本发明属生物技术领域，具体涉及检测氯氮平个体化用药基因检测试剂盒。
背景技术：
氯氮平属二氮卓类，是最早典型的抗精神病药，具有强大的镇静催眠作用，也具有毒蕈碱样作用。对控制幻觉、妄想、躁动的精神分裂症有明显疗效，对焦虑不安或有阴性症状的精神分裂症也有一定疗效。氯氮平是唯一一种获fda批准治疗难治性精神分裂症的药物，但其特发及剂量依赖性的严重副作用限制了该药的临床应用。在实际应用中，氯氮平的临床疗效存在很大的个体差异，有的患者疗效不明显，甚至出现严重的不良反应，而目前临床上除了试验外，尚无有效预测氯氮平药物疗效的方法，这种临床疗效的不确定性已经成为用药安全的重要隐患，且浪费医疗资源。现有结果研究显示，遗传因素是氯氮平临床效应产生个体差异的重要因素，与氯氮平临床疗效相关的基因主要包括药物代谢酶、转运体、靶点等向相关基因。研究表明，cyp2d6是氯氮平的主要代谢酶，此基因型的抗精神病药代谢较慢，血药浓度较高，导致副作用较明显。
现有技术主要存在如下技术问题：缺少一种针对中国人群的、且检测灵敏度高准确率高的氯氮平个体化用药基因检测试剂盒。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种采用dna测序技术检测氯氮平个体化用药基因检测试剂盒。可以解决现有技术的技术问题：(1)本发明涉及的基因位点是从药物基因组学数据库(pharmgkb)的研究成果中筛选出关于中国人群分布频率较高的基因位点，因此这些基因位点具备一定的权威性和科学性；(2)本试剂盒使用的试剂耗材相对简单且稳定，操作简单；(3)灵敏度高，准确率大于99.9％。
本产品可以通过cyp2d6*2(886c>a)、cyp2d6*41(985+39g>a)、cyp2d6*10(100c>t)和mc4r(57882787c>t)基因分型检测，使用关键技术为sanger测序，通过该项目检测可以发现个体间的遗传差异，可以明确自己的用药体质(慢代谢还是正常代谢)，解读其中相关基因信息，及时了解自己的生理状况或药物反应情况，可以提高药物疗效，降低药物毒副作用，减少医疗费用。
本发明的技术方案如下：
一种检测氯氮平个体化用药基因检测试剂盒，主要包括以下成分：
(1)cyp2d6*2(886c>a)、cyp2d6*41(985+39g>a)、cyp2d6*10(100c>t)和mc4r(57882787c>t)位点区域pcr扩增与测序引物4对，cyp2d6z大片段pcr扩增引物1对，各引物的核苷酸序列如seqno.3-12所示，具体见表1：
表1
(2)常规pcr扩增试剂，如dntp、taqdna聚合酶等；
(3)常规pcr产物纯化试剂，如sap酶、exoi酶等；
(4)常规dna测序试剂，如bigdyemix、edta溶液、乙醇溶液、hi-di溶液等。
优选地，
所述的试剂盒，包括以下成分：
(1)cyp2d6*2(886c>a)、cyp2d6*41(985+39g>a)、cyp2d6*10(100c>t)和mc4r(57882787c>t)位点区域pcr扩增与测序引物4对，cyp2d6z大片段pcr扩增引物1对，序列见表1；
(2)pcr扩增试剂：taq酶混合液，包括dntp、l0×pcr反应缓冲液和mgcl2；
(3)pcr产物纯化试剂：sap酶混合物，包括sap酶、exoi酶和去离子水；
(4)测序试剂：包括bigdyemix、edta、乙醇溶液和hi-di。
采用所述试剂盒进行非疾病诊断目的检测氯氮平个体化用药基因的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取样本的基因组dna；
(2)扩增cyp2d6*2(886c>a)、cyp2d6*41(985+39g>a)、cyp2d6*10(100c>t)位点，使用mc4r引物扩增mc4r(57882787c>t)位点；由于cyp2d6基因存在假基因，该试剂盒采用巢式pcr扩增，先用cyp2d6z大片段pcr扩增引物进行大片段扩增，在此扩增产物基础上分别扩增cyp2d6*2/*41/*10位点，从而提高反应特异性；
(3)pcr产物纯化；
(4)dna测序反应。
优选地，
本试剂盒的使用步骤包括：
(1)提取样本的基因组dna；
(2)cyp2d6*2(886c>a)、cyp2d6*41(985+39g>a)、cyp2d6*10(100c>t)和mc4r(57882787c>t)位点的pcr扩增
针对cyp2d6*2(886c>a)、cyp2d6*41(985+39g>a)、cyp2d6*10(100c>t)和mc4r(57882787c>t)位点按照表1设计引物进行pcr扩增；
由于cyp2d6基因存在假基因，该试剂盒采用巢式pcr扩增，先用cyp2d6z大片段pcr扩增引物进行大片段扩增，在此扩增产物基础上分别扩增cyp2d6*2/*41/*10位点；
每个反应体系为总体积16μl，包含taq酶混合液7.5μl(dntp、l0×pcr反应缓冲液、mgcl2)、去离子水5.5μl、引物对(l0um)1μl、基因组dna(100ng/ul)1ul；反应条件为95℃15分钟，进行14个循环(-0.5℃/循环)的94℃30秒，63℃30秒，72℃45秒；然后进行30个循环的94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒，最后进行72℃10分钟；
(3)pcr产物纯化
每个反应体系为总体积5.6μl；pcr产物4μl，再加入1.6μlsap酶混合物(sap酶、exoi酶、去离子水)；反应条件为37℃45分钟，85℃15分钟；
(4)dna测序反应
每个反应的体系为总体积10μl，pcr酶解产物1μl、bigdyemix(bigdye、5×seq)2.2μl和测序引物0.5μl，加水补足10μl；反应条件为96℃1min，进行33个循环的96℃10sec，56℃10sec，60℃2.5min；
反应结束后每管内加入2.5μledta，30μl100％乙醇，盖好，震荡4次，避光静置15分钟，3860rpm，25℃离心40min，吸弃上层液体；加入100μl70％预冷乙醇，盖好，3860rpm，25℃离心15分钟，吸弃上层液体；让酒精在室温挥发干净，加入8μlhi-di溶解dna；在pcr仪上变性：95℃4分钟，冰上静置4分钟；放入测序仪中。
本发明具有如下技术效果：提供了一种针对中国人群的氯氮平个体化用药的基因检测试剂盒，且灵敏度高准确率高。所述的试剂盒用于cyp2d6*2(886c>a)、cyp2d6*41(985+39g>a)、cyp2d6*10(100c>t)和mc4r(57882787c>t)基因分型检测，通过该项目检测可以发现个体间的遗传差异，可以明确自己的用药体质(慢代谢还是正常代谢)，解读其中相关基因信息，及时了解自己的生理状况或药物反应情况，可以提高药物疗效，降低药物毒副作用，减少医疗费用。由于cyp2d6基因存在假基因，该试剂盒采用巢式pcr扩增，先用cyp2d6z大片段pcr扩增引物进行大片段扩增，在此扩增产物基础上分别扩增cyp2d6*2/*41/*10位点，从而提高反应特异性。
具体实施方式
实施例1
一人份检测氯氮平个体化用药基因检测试剂盒，包括以下成分：
(1)cyp2d6*2(886c>a)、cyp2d6*41(985+39g>a)、cyp2d6*10(100c>t)和mc4r(57882787c>t)位点区域pcr扩增与测序引物4对，cyp2d6z大片段pcr扩增引物1对；每条引物1od，
各引物的核苷酸序列如seqno.3-12所示，具体见表1：
表1
(2)pcr扩增试剂：taq酶混合液15μl(dntp、l0×pcr反应缓冲液、mgcl2)；(采购于诺唯赞公司)
(3)pcr产物纯化试剂：3.2μlsap酶混合物(sap酶、exoi酶、去离子水)；(采购于诺唯赞公司)
(4)测序试剂：4.4μlbigdyemix(bigdye、5×seq)、5μledta、60μl乙醇溶液(100％)、200μl乙醇溶液(70％)、16μlhi-di。
本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
实施例2
采用实施例1的一人份检测氯氮平个体化用药基因检测试剂盒使用步骤包括：
(1)提取样本的基因组dna；
(2)cyp2d6*2(886c>a)、cyp2d6*41(985+39g>a)、cyp2d6*10(100c>t)和mc4r(57882787c>t)位点的pcr扩增
针对cyp2d6*2(886c>a)、cyp2d6*41(985+39g>a)、cyp2d6*10(100c>t)和mc4r(57882787c>t)位点按照表1设计引物进行pcr扩增。
由于cyp2d6基因存在假基因，该试剂盒采用巢式pcr扩增，先用cyp2d6z大片段pcr扩增引物进行大片段扩增，在此扩增产物基础上分别扩增cyp2d6*2/*41/*10位点，从而提高反应特异性；
每个反应体系为总体积16μl，包含taq酶混合液7.5μl(dntp、l0×pcr反应缓冲液、mgcl2)、去离子水5.5μl、引物对(l0um)1μl、基因组dna(100ng/ul)1ul。反应条件为95℃15分钟，进行14个循环(-0.5℃/循环)的94℃30秒，63℃30秒，72℃45秒；然后进行30个循环的94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒，最后进行72℃10分钟。
(3)pcr产物纯化
每个反应体系为总体积5.6μl。pcr产物4μl，再加入1.6μlsap酶混合物(sap酶、exoi酶、去离子水)。反应条件为37℃45分钟，85℃15分钟。
(4)dna测序反应
每个反应的体系为总体积10μl，pcr酶解产物1μl、bigdyemix(bigdye、5×seq)2.2μl和测序引物0.5μl，加水补足10μl。反应条件为96℃1min，进行33个循环的96℃10sec，56℃10sec，60℃2.5min。
反应结束后每管内加入2.5μledta，30μl100％乙醇，盖好，震荡4次，避光静置15分钟，3860rpm，25℃离心40min，吸弃上层液体；加入100μl70％预冷乙醇，盖好，3860rpm，25℃离心15分钟，吸弃上层液体；让酒精在室温挥发干净，加入8μlhi-di溶解dna；在pcr仪上变性：95℃4分钟，冰上静置4分钟。放入测序仪中。
(5)结果分析
对cyp2d6*2(886c>a)、cyp2d6*41(985+39g>a)、cyp2d6*10(100c>t)和mc4r(57882787c>t)位点进行直接测序，在测序仪上进行结果读取，用软件chromas查阅测序检测结果。将测定的各样本序列与genbank数据库cyp2d6*2基因序列(nm_000106.5)、cyp2d6*41基因序列(nm_000106.5)、cyp2d6*10基因序列(nm_000106.5)和mc4r基因序列(nc_000018.9)进行比较，cyp2d6*2、cyp2d6*41、cyp2d6*10基因序列如seqn0.1所示，mc4r基因序列如seqn0.2所示。
目前该试剂盒检测样本的实验结果中未出现以上4个位点的突变，在此不展示未突变检测结果分析图。
序列表
<110>南通中科基因医学检验所有限公司
<120>氯氮平个体化用药基因检测试剂盒
<160>12
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1673
<212>dna
<213>人(homosapiens)
<400>1
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<213>人工序列(artificialsequence)
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<212>dna
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<213>人工序列(artificialsequence)
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