检测核酸内切酶存在的方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种检测核酸内切酶存在的方法。

背景技术：

以聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)技术为代表的各种酶所催化的生化反应是当前生物技术进步和发展的基础，在这些反应中，各种工具酶起到了至关重要的作用。而工具酶的大规模化生产既带来了便利，也有一些无法避免的问题。例如在工具酶的生产过程中，会由于其工艺等方面的原因，使最终的产品或多或少带有一定量核酸酶等蛋白残留。而在pcr等反应体系中，极微量的核酸酶残留就有可能导致模板或者引物被切割，这通常会使反应无法得到正确的产物，或者造成产物量下降等后果。

因此，对于大部分的工具酶而言，通常会根据其性质及应用方向对其进行一系列的质检工作。内切酶污染的检测是必须的项目之一，但当前的检测方法限于技术、仪器等方面的原因，一方面需要对质粒模板进行长时间处理后再进行凝胶电泳检测，导致检测周期较长，而且该方法在结果的判读方面也不精确，在检测过程中，通常由于结果判读的原因导致重复检测的进行，由此需要耗费大量的时间去检测工具酶是否含有内切酶污染，极大的延长了样本的检测周期，影响了后续的实验进度。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于解决现有技术结果判断不准确的问题。

本发明的目的之二在于解决现有技术耗费时间太长的问题。

具体的，本法的技术方案包括：

将待检测样品与闭合环状dna共孵育，并使用核酸外切酶对共孵育产物进行酶切；

通过电泳带型差异判断所述核酸外切酶能否酶切所述共孵育产物，若能够酶切，则所述待检测样品含有核酸内切酶。

本发明主要改进方式是向现有的检测体系中引入了一种核酸外切酶，因其不会对模板本身进行消化，但如果待检测样品中存在内切酶污染，则体系中额外引入的核酸外切酶就会对被样品中残存的内切酶切割的线性核酸片段进行消化，从而放大内切酶污染的反应效果，使结果更加容易辨别。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明同也降低了模板使用量并缩短了反应时间，调整后的检测方法与目前通用的检测手段保持一致，进一步提高了结果的可信度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中在琼脂糖凝胶上检测t5核酸外切酶消化线性dna效率测试得结果；其中，泳道1/2/3/4分别为t5核酸外切酶-1/2/5/10u+ecorⅰ限制性内切酶-1u，泳道5为t5核酸外切酶-10u，泳道6为ntc(水)，泳道m为100bpladder；

图2为本发明一个实施例中在琼脂糖凝胶上检测工具酶样品内切酶污染情况检测结果；其中，泳道1/2/3/4/5/6分别为检测工具酶样品，7为阳性对照既t5核酸外切酶-1u+ecorⅰ限制性内切酶-1u，泳道8为t5核酸外切酶-10u，泳道9为ntc(水)，泳道m为100bpladder。

具体实施方式

除非另有限定，本发明使用的所有技术和科学术语具有与所公开的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本发明所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本实施方式的实践或测试中，但下文仍然描述了合适的方法和材料。本发明提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用全部内容结合于本文中。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将起支配作用。此外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的，而不旨在限制。实施方式的其他特征和优点将从以下详细的说明书和权利要求中变得明显。

为了促进理解本文描述的实施方式这一目的，将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述这些实施方式。本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式目的，而不旨在限制本公开的范围。

本发明涉及一种检测核酸内切酶存在的方法，包括：

将待检测样品与闭合环状dna共孵育，并使用核酸外切酶对共孵育产物进行酶切；

通过电泳带型差异判断所述核酸外切酶能否酶切所述共孵育产物，若能够酶切，则所述待检测样品含有核酸内切酶。

所述共孵育的条件能够使得所述待检测样品中可能存在的核酸内切酶发挥酶切dna的活性，并产生足量的可供比较的酶切产物。

超螺旋及开环质粒呈现闭合的环状形态，一般外切酶无法对其进行消化,向检测体系中同时添加一定量的核酸外切酶，如果工具酶中存在内切酶污染，则残留的内切酶会对环状质粒进行切割形成切口或切刻，此时额外添加的核酸外切酶会对质粒进行消化，则待检样品体系里的质粒会发生比较明显的形态变化,在进行凝胶电泳时，目的条带呈现出与阴性对照差异较大的结果，大致可表现为无条带检出、主带亮度减弱、带型发生明显变化(即超螺旋带变为开环带)。

在一些实施方式中，可将待检测样品、闭合环状dna、核酸外切酶混合孵育，即所述共孵育与核酸外切酶的酶切在同一反应体系下进行；也可以先将待检测样品与闭合环状dna共孵育，待(可能发生的)内切酶酶切反应完成后，再向反应体系中添加核酸外切酶进行酶切，即两个反应在不同的反应体系下进行。

在一些实施方式中，所述共孵育和/或核酸外切酶酶切的温度可选择15℃～40℃，或者20℃、25℃、30℃、35℃，最优可选择37℃；

所述共孵育和/或核酸外切酶酶切的时间可选择0.1h～24h，也可以选择0.5h，1h，2h，3h，4h，6h，8h，12h，16h。

所述共孵育和/或核酸外切酶酶切的条件可由待检测样品中需要检测的核酸内切酶类型(如果有感兴趣的目标)以及所选择的核酸外切酶类型进行调整，这对于本领域技术人员是容易的。

在一些实施方式中，所述核酸内切酶为分解dna的核酸内切酶。

在一些实施方式中，当所述核酸内切酶为识别并切断特定的碱基或碱基序列的酶时，所述闭合环状dna上带有该特定碱基或碱基序列。

在一些实施方式中，所述通过电泳带型差异判断所述核酸外切酶能否酶切所述共孵育产物的方法包括：

设置不含所述待检测样品的阴性对照，比较阴性对照与实验组之间是否产生电泳带型差异；

或，比较所述核酸外切酶对所述共孵育产物进行酶切前后是否产生电泳带型差异。

其中，根据实验常识，阴性对照与实验组(待检测样品与闭合环状dna、核酸外切酶共孵育体系)除是否含有所述待检测样品外，其余处理条件均相同；

阴性对照中，所述待检测样品可替换为等量的水，或者其他不影响酶切效率的缓存溶液。

容易知晓的是，阴性对照与实验组中，除检测样品外，均不含有额外的核酸内切酶，或者仅含有不影响检测结果含量的核酸内切酶(例如痕量)。

比较所述核酸外切酶对所述共孵育产物进行酶切前后是否产生电泳带型差异时，可以将酶切前的样品分为两组，一组加入所述核酸外切酶，另一组作为对照；

根据实验常识，对照后续的处理条件最好与实验组(加入所述核酸外切酶的组)相同。

在一些实施方式中，所述闭合环状dna大小为2000bp-4000bp；

在一些实施方式中，所述闭合环状dna大小还可以选择2500bp，3000bp，3500bp。

闭合环状dna片段长度适中，可以快速有效的被核酸外切酶消化，便于进行结果的判读。

在一些实施方式中，所述闭合环状dna中超螺旋带型占整体的90％以上，还可以选择91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或，100％。

超螺旋带型占比高的话，反应后可以根据产物带型的变化直观的判断结果，差异更为显著，这点便于后续的分析。

在一些实施方式中，所用质粒优选的为商业质粒的空载体。

选用商业质粒的空载体一方面其能够有效的进行转化、培养并大量提取，另一方面其具有各种限制性内切酶酶切位点可供反应，也可以检测一些限制性内切酶污染。

在一些实施方式中，所述闭合环状dna为pmd18-t质粒空载体。

核酸外切酶是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化水解3、5-磷酸二酯键，降解核苷酸的酶。其水解的最终产物是单个的核苷酸。按作用的特性差异可以将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。

在一些实施方式中，所述核酸外切酶具有3’→5’和/或5’→3’的核酸外切酶活性。

在一些实施方式中，所述核酸外切酶选择在短时间内(例如4h以内，或30min～2h)完全消化1微克线性dna的核酸外切酶，这一点可以保证反应的有效进行。

在一些实施方式中，所述核酸外切酶选自绿豆核酸酶、λ核酸外切酶、t5核酸外切酶中的一种或多种。

值得注意的是,在最适的反应条件下,所用的核酸外切酶本身不会对非线性的质粒模板产生影响。因此，最优选的是t5核酸外切酶。

在一些实施方式中，所述待检测样品为工具酶，所述工具酶不包括所述核酸内切酶。

在一些实施方式中，所述待检测样品选自rna酶、连接酶、聚合酶、修饰酶中的任一种。

在一些实施方式中，所述待检测样品为限制性内切酶；

前提是所述核酸内切酶为不具碱基特异性的酶，或为与所述待检测样品酶切位点不同的限制性内切酶，且所述闭合环状dna不含有所述待检测样品的酶切位点但含有所述核酸内切酶的酶切位点。

在一些实施方式中，所述核酸内切酶为不具碱基特异性的核酸内切酶。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

t5核酸外切酶消化线性dna效率测试

在本实施例中，t5核酸外切酶消化线性dna效率测试方案具体如下：

向反应体系中同时添加t5核酸外切酶以及ecorⅰ限制性内切酶对1μgpmd8-t质粒模板进行消化并进行琼脂糖凝胶电泳检测：

反应体系配制:

反应条件:37℃，30min

反应结果如图1所示。分析结果得到以下几点：

1u的t5核酸外切酶可以在30min完全消化1μg的线性化dna片段；

t5核酸外切酶在适合的反应条件下对超螺旋质粒无明显作用；

ecorⅰ限制性内切酶和t5核酸外切酶可以在同一体系内进行反应，切割及消化速率均较好

实施例2

检测工具酶样品中的内切酶污染情况

在本实施例中,检测工具酶样品中的内切酶污染情况的方案如下：

向反应体系中加入待检样品及t5核酸外切酶，同时设置阳性(ecorⅰ)、阴性(水/t5核酸外切酶)对照，对1ugpmd8-t质粒模板进行消化并进行琼脂糖凝胶电泳检测：

反应体系配制：

反应条件：37℃，4h

反应结果如图2所示。分析结果得到以下几点：

待检样品1/2号与阴性对照结果一致，超螺旋质粒带完好，亮度一致且无弥散带出现，说明其无内切酶污染；

待检样品3/4/5/6超螺旋带型均发生不同程度变化，条带亮度降低，且呈现弥散状，认为样品中存在一定程度的内切酶污染，判断样品不合格，应重新进行生产并改进工艺。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。