本发明属于细胞培养
技术领域：
。更具体地说，本发明涉及一种富含长春碱的长春花细胞培养方法。
背景技术：
：长春花，别名金盏草、四时春、日日新、雁头红、三万花，为夹竹桃科长春花属一种植物。目前，已经从长春花中分离出了100多种萜类吲哚生物碱，如长春碱、长春新碱、蛇根碱、文多灵碱等，从长春花中分离出来的许多生物碱均具有抗肿瘤活性，其中，长春碱是目前长春花中药用价值最大的、应用最广泛的生物碱。长春碱在长春花细胞中的含量较低，造成了单位质量长春碱的生产成本较高，即使通过细胞培养进行长春碱的生产，但长春碱的价格仍然较高，无法满足市场的需求。技术实现要素：作为各种广泛且细致的研究和实验的结果，本发明的发明人已经发现，在液体悬浮培养基中含有尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银的情况下通入一氧化碳后使用特定波长的紫外照射，能提高单位质量长春花细胞中长春碱的含量。基于这种发现，完成了本发明。本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。本发明还有一个目的是提供一种富含长春碱的长春花细胞培养方法，其能够促进长春花细胞的生长、提高单位时间单位体积培养液中的细胞含量，进而提高长春碱的含量。为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种富含长春碱的长春花细胞培养方法，其包括以下步骤：1)挑选饱满的长春花种子，使用弱酸电解水浸泡10-20秒，使用无菌去离子水洗净，使用在含有10-20mg/l维生素c、7-9g/l琼脂和0.1-0.3g/l寡糖素的b5基础培养基上培养得到无菌苗，以所述无菌苗的胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为32-35℃，每天交替进行光照和黑暗培养，诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织转入继代培养基中，每20-25天继代一次，继代培养3-5次，以获得稳定的长春花愈伤组织；2)选取生长旺盛、质地松散、状态稳定均一的所述长春花愈伤组织，接种到液体悬浮培养基中，然后往液体悬浮培养基中添加玻璃珠，在震荡摇床中进行高速振荡8-10min，摇床转速180～200rpm，然后置于光照摇床中进行培养，摇床转速为100-120rpm，光照强度1500～2000lx，光照时间10～15h/day，每20-22天继代培养1次，继代培养5～8次，获得稳定遗传的长春花细胞系；3)将步骤2)获得的长春花细胞系接种到液体悬浮培养基中进行诱导培养，以刺激长春花中生物碱的积累，所述诱导条件为：长春花细胞系在液体悬浮培养基培养第15-20天开始，通入一氧化碳气体以及往液体悬浮培养基中添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，使用波长为360-400nm的紫外光进行辐射，辐射强度为10-20μw/cm2，每辐射10-15min后停止辐射30-45min，直至该培养结束，获得富含长春碱的长春花细胞。优选的是，所述愈伤组织诱导培养基为含有1～2mg/l细胞分裂素、0.1～0.5mg/l6-苄氨基嘌呤、20～30g/l蔗糖、3-5mg/l甘草黄酮和5～8g/l琼脂的b5基础培养基。优选的是，所述继代培养基由愈伤组织诱导培养基中添加苯丙氨酸而成，苯丙氨酸在继代培养基中的浓度为0.5～1.0mmol/l。优选的是，所述液体悬浮培养基为含有添加有甘草黄酮、白藜芦醇、6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、蔗糖的b5基础培养基，所述甘草黄酮的浓度为0.005-0.008mg/l，白藜芦醇的浓度为0.001-0.003mg/l，6-苄氨基嘌呤的浓度为0.08-0.1mg/l，萘乙酸的浓度为0.2-0.3mg/l，2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.06-0.09mg/l、蔗糖的浓度为20-30g/l的b5基础培养基。优选的是，所述液体培养基中还包括色氨酸和水解酪蛋白，所述色氨酸的浓度为20-30mg/l，所述水解酪蛋白的含量为50-70mg/l。优选的是，所述一氧化碳的通入量为0.01-0.03m3/h。优选的是，所述尼克酸的浓度为0.05-0.1mg/l，所述蜕皮激素的浓度为0.06-0.08mg/l，所述硫代硫酸银的浓度为0.02-.0.05mg/l。本发明至少包括以下有益效果：通过使用弱酸电解水浸泡消毒长春花种子，能提高长春花种子的发芽率8％以上；使用本发明的愈伤组织诱导培养基，能有效的避免细胞出现褐化，并且能缩短诱导周期；在含有尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银的液体培养基中通入一氧化碳，促使长春花细胞中合成长春碱关键基因d4h和dat基因表达量增加了1倍，提高了长春碱的生物合成量；通过交替的变化培养温度，能促使长春花细胞中长春碱含量提高15％以上；通过使用波长为360-400nm紫外线进行辐射，能使长春碱有效的在细胞中累积，避免其分泌到培养液中，以降低提取难度本发明具有细胞生长速度快、长春碱累积含量高等特点。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。具体实施方式下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。实施例1一种富含长春碱的长春花细胞培养方法，其包括以下步骤：1)挑选饱满的长春花种子，使用弱酸电解水浸泡10秒，使用无菌去离子水洗净，使用在含有10mg/l维生素c、7g/l琼脂和0.1g/l寡糖素的b5基础培养基上培养得到无菌苗，以所述无菌苗的胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为32℃，每天交替进行光照和黑暗培养，诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织转入继代培养基中，每25天继代一次，继代培养3次，以获得稳定的长春花愈伤组织；2)选取生长旺盛、质地松散、状态稳定均一的所述长春花愈伤组织，接种到液体悬浮培养基中，然后往液体悬浮培养基中添加玻璃珠，在震荡摇床中进行高速振荡8min，摇床转速200rpm，然后置于光照摇床中进行培养，摇床转速为100rpm，光照强度2000lx，光照时间15h/day，每22天继代培养1次，继代培养5次，获得稳定遗传的长春花细胞系；3)将步骤2)获得的长春花细胞系接种到液体悬浮培养基中进行诱导培养，以刺激长春花中生物碱的积累，所述诱导条件为：长春花细胞系在液体悬浮培养基培养第15天开始，通入一氧化碳气体以及往液体悬浮培养基中添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，使用波长为360nm的紫外光进行辐射，辐射强度为10μw/cm2，每辐射10min后停止辐射30min，直至该培养结束，获得富含长春碱的长春花细胞。与使用酒精或高锰酸钾消毒液相比，使用弱酸电解水浸泡消毒后，长春花的种子发芽率提高了8.9％。与未通入一氧化碳以及未添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银的试验相比，采用荧光定量pcr技术测定d4h和dat基因的表达量，结果表明本实施例中的d4h和dat基因的表达量分别提高了92％和95％。d4h和dat基因是合成文多灵的关键酶，而文多灵是合成长春碱和长春新碱的重要前提，与未通入一氧化碳以及未添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，未进行紫外辐射的试验相比，本实施例长春花细胞经冻干后，分别检测文多灵和长春碱的含量，发现文多灵含量提升了121％，长春碱含量提高了105％，说明通入一氧化碳以及添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银能促进细胞合成长春碱。实施例2一种富含长春碱的长春花细胞培养方法，其包括以下步骤：1)挑选饱满的长春花种子，使用弱酸电解水浸泡10秒，使用无菌去离子水洗净，使用在含有10mg/l维生素c、7g/l琼脂和0.1g/l寡糖素的b5基础培养基上培养得到无菌苗，以所述无菌苗的胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为32℃，每天交替进行光照和黑暗培养，诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织转入继代培养基中，每25天继代一次，继代培养3次，以获得稳定的长春花愈伤组织；其中，所述愈伤组织诱导培养基为含有1mg/l细胞分裂素、00.5mg/l6-苄氨基嘌呤、30g/l蔗糖、3mg/l甘草黄酮和8g/l琼脂的b5基础培养基；2)选取生长旺盛、质地松散、状态稳定均一的所述长春花愈伤组织，接种到液体悬浮培养基中，然后往液体悬浮培养基中添加玻璃珠，在震荡摇床中进行高速振荡8min，摇床转速200rpm，然后置于光照摇床中进行培养，摇床转速为100rpm，光照强度2000lx，光照时间15h/day，每22天继代培养1次，继代培养5次，获得稳定遗传的长春花细胞系；3)将步骤2)获得的长春花细胞系接种到液体悬浮培养基中进行诱导培养，以刺激长春花中生物碱的积累，所述诱导条件为：长春花细胞系在液体悬浮培养基培养第20天开始，通入一氧化碳气体以及往液体悬浮培养基中添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，使用波长为360nm的紫外光进行辐射，辐射强度为20μw/cm2，每辐射15min后停止辐射45min，直至该培养结束，获得富含长春碱的长春花细胞。本实施例的愈伤组织诱导成功率为95.6％，比使用普通诱导培养基的诱导成功率提高了15％以上。与未通入一氧化碳以及未添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银的试验相比，采用荧光定量pcr技术测定d4h和dat基因的表达量，结果表明本实施例中的d4h和dat基因的表达量分别提高了93％和96％。d4h和dat基因是合成文多灵的关键酶，而文多灵是合成长春碱和长春新碱的重要前提，与未通入一氧化碳以及未添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，未进行紫外辐射的试验相比，本实施例长春花细胞中的文多灵含量提升了120％，长春碱含量提高了115％，说明通入一氧化碳以及添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银能促进细胞合成长春碱。实施例3一种富含长春碱的长春花细胞培养方法，其包括以下步骤：1)挑选饱满的长春花种子，使用弱酸电解水浸泡10秒，使用无菌去离子水洗净，使用在含有10mg/l维生素c、7g/l琼脂和0.1g/l寡糖素的b5基础培养基上培养得到无菌苗，以所述无菌苗的胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为32℃，每天交替进行光照和黑暗培养，诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织转入继代培养基中，每25天继代一次，继代培养3次，以获得稳定的长春花愈伤组织；其中，所述愈伤组织诱导培养基为含有1mg/l细胞分裂素、00.5mg/l6-苄氨基嘌呤、30g/l蔗糖、3mg/l甘草黄酮和8g/l琼脂的b5基础培养基；所述继代培养基由愈伤组织诱导培养基中添加苯丙氨酸而成，苯丙氨酸在继代培养基中的浓度为1.0mmol/l；2)选取生长旺盛、质地松散、状态稳定均一的所述长春花愈伤组织，接种到液体悬浮培养基中，然后往液体悬浮培养基中添加玻璃珠，在震荡摇床中进行高速振荡8min，摇床转速200rpm，然后置于光照摇床中进行培养，摇床转速为100rpm，光照强度2000lx，光照时间15h/day，每22天继代培养1次，继代培养5次，获得稳定遗传的长春花细胞系；3)将步骤2)获得的长春花细胞系接种到液体悬浮培养基中进行诱导培养，以刺激长春花中生物碱的积累，所述诱导条件为：长春花细胞系在液体悬浮培养基培养第20天开始，通入一氧化碳气体以及往液体悬浮培养基中添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，使用波长为400nm的紫外光进行辐射，辐射强度为20μw/cm2，每辐射15min后停止辐射30min，直至该培养结束，获得富含长春碱的长春花细胞。通过在继代培养基中添加苯丙氨酸能促使长春花细胞保持生长活性，使长春花细胞保持旺盛的分裂能力，细胞生长速度提高3％以上。与未通入一氧化碳以及未添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银的试验相比，采用荧光定量pcr技术测定d4h和dat基因的表达量，结果表明本实施例中的d4h和dat基因的表达量分别提高了110％和121％。d4h和dat基因是合成文多灵的关键酶，而文多灵是合成长春碱和长春新碱的重要前提，与未通入一氧化碳以及未添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，未进行紫外辐射的试验相比，本实施例长春花细胞中的文多灵含量提升了143％，长春碱含量提高了138％，说明通入一氧化碳以及添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银能促进细胞合成长春碱。实施例4一种富含长春碱的长春花细胞培养方法，其包括以下步骤：1)挑选饱满的长春花种子，使用弱酸电解水浸泡10秒，使用无菌去离子水洗净，使用在含有10mg/l维生素c、7g/l琼脂和0.1g/l寡糖素的b5基础培养基上培养得到无菌苗，以所述无菌苗的胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为32℃，每天交替进行光照和黑暗培养，诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织转入继代培养基中，每25天继代一次，继代培养3次，以获得稳定的长春花愈伤组织；其中，所述愈伤组织诱导培养基为含有1mg/l细胞分裂素、00.5mg/l6-苄氨基嘌呤、30g/l蔗糖、3mg/l甘草黄酮和8g/l琼脂的b5基础培养基；所述继代培养基由愈伤组织诱导培养基中添加苯丙氨酸而成，苯丙氨酸在继代培养基中的浓度为1.0mmol/l；2)选取生长旺盛、质地松散、状态稳定均一的所述长春花愈伤组织，接种到液体悬浮培养基中，然后往液体悬浮培养基中添加玻璃珠，在震荡摇床中进行高速振荡8min，摇床转速200rpm，然后置于光照摇床中进行培养，摇床转速为100rpm，光照强度2000lx，光照时间15h/day，每22天继代培养1次，继代培养5次，获得稳定遗传的长春花细胞系；其中，所述液体悬浮培养基为含有添加有甘草黄酮、白藜芦醇、6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、蔗糖的b5基础培养基，所述甘草黄酮的浓度为0.005mg/l，白藜芦醇的浓度为0.001mg/l，6-苄氨基嘌呤的浓度为0.08mg/l，萘乙酸的浓度为0.2mg/l，2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.06mg/l、蔗糖的浓度为30g/l的b5基础培养基；3)将步骤2)获得的长春花细胞系接种到液体悬浮培养基中进行诱导培养，以刺激长春花中生物碱的积累，所述诱导条件为：长春花细胞系在液体悬浮培养基培养第20天开始，通入一氧化碳气体以及往液体悬浮培养基中添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，使用波长为400nm的紫外光进行辐射，辐射强度为20μw/cm2，每辐射15min后停止辐射30min，直至该培养结束，获得富含长春碱的长春花细胞。与使用普通液体培养基相比，本实施例的细胞在液体悬浮培养时，生长速度提高了8.5％。与未通入一氧化碳以及未添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银的试验相比，采用荧光定量pcr技术测定d4h和dat基因的表达量，结果表明本实施例中的d4h和dat基因的表达量分别提高了108％和105％。d4h和dat基因是合成文多灵的关键酶，而文多灵是合成长春碱和长春新碱的重要前提，与未通入一氧化碳以及未添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，未进行紫外辐射的试验相比，本实施例长春花细胞中的文多灵含量提升了145％，长春碱含量提高了131％，说明通入一氧化碳以及添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银能促进细胞合成长春碱。实施例5一种富含长春碱的长春花细胞培养方法，其包括以下步骤：1)挑选饱满的长春花种子，使用弱酸电解水浸泡10秒，使用无菌去离子水洗净，使用在含有10mg/l维生素c、7g/l琼脂和0.1g/l寡糖素的b5基础培养基上培养得到无菌苗，以所述无菌苗的胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为32℃，每天交替进行光照和黑暗培养，诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织转入继代培养基中，每25天继代一次，继代培养3次，以获得稳定的长春花愈伤组织；其中，所述愈伤组织诱导培养基为含有1mg/l细胞分裂素、00.5mg/l6-苄氨基嘌呤、30g/l蔗糖、3mg/l甘草黄酮和8g/l琼脂的b5基础培养基；所述继代培养基由愈伤组织诱导培养基中添加苯丙氨酸而成，苯丙氨酸在继代培养基中的浓度为1.0mmol/l；2)选取生长旺盛、质地松散、状态稳定均一的所述长春花愈伤组织，接种到液体悬浮培养基中，然后往液体悬浮培养基中添加玻璃珠，在震荡摇床中进行高速振荡8min，摇床转速200rpm，然后置于光照摇床中进行培养，摇床转速为100rpm，光照强度2000lx，光照时间15h/day，每22天继代培养1次，继代培养5次，获得稳定遗传的长春花细胞系；其中，所述液体悬浮培养基为含有添加有甘草黄酮、白藜芦醇、6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、蔗糖、色氨酸和水解酪蛋白的b5基础培养基，所述甘草黄酮的浓度为0.005mg/l，白藜芦醇的浓度为0.001mg/l，6-苄氨基嘌呤的浓度为0.08mg/l，萘乙酸的浓度为0.2mg/l，2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.06mg/l、蔗糖的浓度为30g/l，所述色氨酸的浓度为20mg/l，所述水解酪蛋白的含量为50mg/l；3)将步骤2)获得的长春花细胞系接种到液体悬浮培养基中进行诱导培养，以刺激长春花中生物碱的积累，所述诱导条件为：长春花细胞系在液体悬浮培养基培养第20天开始，通入一氧化碳气体以及往液体悬浮培养基中添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，使用波长为400nm的紫外光进行辐射，辐射强度为10μw/cm2，每辐射15min后停止辐射30min，直至该培养结束，获得富含长春碱的长春花细胞。与未添加色氨酸和水解酪蛋白的试验相比，添加色氨酸和水解酪蛋白能对长春碱的合成具有正调控的作用，研究表明添加色氨酸和水解酪蛋白后的能增强长春质碱合成酶活性52％和增强长春碱合成酶活性75％。与未通入一氧化碳以及未添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银的试验相比，采用荧光定量pcr技术测定d4h和dat基因的表达量，结果表明本实施例中的d4h和dat基因的表达量分别提高了108％和115％。d4h和dat基因是合成文多灵的关键酶，而文多灵是合成长春碱和长春新碱的重要前提，与未通入一氧化碳以及未添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，未进行紫外辐射的试验相比，本实施例长春花细胞中的文多灵含量提升了142％，长春碱含量提高了139％，说明通入一氧化碳以及添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银能促进细胞合成长春碱。实施例6一种富含长春碱的长春花细胞培养方法，其包括以下步骤：1)挑选饱满的长春花种子，使用弱酸电解水浸泡10秒，使用无菌去离子水洗净，使用在含有10mg/l维生素c、7g/l琼脂和0.1g/l寡糖素的b5基础培养基上培养得到无菌苗，以所述无菌苗的胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为32℃，每天交替进行光照和黑暗培养，诱导出愈伤组织，然后将愈伤组织转入继代培养基中，每25天继代一次，继代培养3次，以获得稳定的长春花愈伤组织；其中，所述愈伤组织诱导培养基为含有1mg/l细胞分裂素、00.5mg/l6-苄氨基嘌呤、30g/l蔗糖、3mg/l甘草黄酮和8g/l琼脂的b5基础培养基；所述继代培养基由愈伤组织诱导培养基中添加苯丙氨酸而成，苯丙氨酸在继代培养基中的浓度为1.0mmol/l；2)选取生长旺盛、质地松散、状态稳定均一的所述长春花愈伤组织，接种到液体悬浮培养基中，然后往液体悬浮培养基中添加玻璃珠，在震荡摇床中进行高速振荡8min，摇床转速200rpm，然后置于光照摇床中进行培养，摇床转速为100rpm，光照强度2000lx，光照时间15h/day，每22天继代培养1次，继代培养5次，获得稳定遗传的长春花细胞系；其中，所述液体悬浮培养基为含有添加有甘草黄酮、白藜芦醇、6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸、蔗糖、色氨酸和水解酪蛋白的b5基础培养基，所述甘草黄酮的浓度为0.005mg/l，白藜芦醇的浓度为0.001mg/l，6-苄氨基嘌呤的浓度为0.08mg/l，萘乙酸的浓度为0.2mg/l，2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为0.06mg/l、蔗糖的浓度为30g/l，所述色氨酸的浓度为20mg/l，所述水解酪蛋白的含量为50mg/l；3)将步骤2)获得的长春花细胞系接种到液体悬浮培养基中进行诱导培养，以刺激长春花中生物碱的积累，所述诱导条件为：长春花细胞系在液体悬浮培养基培养第20天开始，通入0.03m3/h一氧化碳气体以及往液体悬浮培养基中添加0.1mg/l尼克酸、0.08mg/l蜕皮激素和0.05mg/l硫代硫酸银，使用波长为360nm的紫外光进行辐射，辐射强度为10μw/cm2，每辐射10min后停止辐射30min，直至该培养结束，获得富含长春碱的长春花细胞。与未添加色氨酸和水解酪蛋白的试验相比，添加色氨酸和水解酪蛋白能对长春碱的合成具有正调控的作用，研究表明添加色氨酸和水解酪蛋白后的能增强长春质碱合成酶活性55％和增强长春碱合成酶活性80％。与未通入一氧化碳以及未添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银的试验相比，采用荧光定量pcr技术测定d4h和dat基因的表达量，结果表明本实施例中的d4h和dat基因的表达量分别提高了128％和125％。d4h和dat基因是合成文多灵的关键酶，而文多灵是合成长春碱和长春新碱的重要前提，与未通入一氧化碳以及未添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，未进行紫外辐射的试验相比，本实施例长春花细胞中的文多灵含量提升了145％，长春碱含量提高了139％，说明通入一氧化碳以及添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银能促进细胞合成长春碱。比较例组1：未通入一氧化碳以及未添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，其他操作方法与实施例6完全相同，检测长春花细胞(细胞干重)中的长春碱的含量以及培养液中长春碱含量(单位质量培养液中长春碱的质量)，结果如表1所示。组2：未进行紫外辐射，其他方法操作方法与实施例6完全相同，检测长春花细胞(细胞干重)中长春碱的含量以及培养液中长春碱含量(单位质量培养液中长春碱的质量)，结果如表1所示。组3：未通入一氧化碳以及未添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，未进行紫外辐射，检测长春花细胞(细胞干重)中长春碱的含量以及培养液中长春碱含量(单位质量培养液中长春碱的质量)，结果如表1所示。表1长春碱含量(％)培养液(％)组11.410.34组22.640.98组31.400.31实施例63.350.12从表1结果可知，通入一氧化碳以及未添加尼克酸、蜕皮激素和硫代硫酸银，能增加长春碱的合成量，而使用紫外线辐射能避免长春花细胞合成的长春碱分泌到培养液中。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。当前第1页12