阿司匹林个体化用药基因检测试剂盒及检测方法与流程

本发明属生物技术领域，具体涉及检测阿司匹林个体化用药基因检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

阿司匹林是解热镇痛非甾体抗炎药，主要通过抑制前列腺素、缓激肽、组胺等的合成，产生解热镇痛和抗炎作用。解热作用机制是通过作用于下丘脑体温调节中枢使外周血管扩张，皮肤血流增加，散热增加从而达到降温作用，其镇痛作用为外周性镇痛药；阿司匹林也是常用的抗血小板聚集药物，它通过抑制血小板的环氧化酶，减少前列腺素的生成，而使血小板凝聚发生抑制作用，临床上广泛用于降低急性心肌梗死疑似患者的发病风险、预防心肌梗死复发、中风的二级预防、降低短暂性脑缺血发作tia及其继发脑卒中的风险、降低稳定性和不稳定性心绞痛患者的发病风险等。

阿司匹林作为一种有效的抗血小板聚集药物广泛应用于心脑血管疾病的防治，临床观察显示阿司匹林可减少高危患者心肌梗死、心源性猝死，但不是所有患者都能从阿司匹林治疗中获益，有研究显示有些接受阿司匹林治疗的患者仍发生缺血性血管事件。

临床发现部分患者尽管长期低剂量服用阿司匹林仍不能有效抑制血小板的活性，有心血管事件的发生，这种现象被称为阿司匹林抵抗(ar)，其发生率约5％-60％。血小板整联糖蛋白ⅱb/ⅲa(gpiⅱb/ⅲa)在血管损伤部位血小板聚集和急性血栓形成中起重要作用。研究表明，基因多态性在阿司匹林抵抗中起着重要作用，主要集中在gpiⅱap1a1/a2、cox和pear1基因多态性。

环氧合酶(cyclooxygenase,cox)是合成前列腺素的限速酶。目前已知的有三个cox同功酶：cox-1、cox-2和cox-3。在药理上，抑制cox可以减轻炎症的疼痛症状。阿司匹林的作用机制主要是抑制cox的活性。研究表明，cox-1基因多态性可能通过妨碍阿司匹林对其乙酰化，影响作用效果。有研究发现，汉族人cox-1基因a842g位点的单核苷酸多态性可能与ar的发生有关，ag和gg基因型的患者更容易发生ar。

gpiiiapla2是阿司匹林抵抗主要基因，这个基因突变使得gpiib/iiia受体结构发生变，使血小板之间发生交叉连接，导致血小板聚集。研究发现携带突变型p1a2等位基因患者行支架术后，其亚急性血栓事件发生率是p1a1纯合野生型患者的5倍，一般需要更高剂量的阿司匹林才能达到抗凝效果。发生阿司匹林抵抗患者携带p1a2等位基因的频率明显高于阿司匹林敏感患者，且p1a2/a2纯合突变型患者服用阿司匹林后疗效均不良。

pear1是表达在血小板和内皮细胞上的ⅰ型膜蛋白。该受体的磷酸化可能促进αⅱbβ3信号的激活放大，使大量血小板脱颗粒，引起血小板之间不可逆的聚集反应。中国人群中pear1野生型g基因的基因频率为0.61，突变a基因的基因频率为0.39。突变基因型aa或ag的患者使用阿司匹林时的心肌梗死发生率和死亡率会增高。

现有技术主要存在如下技术问题：缺少一种针对中国人群的、且检测灵敏度高准确率高的阿司匹林个体化用药基因检测试剂盒。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种采用dna测序技术检测阿司匹林个体化用药基因检测试剂盒，可以解决现有技术的技术问题：1)本发明涉及的基因位点是从药物基因组学数据库(pharmgkb)的研究成果中筛选出关于中国人群分布频率较高的基因位点，因此这些基因位点具备一定的权威性和科学性；2)本试剂盒使用的试剂耗材相对简单且稳定，操作简单；3)灵敏度高，准确率大于99.9％。

本产品可以通过ptgs1(c.-842a>g)、itga2(c.759c>t)、itgb3(c.176t>c)和pear1(c.-9-3996g>a)基因分型检测，使用关键技术为sanger测序，通过该项目检测可以发现个体间的遗传差异，提前判断阿司匹林抵抗的风险情况，从而采取个体化的抗血小板治疗，实现精准治疗和预防心血管事件的发生。

本发明的技术方案如下：

一种检测阿司匹林个体化用药基因检测试剂盒，主要包括以下成分：

(1)ptgs1(-842a>g)、itga2(759c>t)、itgb3(176t>c)和pear1(-9-3996g>a)位点区域pcr扩增与测序引物4对，各引物的核苷酸序列如seqno.5-12所示，具体见表1：

表1：引物序列

(2)常规pcr扩增试剂，如dntp、taqdna聚合酶等；

(3)常规pcr产物纯化试剂，如sap酶、exoi酶等；

(4)常规dna测序试剂，如bigdyemix、edta溶液、乙醇溶液、hi-di溶液等。

优选地，

所述的试剂盒，包括以下成分：

(1)ptgs1(-842a>g)、itga2(759c>t)、itgb3(176t>c)和pear1(-9-3996g>a)位点扩增和测序引物4对，每条引物1od，引物序列参见表1；

(2)pcr扩增试剂：taq酶混合液，包括dntp、l0×pcr反应缓冲液和mgcl2；

(3)pcr产物纯化试剂：sap酶混合物，包括sap酶、exoi酶和去离子水；

(4)测序试剂：包括bigdyemix、edta、乙醇溶液和hi-di。

采用上述试剂盒进行非疾病诊断目的检测阿司匹林个体化用药基因的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取样本的基因组dna；

(2)ptgs1(-842a>g)、itga2(759c>t)、itgb3(176t>c)和pear1(-9-3996g>a)位点区域pcr扩增；采用表1引物序列；

(3)pcr产物纯化

(4)dna测序反应。

优选地，

所述的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取样本的基因组dna；

(2)ptgs1(-842a>g)、itga2(759c>t)、itgb3(176t>c)和pear1(-9-3996g>a)位点区域pcr扩增；

所述步骤(2)ptgs1(-842a>g)、itga2(759c>t)、itgb3(176t>c)和pear1(-9-3996g>a)位点区域pcr扩增，采用表1引物序列；

每个反应体系为总体积50μl，包含taq酶混合液25μl、去离子水17μl、引物对(5μm)3μl、基因组dna(50ng/μl)2μl；pcr反应条件为95℃3分钟，进行35个循环的95℃30秒，56℃20秒，72℃30秒最后进行72℃5分钟；

(3)pcr产物纯化

每个反应体系总体积为5.6μl；pcr产物4μl，再加入1.6μlsap酶混合物；反应条件为37℃45分钟，85℃15分钟；

(4)dna测序反应

每个反应的体系为总体积10μl，pcr酶解产物1μl、bigdyemix(bigdye、5×seq)2.2μl和测序引物0.5μl，加水补足10μl；反应条件为96℃1min，进行33个循环的96℃10sec，56℃10sec，60℃2.5min；

反应结束后每管内加入2.5μledta，30μl100％乙醇，盖好，震荡4次，避光静置15分钟，3860rpm，25℃离心40min，吸弃上层液体；加入100μl70％预冷乙醇，盖好，3860rpm，25℃离心15分钟，吸弃上层液体；让酒精在室温挥发干净，加入8μlhi-di溶解dna；在pcr仪上变性：95℃4分钟，冰上静置4分钟；放入测序仪中。

本发明具有如下技术效果：提供了一种针对中国人群的阿司匹林个体化用药的基因检测试剂盒，且灵敏度高准确率高。所述的试剂盒用于ptgs1(-842a>g)、itga2(759c>t)、itgb3(176t>c)和pear1(-9-3996g>a)基因分型检测，通过该项目检测可以发现个体间的遗传差异，提前判断阿司匹林抵抗的风险情况，从而采取个体化的抗血小板治疗，实现精准治疗和预防心血管事件的发生。

附图说明

图1为itga2(759c>t)位点存在突变的分析结果。

图2为pear1(-9-3996g>a)位点存在突变的分析结果。

具体实施方式

实施例1

一人份检测阿司匹林个体化用药基因检测试剂盒，包括以下成分：

(1)ptgs1(-842a>g)、itga2(759c>t)、itgb3(176t>c)和pear1(-9-3996g>a)位点扩增和测序引物4对，每条引物1od。

各引物的核苷酸序列如seqno.5-12所示，具体见表1：

表1：引物序列

(2)pcr扩增试剂：taq酶混合液15μl(dntp、l0×pcr反应缓冲液、mgcl2)(采购于诺唯赞公司)；

(3)pcr产物纯化试剂：3.2μlsap酶混合物(sap酶、exoi酶、去离子水)(采购于诺唯赞公司)；

(4)测序试剂：4.4μlbigdyemix(bigdye、5×seq)、5μledta、60μl乙醇溶液(100％)、200μl乙醇溶液(70％)、16μlhi-di。

本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

实施例2

采用实施例1的一人份检测阿司匹林个体化用药基因检测试剂盒使用步骤如下：

(1)提取样本的基因组dna；

(2)ptgs1(-842a>g)、itga2(759c>t)、itgb3(176t>c)和pear1(-9-3996g>a)位点的pcr扩增

针对ptgs1(-842a>g)、itga2(759c>t)、itgb3(176t>c)和pear1(-9-3996g>a)位点按照实施例1表1设计引物进行pcr扩增。

每个反应体系为总体积16μl，包含taq酶混合液7.5μl(dntp、l0×pcr反应缓冲液、mgcl2)、去离子水5.5μl、引物对(l0um)1μl、基因组dna(100ng/ul)1ul。反应条件为95℃15分钟，进行14个循环(-0.5℃/循环)的94℃30秒，63℃30秒，72℃45秒；然后进行30个循环的94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒，最后进行72℃10分钟。

(3)pcr产物纯化

每个反应体系为总体积5.6μl。pcr产物4μl，再加入1.6μlsap酶混合物(sap酶、exoi酶、去离子水)。反应条件为37℃45分钟，85℃15分钟。

(4)dna测序反应

每个反应的体系为总体积10μl，pcr酶解产物1μl、bigdyemix(bigdye、5×seq)2.2μl和测序引物0.5μl，加水补足10μl。反应条件为96℃1min，进行33个循环的96℃10sec，56℃10sec，60℃2.5min。

反应结束后每管内加入2.5μledta，30μl100％乙醇，盖好，震荡4次，避光静置15分钟，3860rpm，25℃离心40min，吸弃上层液体；加入100μl70％预冷乙醇，盖好，3860rpm，25℃离心15分钟，吸弃上层液体；让酒精在室温挥发干净，加入8μlhi-di溶解dna；在pcr仪上变性：95℃4分钟，冰上静置4分钟。放入测序仪中。

(5)结果分析

对ptgs1(-842a>g)、itga2(759c>t)、itgb3(176t>c)和pear1(-9-3996g>a)位点进行直接测序，在测序仪上进行结果读取，用软件chromas查阅测序检测结果。将测定的各样本序列与genbank数据库ptgs1基因序列(nm_080591.2)、itga2基因序列(nm_002203.3)、itgb3基因序列(nm_000212.2)和pear1基因序列(nm_001080471.1)进行比较，ptgs1基因序列如seqn0.1所示，itga2基因序列如seqn0.2所示，itgb3基因序列如seqn0.3所示，pear1基因序列如seqn0.4所示。

检出突变：itga2(759c>t)和pear1(-9-3996g>a)位点存在突变。

在测序仪上进行结果读取，用软件chromas查阅测序检测结果。

itga2(759c>t)位点存在突变，则分析结果如图1所示；

pear1(-9-3996g>a)位点存在突变，则分析结果如图2所示。

序列表

<110>南通中科基因医学检验所有限公司

<120>阿司匹林个体化用药基因检测试剂盒及检测方法

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4934

<212>dna

<213>人(homosapiens)

<400>1

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