用于肠道菌群培养的反应器及利用其培养肠道菌群的方法与流程

本发明涉及一种用于肠道菌群培养的反应器及利用其培养肠道菌群的方法，属于生物发酵技术领域。

背景技术

人类体表和体内存在着超过100亿的微生物，这些微生物和人类共生，并在人类健康和疾病中发挥着重要的作用。这些微生物群，特别是肠道菌群，被认为是人体内一个“沉默的器官”。肠道菌群携带的基因数量约为人类自身基因数量的100-150倍。肠道菌群在机体不同肠段中行使着不同的生理功能。肠道菌群可以帮助机体从食物中获得更多的能量，增加营养的获取。肠道菌群可以为机体提供不同的代谢途径，肠道菌群含有比人类更多的代谢功能基因，可以提供一些特异性的酶和生化途径，如进一步降解机体内难消化的碳水化合物(大分子多糖)，参与维生素的生物合成。其次肠道菌群也为机体提供了物理屏障。肠道菌群可以通过竞争性抑制和分泌抗菌物质来保护宿主免受外来病原体的侵害。最后，肠道菌群在宿主肠粘膜和免疫系统发育中也是必不可少的。近年来的研究表明，肠道菌群参与人的整个生理过程，包括调节代谢表型、调节上皮发育和先天性免疫。肥胖、炎症性肠病、糖尿病、代谢综合征、动脉粥样硬化、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝病、肝硬化和肝癌等慢性疾病都被认为与肠道菌群有关。

体外模型克服了人体取样的困难，同时排除了宿主的影响因素，非常简单，可以模拟肠道的生理环境从而用于肠道微生物群落的共培养或多样性和功能的研究。目前肠道微生物体外培养模型主要有体外静置培养模型(batchfermentation)、连续发酵模型(continuousculturesystem，也称chemostat)和人体肠道微生态模拟器(simulatorofthehumanintestinalmicrobialecosystem，shime)。体外静置培养模型主要是利用容量在50～100ml的三角瓶等容器在厌氧工作站中进行动物或人体肠道菌群的研究。此方法的缺点是不能模拟肠道生态环境，会由于ph值和培养基消耗等因素导致菌群结构发生改变，因此发酵时间不能太长(48h)，只能用于初步分析。

技术实现要素：

为了解决上述问题，更好的模拟肠道内的生态和环境，本发明由不同直径和长度的中空钢管连接而成的管型结构，以模拟人或动物的不同肠道环境，从停留时间考虑除了加粗加长管径外，还可以在钢管中内置中空纤维或凝胶等以增加发酵液通过时间。可以根据肠道不同解剖位置的特点进行组合，可以用来研究肠道不同解剖位置的菌群组成及代谢功能的连续反应器。

本发明的第一个目的是提供一种用于肠道菌群培养的反应器，包括保温装置、发酵装置、进料装置、出料装置；所述的发酵装置置于保温装置内；所述的发酵装置包括小肠模拟管道、盲肠模拟管道、结肠模拟管道和直肠模拟管道，所述的小肠模拟管道为螺旋状中空管道，一端连接有第一混合池，另一端连接有第二混合池，所述的第一混合池与进料装置通过进料管路相连接，所述的第二混合池分别与盲肠模拟管道和结肠模拟管道一端相连接，小肠模拟管道、盲肠模拟管道和结肠模拟管道通过第二混合池相连通；所述的结肠模拟管道为螺旋状中空管道，所述的结肠模拟管道另一端与直肠模拟管道相连通；所述的直肠模拟管道另一端与出料装置通过出料管路相连接。

在本发明的一种实施方式中，所述反应器还包括进气装置，所述的进气装置通过进气管路与第一混合池相连接，所述的直肠模拟管道上出气管路。

在本发明的一种实施方式中，所述的进气装置为可调速小型气泵，通过进气管路向发酵装置中通入氮气。

在本发明的一种实施方式中，所述的第二混合池上还设有补料管道，所述的补料管道用来补料。

在本发明的一种实施方式中，所述的第一混合池、第二混合池、盲肠模拟管道和直肠模拟管道上分别设有接种头，所述接种头用于向发酵装置中接种菌悬液。

在本发明的一种实施方式中，所述的第一混合池、第二混合池、盲肠模拟管道和直肠模拟管道上分别设有取样头，所述的取样头用于取样检测。

在本发明的一种实施方式中，所述的第一混合池、第二混合池、盲肠模拟管道和直肠模拟管道上还分别设有ph显示器，所述的ph显示器用于监测调控发酵装置中的ph值。

在本发明的一种实施方式中，所述的结肠模拟管道与小肠模拟管道的半径比值为2～2.5，小肠模拟管道与结肠模拟管道的长度比值为2.5～4。本发明主要通过改变管路直径来调节模拟不同肠道中的发酵液驻留时间，以更好的模拟肠道驻留时间带来的影响。

在本发明的一种实施方式中，所述的保温装置包括夹套，和设置在夹套内的加热器。

在本发明的一种实施方式中，所述的小肠模拟管道、盲肠模拟管道、结肠模拟管道和直肠模拟管道内壁设有中空纤维材料或透水膜，所述的中空纤维材料或透水膜用来对管路中的发酵液进行在线浓缩，用来模拟疾病状态下的生理现象。

本发明的第二个目的是提供一种应用所述的反应器培养肠道菌群的方法，包括如下步骤：

(1)通氮气，使发酵装置内处于无氧环境；

(2)制备粪便菌悬液；

(3)向发酵装置中流加培养基，充满发酵装置，并控制发酵条件，通入混合气体；

(4)向发酵装置中接种粪便菌悬液，并进行封闭培养至菌群对数期后开始连续培养。

在本发明的一种实施方式中，所述的培养基包括如下组分：(g/l)：牛肉膏8～12、酵母提取物4～6、葡萄糖3～5、胰蛋白胨25～35、l-半胱氨酸盐酸盐4～6、磷酸氢二钾4～6、纤维二糖1～1.5、麦芽糖1～1.5、可溶性淀粉1～1.5、树脂天青0.001～0.005、氯化血红素0.005～0.01、维生素k10.001～0.005。

在本发明的一种实施方式中，在步骤(1)中，所述的通氮气的时间为12～24h。

在本发明的一种实施方式中，在步骤(2)中，所述的粪便菌悬液为健康人或动物的粪便菌悬液。

在本发明的一种实施方式中，在步骤(3)中，所述的控制发酵条件包括控制温度为36～40℃。

在本发明的一种实施方式中，在步骤(3)中，所述的控制发酵条件还包括控制肠段内的ph，以模拟不同肠段的内环境。

在本发明的一种实施方式中，小肠模拟管道ph控制为4.5～6.5，盲肠模拟管道ph控制为4.5～7.0，结肠模拟管道ph控制为4.5～7.5，直肠模拟管道ph控制为4.5～7。

在本发明的一种实施方式中，在步骤(3)中，所通入的混合气体的通气量为0.4～0.6v/v·min，混合气体组成为75～85％氮气，5～15％氢气和5～15％二氧化碳。

在本发明的一种实施方式中，本发明在模拟不同肠段内环境时，可选择不同的位置进行接种。

本发明的有益效果是：

1、本发明主要通过改变管路直径来调节模拟不同肠道中的发酵液驻留时间，以更好的模拟肠道驻留时间带来的影响，此外，本发明还可以通过在管路中添加中空纤维材料或者内置透水膜来对管路中的发酵液进行在线浓缩，此举可以用来模拟疾病状态下所致的便秘等生理现象。

2、本发明所用的管路为螺旋装排列，压缩了空间，节约了设备空间。

3、本发明可以支持多套管路并联，置于同一夹套中，使平行实验温度一致，提高实验结果的准确性。

4、本发明可以实现多肠段分别接种不同的菌群、流加不同物料进行研究。

5、本发明的不锈钢中空管中可以内置不同材质(如选取大肠组织类似的生物材料)的套管，进行肠道仿生学研究。

附图说明

图1是本发明用于肠道菌群培养的反应器的结构示意图；

其中1、流加补料；2、进气管路；3、ph显示器；4、接种头；5、取样头；6、混合池；7、加热丝；8、补料口；9、夹套；10、出料管路；11、出气管路。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：粪便菌悬液的制备方法

结合附图1，本发明的一种用于肠道菌群培养的反应器，包括保温装置、发酵装置、进料装置1、出料装置2；所述的发酵装置置于保温装置内；发酵装置包括小肠模拟管道3、盲肠模拟管道4、结肠模拟管道5和直肠模拟管道6，小肠模拟管道3为螺旋状中空管道，一端连接有第一混合池7，另一端连接有第二混合池8，第一混合池7与进料装置1通过进料管路9相连接，所述的第二混合池8分别与盲肠模拟管道4和结肠模拟管道5一端相连接，小肠模拟管道3、盲肠模拟管道4和结肠模拟管道5通过第二混合池8相连通；结肠模拟管道5为螺旋状中空管道，结肠模拟管道5另一端与直肠模拟管道6相连通；直肠模拟管道6另一端与出料装置2通过出料管路10相连接。

所述反应器还包括进气装置11，进气装置11通过进气管路12与第一混合池7相连接，直肠模拟管道6上出气管路13。所述的进气装置11为可调速小型气泵，通过进气管路向发酵装置中通入氮气。

所述的第二混合池8上还设有补料管道14，用来补料。

所述的第一混合池、第二混合池、盲肠模拟管道和直肠模拟管道上分别设有接种头15，用于向发酵装置中接种菌悬液。

所述的第一混合池、第二混合池、盲肠模拟管道和直肠模拟管道上分别设有取样头16，用于取样检测。

所述的第一混合池、第二混合池、盲肠模拟管道和直肠模拟管道上还分别设有ph显示器17，用于检测调控发酵装置中的ph值。

所述的结肠模拟管道与小肠模拟管道的半径比值为2，小肠模拟管道与结肠模拟管道的长度比值为3。本发明主要通过改变管路直径来调节模拟不同肠道中的发酵液驻留时间，以更好的模拟肠道驻留时间带来的影响。

所述的保温装置包括夹套18，和设置在夹套内的加热器19。

所述的小肠模拟管道、盲肠模拟管道、结肠模拟管道和直肠模拟管道内壁设有中空纤维材料或透水膜，所述的中空纤维材料或透水膜用来对管路中的发酵液进行在线浓缩，用来模拟疾病状态下的生理现象。

采用本发明的装置来进行肠道菌群的培养：

在运行时，夹套中的加热丝可以维持管路的温度为38℃，使整个发酵过程保持恒温。ph自动控制加液机可以通过检测实时的ph，控制碱液的加入量，以维持发酵罐在恒定ph进行发酵。管路为中空不锈钢，有效工作体积为200-450ml，发酵罐顶部有培养基补料口，氮气进口，ph计，碱液进口，以及出气口。整个系统模拟肠道厌氧发酵状态。本发明在出料装置处的恒流泵的速率与补料泵的速率一致以维持发酵系统体积恒定。恒化培养时采用混合气体，组成为80％氮气，10％氢气和10％二氧化碳。具体培养操作方法如下：

(1)灭菌

将10l补料罐清洗干净后，加入配制好的培养基，然后将反应器的各个部件组装好，先用纱布包扎后，除进气口外再包扎上报纸，将它们单独灭菌。灭菌条件：121℃，20min，湿热灭菌。

(2)搭建连续厌氧补料系统

先用酒精消毒台面后，待到灭菌结束之后，将反应器快速连接好。设置温度为38℃。待培养基放置冷却之后，向发酵装置中连续通入氮气以维持整个系统的厌氧条件。启动蠕动泵，先向反应器中补进大约400ml培养基，保证整个体系内充满培养基。整个反应器器系统在上述条件下运行48h，以检测系统内厌氧及无菌情况。

小鼠粪便体外发酵培养基(g/l)：牛肉膏10.2、酵母提取物5.0、葡萄糖4.0、胰蛋白胨30.0、l-半胱氨酸盐酸盐5.0、磷酸氢二钾5.0、纤维二糖1.0、麦芽糖1.0、可溶性淀粉1.0、树脂天青0.001、氯化血红素0.005、维生素k10.001，初始ph6.5。

(3)粪便菌悬液的制备：

取新鲜现排的糖尿病小鼠粪便，取5g后即迅速投入无氧无菌的含有pbs溶液的50ml离心管(预先放置无菌陶瓷珠)中。以下步骤均在厌氧工作台进行，立即用震荡仪在5min内使其变为悬浊液，500rpm室温离心10min，取上层液体至另一个无菌2mlep管中，4000rpm室温离心5min后尽弃上清，用无菌无氧的pbs溶液重悬(重复3次)即得到粪便菌悬液。

取制备的菌悬液即为0d的起始接种菌悬液。

(4)接种并连续发酵

采取火圈接种的方法，取菌悬液(1ml)接种到含有50ml培养基的盲肠模拟管道中，接种后12h后，开始补料，同时启动ph自动控制仪，控制整个系统ph，ph控制为小肠模拟管道4.7±0.2，盲肠模拟管道4.5±0.1，结肠模拟管道4.8±0.3，直肠模拟管道4.5±0.2。

(5)补料程序的设定

接种后第三天，给予甘露寡糖或二甲双胍的溶液(0.05～1mg/l)流加补料，每12小时补加4～8ml。

(6)扩培后菌液的收集

上述反应器发酵14-21天后，收集菌液，500rpm室温离心10min，取上层液体继续4000rpm室温离心5min后尽弃上清，用无菌无氧的pbs溶液重悬(重复3次)即得到扩培后菌悬液。

以人粪便菌群悬液、大鼠粪便菌群悬液和小鼠粪便菌群悬液为接种物，分别采用本发明所述设备进行发酵，用超高效液相色谱仪对发酵液中的短链脂肪酸进行检测，结果见表1。发酵液与原粪便中的各短链脂肪含量类似，相似度高，说明本反应器具有较好的模拟特性。

表1发酵液中短链脂肪酸含量

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。