育45分钟。再将pvdf膜用tbst漂洗4-6遍，每次5-10min。

⑨显色：将pvdf膜放入化学发光底物的a和b液(购买于bio‐rad公司)的等量混合液中进行避光显色，用化学发光成像系统进行照相。

免疫印记结果如图3所示，表明cmpk2过表达效果良好。

(11)svcv病毒滴度测定

转染24小时后，用0.1moi的鲤春病毒血症病毒(svcv)感染上述实验组和对照组fhm细胞,并在感染后6，12，24小时分别收取实验组和对照组的上清液，通过空斑滴度测定实验进行svcv病毒滴度测定。具体操作如下：

①将长满单层的fhm细胞消化后接入12孔板中，每孔接入500μl；

②第二天，在1.5ml的ep管中，用m199培养基(购于hyclone)将svcv病毒液作连续10倍的稀释，从10^-1-10^-7；

③将稀释好的10^-3到10^-6浓度的svcv病毒接种到12孔板中，每组三个重复；25℃温育1小时，用无菌pbs清洗一次，换成3％cmc半固体培养基。

④72小时后观察病变情况，在每孔中加入1ml的半固体培养基室温过夜。

⑤将培养板中的固定液和培养基弃去，用水缓缓将每孔冲洗干净，再向每孔中加入1ml结晶紫染色液，室温静置约3小时。

⑥空斑计数，弃染色液，用水缓缓冲洗干净，室温晾干后进行空斑计数。

⑦计算毒价方法：pfu＝10^a*b*(1/c)

式中：a＝病毒稀释倍数；b＝计数孔的空斑个数；c＝计数孔接毒的体积(ml)；

重复上述实验3次，所得结果如图5所示：在6h，12h，cmpk2组相比于对照组，cmpk2组病毒滴度较低，显示cmpk2对病毒增殖有明显抑制作用。

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种分离的鱼类抗病毒蛋白基因cmpk2及其抗病毒活性

<141>2018-10-17

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1251

<212>dna

<213>黑头呆鱼(pimephalespromelas)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1251)

<220>

<221>cds

<222>(1)..(1251)

<400>1

atgctacggagagcaatgtttcgcagtggagagctgtgttcgcgtgtt48

metleuargargalametpheargserglygluleucysserargval

151015

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202530

agctcaagcccacaggttctccatcatgatcaccaacagctctttgga144

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<211>416

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