用于干细胞增殖和诱导的培养基的制作方法

本申请涉及干细胞生长培养基。本申请还涉及用于诱导成熟细胞或体细胞回复(revert)至较不成熟状态(lessmaturestate)的培养基。

背景技术：

干细胞疗法持有不仅能够治疗而且能够治愈许多后天疾病、可遗传症状以及创伤损伤后果的前景。然而，在干细胞疗法的前景能够变为现实之前，在目前的科学知识以及需要克服的技术和监管障碍中存在许多差距。首要问题涉及监管问题。fda将施加方针政策以确保在针对传统药物需要的那些之后期望被模型化的患者安全和产品再现性。这将意味着将需要从第1天使用确定的、可以计量的试剂并且在可再现性条件下生成开始作为干细胞的任何治疗细胞。在干细胞衍生的细胞用于治疗的情况下，这已经不可能。传统上，使用大量不确定组分的复杂混合物，人胚胎干(es)细胞以及人诱导多能性干(ips)细胞已经体外繁殖。尽管也已经使用人类饲养细胞，现行方法仍是在通常为鼠源(小鼠胚胎成纤维细胞：mef)的成纤维细胞饲养细胞层上培养es和ips细胞。许多人认为使用来自另一物种的细胞是不安全的。除了不同动物物种的问题之外，需要饲养细胞层将另一非再现性层引入系统；干细胞的生长需要由成纤维细胞饲养细胞分泌的因子。这些需要的因子尚未确定或量化。在远离使用饲养细胞的尝试中，干细胞已经在基质胶层上生长，所述基质胶层是获得自小鼠肉瘤细胞的未确定和不可量化因子的混合物。然而，只有加入来自饲养细胞的条件培养基时，干细胞才能够在基质胶层上生长。因此，基质胶方法不能提供用于产生细胞的确定条件。

通常已知的能够使人类干细胞生长的生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(bfgf，也称为fgf-2或简单的fgf)。在开发能够满足针对人类干细胞治疗的期望的fda监管的干细胞生长条件的努力中，近来的研究文章报导使用称为“e8”且不包含动物组分但包含极高水平的bfgf(与标准4ng/ml相比的100ng/ml)加tgf-β的确定的培养基，人胚胎干细胞和ips细胞能够生长。该培养基和所有其他基于fgf的培养基的主要问题在于称为“基”态或“原始(naive)”态细胞的真正多能性干细胞在fgf中不稳定(j.hanna,a.w.cheng,k.sahaetal.,procnatlacadsciusa107(20),9222(2010),jacobh.hanna,krishanusaha,andrudolfjaenisch,cell143(4),508(2010),j.nicholsanda.smith,cellstemcell4(6),487(2009))。这些报导总结：使用fgf或bfgf驱动人类干细胞从原始状态进入“致敏(始发，primed)”状态。“致敏”是误称。尽管致敏干细胞已经进行了一定程度的分化，然而这不会“致敏”它们或设置它们以分化成功能的人细胞。与此相反的是正确的。目前，科学研究表明致敏干细胞不能够分化成针对使用干细胞用于大多数(如果不是所有)治疗应用需要的人体内的任何细胞(fgf信号抑制人胚胎干细胞中的神经诱导。borisgreber,philippecoulon,miaozhang,sorenmoritz,stefanfrank,arnoldojosemuller-molina,marcosjarauzo-bravo,dongwookhan,hans-christianpapeandhansrscholer。embo期刊(2011)30,4874-4884)。例如，fgf生长干细胞不能够分化成针对治疗神经变性疾病如parkinson′s或alzheimer′s或治疗外伤性脊髓损伤需要的所有类型的神经元细胞。此外，研究者还不能够使人类干细胞以协调方式分化，因此，它们随机分化为许多细胞类型而用于疗法，人类想要针对那种治疗需要的单一类型的细胞。由于小鼠干细胞处于原始状态，当使用它们工作时研究者没有这些问题。e8培养基的另一问题是不被认为是生理相关的bfgf和tgf-β的异常高水平，因此，引起质疑的是生长因子的这些不自然的高水平是否将会引起另外的无法预料的问题。

总之，对于致敏和原始或基态干细胞之间的区别的近期研究的主体概括为fgf不是使得真正多能性人类干细胞生长的天然生长因子。在fgf存在下，不能够维持处于真正多能性状态(基态或原始态)的人类干细胞的事实表明在本领域中存在鉴别和使用支持真正的多能性人类原始干细胞生长的真正的生长因子用于产生或维持用于人类治疗法的人类干细胞的需要。用于原始干细胞的真正生长因子应该能够在多种培养基和培养条件下起作用，包括期望药物监管机构要求的那些。

技术实现要素：

在一个方面，本发明旨在用于细胞生长、维持和诱导回复至较不成熟状态且包含muc1*激活配体(activatingligand)的细胞培养基。在其中期望细胞增殖而不发生分化的情况下，细胞可以是干细胞或祖细胞，或细胞可以是体细胞、成熟细胞或祖细胞，其中期望成熟细胞或祖细胞被诱导为多能性细胞。优选地，细胞可以是人细胞。优选地，培养基可以不含bfgf、tgf-β、或两者。进一步地，在另一个方面，培养基可以不含血清。培养基可以进一步包含胰岛素、硒、转铁蛋白、1-抗坏血酸或非必需氨基酸。

在另一个方面，muc1*配体可以是nme家族蛋白。优选地，nme家族蛋白可以是nme1。nme1可以以二聚或设计(engineer)为具有两个亚基(subunit)的单链的两种单体存在。可替换地，nme家族蛋白可以是nme7或nme6。

在另一个方面，细胞培养基可以包含rho相关激酶抑制剂。细胞培养基可以包含鸟嘌呤交换因子抑制剂。鸟嘌呤交换因子抑制剂可以是六聚体形式的nme1或获得自(衍生自)nme1的肽。

在进一步的其他方面，细胞培养基可以进一步包含其他生长因子，如但不限于fgf-2或tgf-β。

在另一个方面，本发明旨在包括使细胞与nme家族蛋白的细胞培养基接触以刺激干细胞或祖细胞生长或诱导细胞回复至较不成熟状态的方法。

在该方法中，在其中期望细胞增殖而不发生分化的情况下，细胞可以是干细胞或祖细胞，或细胞可以是体细胞、成熟细胞或祖细胞，其中期望成熟细胞或祖细胞被诱导为多能性。优选地，细胞可以是人细胞。优选地，培养基可以不含bfgf、tgf-β、或两者。进一步地，在另一个方面，培养基可以不含血清。培养基可以进一步包含胰岛素、硒、转铁蛋白、1-抗坏血酸或非必需氨基酸。

优选地，nme家族蛋白可以是nme1。nme1可以以二聚或设计为具有两个亚基的单链的两种单体存在。可替换地，nme家族蛋白可以是nme7或nme6。

在本发明方法的另一个方面，细胞培养基可以包含rho相关激酶抑制剂。细胞培养基可以包含鸟嘌呤交换因子抑制剂。鸟嘌呤交换因子抑制剂可以是六聚体形式的nme1或获得自nme1的肽。在进一步的其他方面，细胞培养基可以进一步包含其他生长因子，如但不限于fgf-2或tgf-β。

在又一个方面，本发明涉及nme家族蛋白加上用于生长或维持干细胞或诱导为成熟细胞多能性的基础培养基和非必需氨基酸的细胞培养基。

在另一个方面，本发明旨在包括使细胞与处于无血清最小培养基(基本培养基，minimalmedia)的nme家族蛋白细胞培养基接触以刺激干细胞或祖细胞生长或诱导细胞回复至较不成熟状态的方法。

在又一个方面，本发明旨在包含干细胞群的组合物，其中，组合物进一步包含含有nme家族蛋白的无血清培养基。

在又一个方面，本发明涉及在其上是结合至祖细胞或干细胞的配体的表面上生长干细胞的方法，包括使细胞与包含nme家族蛋白的培养基接触。

在另一个方面，本发明旨在制造原始干细胞的纯群体(purepopulation)的方法，包括：(i)使细胞与包含nme家族蛋白的细胞培养基接触以获得原始干细胞的单集落(singlecolony)；(ii)分离原始干细胞的单集落；以及(iii)使集落与包含nme家族蛋白的细胞培养基接触以获得原始干细胞的纯群体。在以上步骤(i)中，可以获得约25％至60％、或30％至50％的原始状态的细胞。在以上方法中，在步骤(iii)中，原始干细胞群体的纯度可以是至少约80％、90％、99％或100％。

在另一个方面，本发明旨在由诱导多能性干细胞制造原始干细胞的纯群体的方法，包括：(i)使成熟细胞或祖细胞与包含nme家族蛋白的细胞培养基接触以获得原始干细胞的单集落；(ii)分离原始干细胞的单集落；以及(iii)使群体与包含nme家族蛋白的细胞培养基接触以获得原始干细胞的纯群体。步骤(i)中成熟细胞可以用多能性基因转染。成熟细胞或祖细胞可以是体细胞、成真皮细胞(dermablast)或成纤维细胞。在以上步骤(i)中，可以获得约25％至60％、或30％至50％的原始状态的细胞。在以上方法中，在步骤(iii)中，原始干细胞群体的纯度可以是至少约80％、90％、95％、99％或100％。

在一个方面，细胞培养基和使用以上指出的细胞培养基的方法可以包括含具有约25kda或约30kda的分子量的nme7的细胞培养基。nme7蛋白可以是nme7-ab。细胞培养基可以包含rho相关激酶抑制剂、在pi3k或rac通路中并且优选不存在rho激酶抑制剂下的信号蛋白的激活剂。或，细胞培养基可以进一步包含抑制nme1或nme2表达的核酸。

在又一个方面，本发明旨在产生人胚胎干细胞系的方法，包括：(i)使获得自胚泡的细胞与包含nme家族蛋白的细胞培养基接触；(ii)分离具有干细胞样(stem-like)形态的长出物(outgrowth)；(iii)使分离的长出物与包含nme家族蛋白的细胞培养基接触；以及(iv)以及分离具有期望核型以及表明细胞是多能性的多能性基因和原始基因(gene)的表达水平(expresslevel)的克隆。在该方法中，nme家族成员可以是nme7。nme7可以是nme7-ab。优选地，包含nme家族成员的培养基可以不含fgf。以上方法可以包括抑制细胞中的nme1和nme2的步骤。

在另一个方面，本发明旨在产生人诱导多能性干细胞系的方法，包括：(i)使获得自供体或患者的细胞与包含nme家族蛋白的细胞培养基接触；(ii)使细胞与诱导表达多能性基因oct4、sox2、nanog、klf4、c-myc或lin28的试剂接触；(iii)分离具有干细胞样形态的细胞；(iv)使分离的细胞与包含nme家族蛋白的细胞培养基接触；(v)分离具有期望的核型以及表明细胞是多能性的多能性基因的表达水平的克隆(克隆，clone)；以及(vi)以及在包含nme家族成员的培养基中繁殖克隆。在该方法中，nme家族成员可以是nme7。nme7可以是nme7-ab。包含nme家族成员的培养基优选不包含fgf。以上方法可以包括抑制细胞中的nme1和nme2的步骤。

附图说明

由本文中以下给出的详细描述以及仅通过说明给出而并非限制本发明的附图，将更充分地理解本发明，并且，其中：

图1示出了在nm23作为唯一的生长因子加上如描述的玻连蛋白表面上的rho激酶抑制剂，y27632的最小(基本，minimal)干细胞培养基“mm”中培养的完全融合(汇合，confluent)的未分化人类干细胞的放大的照相图像。

图2示出了在nm23作为唯一的生长因子而不存在如描述的玻连蛋白表面上的rho激酶抑制剂，y27632的最小干细胞培养基“mm”中培养的部分融合的未分化人类干细胞的放大的照相图像。

图3示出了具有bfgf、来自人类饲养细胞的50％条件培养基、hs27，加上如描述的玻连蛋白表面上的rho激酶抑制剂y27632的最小干细胞培养基“mm”中培养的完全融合的未分化人类干细胞的放大的照相图像。

图4示出了具有bfgf、来自人类饲养细胞的50％条件培养基、hs27，而不存在如描述的玻连蛋白表面上的rho激酶抑制剂y27632的最小干细胞培养基“mm”中培养的部分融合的未分化人类干细胞的放大的照相图像。

图5示出了具有nm23作为唯一的生长因子加上如描述的玻连蛋白表面上的rho激酶抑制剂y27632的完全确定的干细胞培养基(completelydefinedstemcellmedia)“mn6”中培养的融合的未分化人类干细胞放大的照相图像。

图6示出了具有nm23作为唯一的生长因子而不存在如描述的玻连蛋白表面上的rho激酶抑制剂y27632的完全确定的干细胞培养基“mn6”中培养的部分融合的未分化人类干细胞的放大的照相图像。

图7示出了具有nm23作为唯一的生长因子加上如描述的玻连蛋白表面上的rho激酶抑制剂y27632的最小的完全确定的干细胞培养基“mn2”中培养的部分融合的未分化人类干细胞的放大的照相图像。

图8示出了具有nm23作为唯一的生长因子而不存在如描述的玻连蛋白表面上的rho激酶抑制剂y27632的最小的完全确定的干细胞培养基“mn2”中培养的较差连接并分化的人类干细胞的放大的照相图像。

图9示出了为mn6加100ng/ml下的bfgf和tgf-β加如描述的玻连蛋白表面上的rho激酶抑制剂y27632的完全确定的干细胞培养基“e8”中培养的部分融合的未分化人类干细胞的放大的照相图像。

图10示出了为mn6加100ng/ml下的bfgf和tgf-β而不存在如描述的玻连蛋白表面上的rho激酶抑制剂y27632的完全确定的干细胞培养基“e8”中培养的较差连接且分化的人类干细胞的放大的照相图像。

图11的a-d示出了均具有nm23作为唯一的生长因子加抗-muc1*抗体表面上的rho激酶抑制剂y27632的最小干细胞培养基“mm”、a、c或mn6培养基b、d中培养的完全融合的未分化人类干细胞的放大的照相图像。

图12的a-d示出了具有均具有抗-muc1*抗体表面上的rho激酶抑制剂y27632的nm23b、d的mtesra、c或mn6培养基中培养的完全融合的未分化人类干细胞的放大的照相图像。

图13的a-d示出了与饲养细胞、基质胶(matrigel)、玻连蛋白或抗-muc1*涂覆的表面上的基于nme的培养基相比，用于基于fgf的培养基中培养的干细胞的多能性基因以及原始和致敏(始发态，primed)基因的rt-pcr测量结果的曲线图。

图14的a-d示出了其中来自人类干细胞和癌细胞的nme7结合至具有psmgfr肽序列的合成肽的拉下试验(pull-downassay)的蛋白质印迹。

图15是以二价或一价抗体浓度的函数测定的癌细胞生长的曲线图，表明刺激生长的muc1*受体的二聚。muc1阳性乳腺癌细胞zr-75-30的生长通过加入二价(ab)抗-muc1*刺激并且通过加入一价fab抑制。二价抗体的加入产生表明生长因子受体二聚化的特征钟形生长曲线。muc1阴性hek293细胞的生长不受二价或一价fab抗-muc1*的影响。当过量加入二价抗体时，存在结合至每一个受体的一个二价抗体而不是二聚每两个受体的一个二价抗体，从而抑制生长。

图16示出了fplc迹线的叠加(overlay)，其表征野生型nm23(wt)或突变体nm23-s120g的三种不同制剂的不同多聚化状态。野生型nm23示出了相应于六聚体的分子量的单峰和相应于较高阶多聚体的肩(shoulder)。没有复性(再折叠)的nm23-s120g(标记为“混合的”)的一种制剂具有相应于二聚体的主峰和四聚体的次峰。也没有复性的nm23-s120g(“六聚体”)的另一种制剂具有具备较高阶多聚体的肩的六聚体的主峰。nm23-s120g(“二聚体”)的复性制剂主要由二聚体组成。

图17的a示出了nm23-wt、混合的nm23-s120g、nm23-s120g-六聚体和nm23-s120g-二聚体的非还原性凝胶的照片，示出了野生型蛋白和s120g突变体的三种不同制剂的多聚化状态。图17的b示出了结合连接至spr芯片表面的muc1*胞外结构域肽(psmgfr)的不同的nm23多聚体的表面等离子体共振(spr)测量结果。图17的c示出了表明仅nm23二聚体结合至同源受体muc1*的纳米颗粒实验的照片。muc1*胞外结构域肽固定在金纳米颗粒上。图17的d-g示出了针对它们支持多能性干细胞生长的能力测试的不同nm23-h1多聚体。

图18示出了表明nm23-wt的多聚化状态对重组nm23-s120g的三种不同制剂的天然非变性凝胶。

图19示出了a)nm23野生型(wt)和b)产生60％二聚体的“混合”nm23-s120g的制剂的spr测量结果。

图20示出了基质胶(a、b、d、e)以及用抗-muc1*抗体、mn-c3(c、f)涂覆的细胞培养板上的最小干细胞培养基中的8nm的nm23变体中培养的人类es细胞、bgo1v/hog系的照片，(a-c)变体是p96sδc2，(d-f)变体是p96sδc6。这些变体不能复性或纯化，表明在使用之前它们不需要复性或纯化。

图21示出了nm23-s120g(复性的，“rs”)的主要群体以fplc迹线(a)中示出并且通过非还原page(b)验证的二聚体存在。混合并且以8nm在最小干细胞培养基下使用仅通过fplc纯化部分的二聚体以生长人es细胞、bgo1v/hog系。人类干细胞的(c-e)照片示出：在8nm的nm23变体中培养，是否在基质胶(c、f)或在用抗-muc1*抗体、mn-c3(e)涂覆的细胞培养基板上产生多能性干细胞。

图22示出已经在用mlif或nm23-s120g-rs补充的小鼠es细胞最小培养基中的失活的mef饲养细胞层上培养两天的小鼠胚胎干(es)细胞的照片。图像表明在具有mlif作为碱性生长因子的标准小鼠干细胞培养基中小鼠es细胞与使用nm23二聚体作为唯一的生长因子一样生长。

图23示出检测nm23-s120g二聚体中培养、mef上的bfgf中培养的人类干细胞或人类乳腺癌细胞中nme1(a、d)、nme6(b、e)或nme7(c、f)的存在或muc1*拉下试验中的nme同种型的存在的蛋白质印迹的照片。

图24示出了针对nme7特异性的抗体所探测的人胚胎干细胞溶解产物的蛋白质印迹的照片。

图25示出了在大肠杆菌中表达的nme7-1(a)和nme7-2(b)的sds-page的照片。

图25.1是来自nme7-1和nme7-2表达并且通过nta-ni柱纯化的非还原sds-page凝胶，表明在～40kda的期望分子量下有很少或没有蛋白表达。

图25.2是通过nta-ni柱的nme7-1和nme7-2纯化的洗脱物的蛋白质印迹，表明在～40kda的期望分子量下有一些nme7-1和nme7-2表达。

图26是来自nme7-ab和nme7-a表达并且通过nta-ni柱纯化的非还原sds-page凝胶，表明对于nme7-ab在～30kda的期望分子量下有良好表达(a)，但对于nme7-a在～14kda的期望分子量下没有良好表达(b)。

图27中的(a)是nme7-ab的尺寸排阻色谱法纯化的洗脱曲线；(b)是来自nme7-ab峰部分的非还原sds-page凝胶；(c)是纯化的nme7-ab的尺寸排阻色谱法的洗脱曲线。

图28的a-d是涂板后(接种后，post-plating)1天的重组nme7-ab或重组nm23(nme1)纯化二聚体中培养的人类ips干细胞的放大的照片。

图29的a-d是涂板后2天的重组nme7-ab或重组nm23(nme1)纯化二聚体中培养的人类ips干细胞的放大的照片。

图30的a-d是涂板后3天的重组nme7-ab或重组nm23(nme1)纯化二聚体中培养的人类ips干细胞的放大的照片。

图31的a-g示出了在基于fgf的培养基或基于nme的培养基中进行多能性诱导的体细胞的曲线图和照片。a-c是示出多能性诱导过程的第4天和第20天下的多能性标记的rt-pcr测量结果的曲线图。d-g示出了使用利用标准fgf培养基或省去一个多能性基因并且在nme1二聚体培养基中培养细胞的标准方法将代表性细胞诱导至多能性的共焦显微镜图像的照片。

图32的a-e示出了由癌细胞和干细胞的muc1*拉下试验导致的蛋白质印迹，其中，用针对nme1、nme6和nme7的抗体探测由muc1*抗体拉下(pulldown)的物种。

图33的a-c示出了纳米颗粒结合试验的照片，其中，将muc1*胞外结构域肽固定至sam涂覆的纳米颗粒上并且将nme蛋白以游离态添加至溶液中。由粉红色至蓝色的颜色变化表明溶液中的游离蛋白能够同时结合至两种不同纳米颗粒的两种肽上。

图34的a-f示出了在标准fgf培养基或nme7培养基中生长，然后针对dapi、oct4和h3k27me3染色(如果细胞具有表明其不再是完全原始态的失活x染色体时，其染色在细胞核(红点)中浓缩的组蛋白-3)的人胚胎干(es)细胞的照片。

图35示出了在nme1(nm23-s120g二聚体)培养基中生长，然后针对dapi、oct4和h3k27me3(如果细胞具有表明其不再是完全原始态的失活x染色体时，其染色在细胞核(红点)中浓缩的组蛋白-3)染色的人胚胎干(es)细胞的照片。

图36的a-h示出了在nme1(nm23-s120g二聚体)培养基中生长，然后针对dapi、oct4和h3k27me3(如果细胞具有表明其不再是完全原始态的失活x染色体时，其染色在细胞核(红点)中浓缩的组蛋白-3)染色的人胚胎干(es)细胞的照片。

图37的a-d示出了在nme1(nm23-s120g二聚体)培养基中生长，然后针对dapi、oct4和h3k27me3(如果细胞具有表明其不再是完全原始态的失活x染色体时，其染色在细胞核(红点)中浓缩的组蛋白-3)染色的人胚胎干(es)细胞的照片。

图38的a-h示出了在nme1(nm23-s120g二聚体)培养基中生长，然后针对dapi、oct4和h3k27me3(如果细胞具有表明其不再是完全原始态的失活x染色体时，其染色在细胞核(红点)中浓缩的组蛋白-3)染色的人胚胎干(es)细胞的照片。

图39的a-h示出了在nme1(nm23-s120g二聚体)培养基中生长，然后针对dapi、oct4和h3k27me3(如果细胞具有表明其不再是完全原始态的失活x染色体时，其染色在细胞核(红点)中浓缩的组蛋白-3)染色的人胚胎干(es)细胞的照片。

图40示出了前x染色体失活(pre-x-inactivation)作为传代数和细胞是否在nme1或nme7中培养的函数的自动计数的细胞百分数的条形图。

图41a示出了来自其中起于1,000、3,000或5,000单个接种细胞的离散群体用表明在基于nme的培养基中培养的干细胞具有～20％的克隆效率的碱性磷酸酶染色的克隆效率(克隆效率，cloningefficiency)试验的人胚胎干细胞的照片。

图41b示出了来自其中起于1,000、3,000或5,000单个接种细胞的离散群体用表明在基于fgf的培养基中培养的干细胞具有～1％的克隆效率的碱性磷酸酶染色的克隆效率试验的人胚胎干细胞的照片。

图41c示出了用于克隆效率试验的细胞数计数的表格。

图42示出了用抗-muc1*抗体(mn-c3或mn-c8)涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制剂(roci)的情况下，在最小干细胞培养基(mm)或甚至更小的称为mn6的培养基中的nme1二聚体(“nm23-rs”)中培养的6孔组织培养板上接种的人类ips细胞第2天的照片(4x)。

图43示出了用抗-muc1*抗体(mn-c3或mn-c8)涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制剂(roci)的情况下，在最小干细胞培养基(mm)或甚至更小的称为mn6的培养基中的nme1二聚体(“nm23-rs”)中培养的6孔组织培养板上接种的人类ips细胞第2天的照片(10x)。

图44示出了用抗-muc1*抗体(mn-c3或mn-c8)涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制剂(roci)的情况下，在最小干细胞培养基(mm)或甚至更小的称为mn6的培养基中的nme7中培养的6孔组织培养板上接种的人类ips细胞第2天的照片(4x)。

图45示出了用抗-muc1*抗体(mn-c3或mn-c8)涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制剂(roci)的情况下，在最小干细胞培养基(mm)或甚至更小的称为mn6的培养基中的nme7中培养的6孔组织培养板上接种的人类ips细胞第2天的照片(10x)。

图46示出了用基质胶涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制剂(roci)的情况下，在最小干细胞培养基(mm)或甚至更小的称为mn6的培养基中的nme7中培养的6孔组织培养板上接种的人类ips细胞第2天的照片(4x)。

图47示出了用基质胶涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制剂(roci)的情况下，在最小干细胞培养基(mm)或甚至更小的称为mn6的培养基中的nme7中培养的6孔组织培养板上接种的人类ips细胞第2天的照片(10x)。

图48示出了用基质胶涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制剂(roci)的情况下，在最小干细胞培养基(mm)或甚至更小的称为mn6的培养基中的nme7中培养的6孔组织培养板上接种的人类ips细胞第4天的照片(10x)。

图49示出了用基质胶涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制剂(roci)的情况下，在最小干细胞培养基(mm)或甚至更小的称为mn6的培养基中的nme7中培养的6孔组织培养板上接种的人胚胎干(es)细胞第3天的照片(10x)。

图50示出了用基质胶涂覆，然后在存在或不存在rho激酶抑制剂(roci)的情况下，在最小干细胞培养基(mm)或甚至更小的称为mn6的培养基中的nme1二聚体(“nm23-rs”)中培养的6孔组织培养板上接种的人胚胎干(es)细胞第3天的照片(10x)。

图51示出了在存在或不存在rho激酶抑制剂(roci)的情况下，用于接种在基于fgf的培养基(mm或e8中的标准bfgf)、或添加至mm培养基的nme7、或mn6培养基中培养的基质胶上的干细胞的多能性基因以及原始和致敏(primed)基因的rt-pcr测量结果的曲线图。

图52示出了用于接种在用识别muc1*胞外结构域(mn-c3)的抗体涂覆并且在向其加入nm23二聚体(nme1s120g二聚体)或nme7的mm最小培养基中培养的塑料制品(plasticware)上的人胚胎干细胞的原始和致敏基因的rt-pcr测量结果的曲线图。

图53示出了用于接种在用抗-muc1*抗体(c3)、mef饲养细胞涂覆的塑料制品或基质胶上的人类es细胞的多能性基因以及原始和致敏基因的rt-pcr测量结果的曲线图。在最小培养基(mm)加nm23(nme1二聚体)或nme7-ab中培养vita/c3抗体表面上的细胞。在mm加fgf中培养通过mef接种的细胞。在存在或不存在rho激酶抑制剂(roci)的情况下，在mm培养基或mn6培养基中的nme7中培养基质胶上的细胞用于单次传代。

图54示出了用于接种在用抗-muc1*抗体(c3)、mef饲养细胞涂覆的塑料制品或基质胶上的人类es细胞的多能性基因以及原始和致敏基因的rt-pcr测量结果的曲线图。在最小培养基(mm)加nm23(nme1二聚体)或nme7-ab中培养vita/c3抗体表面上的细胞。在mm加fgf中培养通过mef接种的细胞。在存在或不存在rho激酶抑制剂(roci)的情况下，在mm培养基或mn6培养基中的nm23(nme1二聚体)中培养基质胶上的细胞用于单次传代。

图55的a-c示出了表明nme7物种在干细胞溶解产物(a、c)和干细胞条件培养基(b)中表达的蛋白质印迹的照片。

图56示出了探测其中一些oct4、nme1、nme6或nme7被抑制而细胞在包含nme7的培养基中被培养的人类干细胞中的nme7物种的蛋白质印迹的照片。

图57示出了其中由nme7拉下试验获得的蛋白质在凝胶、离体带上分离并且通过质谱分析的sds-page凝胶的照片。质谱表明由nme7抗体拉下的低分子量(～23kda)物种也是nme7，但是nme7物种中的肽序列均映射至nme7的ndpka结构域。

图58示出了来自表明nme7-ab使muci*胞外结构域肽二聚化的elisa夹心式试验的hrp信号的曲线图。

图59示出了表明nme6在大肠杆菌中表达和纯化的sds-page凝胶的照片。

具体实施方式

定义

主要通过psmgfr序列(gtinvhdvetqfnqykteaasrynltisdvsvsdvpfpfsaqsga(seqidno:6))定义muc1*胞外结构域。由于muc1裂解的确切部位取决于修剪其的酶，并且裂解酶根据细胞类型、组织类型或细胞进化的时间变化，muc1*胞外结构域的准确序列可以在n-端变化。

为数1-10个的nme家族蛋白是由于它们均具有至少一个ndpk(核苷二磷酸激酶)结构域而分组在一起的蛋白。在一些情况下，ndpk结构域在能够催化atp转化为adp方面不起作用。nme蛋白被正式称为nm23蛋白、编号h1、h2等。在此，术语nm23和nme可互换。在此，术语nme1、nme2、nme6和nme7用于指原始蛋白以及nme变体(变异体)。在一些情况下，这些变体在大肠杆菌中更易溶解、表达更好或比原始序列蛋白更易溶解。例如，如在说明书中使用的nme7可以指原始蛋白或变体，如由于变异使得可溶解、适当复性的蛋白在大肠杆菌中高产率表达的具有优越的商业应用的nme7-ab。如本文中论及的“nme1”可与“nm23-h1”互换。还预期的是本发明不受限于nme蛋白的确切序列。贯穿本申请，可互换地使用也称为nm23-s120g的突变体nme1-s120g。由于它们对于二聚体(但本文中可论及的是作为nm23二聚体或nme1二聚体)形成的优先性，优选s120g突变体和p96s突变体。

如在本文中所论及的nme7旨在指原始nme7或增加产率、可溶解性或使得nme7更有效或商业更可行的其他性能的变体。

如在本文中使用的，fgf、fgf-2、或bfgf是指成纤维细胞生长因子。

如在本文中使用的，rho相关激酶抑制剂可以是小分子肽或蛋白(rathn,olsonmf.rho-associatedkinasesintumorigenesis:re-consideringrockinhibitionforcancertherapy.emborep.2012；13(10):900-8)。rho相关激酶抑制剂的实例是y27632、ha-1077(也称为法舒地尔)、h-1152和thiazovivin(olsonmf.(针对rock激酶抑制剂的应用)applicationforrockkinaseinhibition.curropincellbiol.2008；20(2):242-8；watanabek,uenom,kamiyad,etal.(rock抑制剂允许相关人胚胎干细胞的生存)arockinhibitorpermitssurvivalofdissociatedhumanembryonicstemcells.natbiotechnol.2007；25(6):681-6；breitenlechnerc,gasselm,hidakah,etal.proteinkinaseaincomplexwithrho-kinaseinhibitorsy-27632,fasudil,andh-1152p:structuralbasisofselectivity.structure.2003；11(12):1595-607；lint,ambasudhanr,yuanx,etal.achemicalplatformforimprovedinductionofhumanipscs.natmethods.2009；6(11):805-8)。除了rho激酶抑制剂之外，本发明想象使用代替rho激酶抑制剂的相关路径的抑制剂。例如，在相同路径中，鸟嘌呤交换因子(gef)是rho激酶的上游。gef活化rho激酶。因此，代替使用rho激酶抑制剂，本发明想象使用gef抑制剂。由于当结合至gdp时，rho激酶处于失活状态，可以使用增加存在于细胞如rad、gem、和rhoe以及其他中的gdp的量的任何试剂代替rho激酶抑制剂以帮助干细胞生长、存活和连接至它们所在位置处的表面(rientok,guaschrm,gargr,jinb,ridleyaj(2003)(rhoe结合至rocki并抑制下游信号)rhoebindstorockiandinhibitsdownstreamsignaling.molcellbiol23:4219-4229；komanderd,gargr,wanpt,ridleyaj,barfordd(2008)来自rock-i:rhoe复合物结构的多位磷酰化机理(mechanismofmulti-sitephosphorylationfromarock-i:rhoecomplexstructure).emboj27:3175-3185；wardy,yapsf,ravichandranv,matsumuraf,itom,spinellib,kellyk(2002)gtp结合蛋白gem和rad是rho-rho激酶路径的隐性调节(thegtpbindingproteinsgemandradarenegativeregulatorsoftherho-rhokinasepathway).jcellbiol157:291-302)。肌球蛋白也处于与rho激酶一样的路径中。肌球蛋白间接地由rho激酶活化并且因此在相同路径中作为rho激酶的下游。因此，根据本发明的方法，也可以使用肌球蛋白抑制剂代替rho激酶抑制剂以帮助干细胞存活和/或帮助干细胞连接至表面。blebbistatin是肌球蛋白抑制剂并且可以用于代替根据本发明的方法使用的任何rho激酶抑制剂(ohgushim,matsumuram,eirakum,murakamik,aramakit,nishiyamaa,etal.负责人类多能性干细胞中的离解-诱导凋亡的分子路径和细胞状态(molecularpathwayandcellstateresponsiblefordissociation-inducedapoptosisinhumanpluripotentstemcells).cellstemcell2010；7:225-39；ohatah,ishigurot,aiharay,etal.通过rho激酶抑制剂引入干细胞样细胞调节剂cd44有助于维持结肠癌症起始细胞(inductionofthestem-likecellregulatorcd44byrhokinaseinhibitioncontributestothemaintenanceofcoloncancer-initiatingcells).cancerres.2012；72(19):5101-10)。

在此处和其他地方，rho激酶抑制剂简称为roci或rocki。具体的rho激酶抑制剂的使用旨在示例性的并且可以替换为任何其他的rho激酶抑制剂。

序列表自由文本(sequencelistingfreetext)

关于除a、g、c、t的核苷酸符号的使用，它们遵循wipo标准st.25，附录2，表1中列出的规则，其中，k代表t或g；n代表a、c、t、或g；m代表a或c；r代表a或g；s代表c或g；w代表a或t，并且y代表c或t。

asanl(seqidno:1)描述了全长muc1受体(粘蛋白1前体，genbank登录号：p15941)。

mtpgtqspffllllltvlt(seqidno:2)

mtpgtqspffllllltvltvvta(seqidno:3)

mtpgtqspffllllltvltvvtg(seqidno:4)

seqidnos：2、3和4描述了用于将muc1受体和截短的同种型指向细胞膜表面的n-端muc-1信号序列。在由seqidnos：2、3和4中的变体指明的c-端可以缺失多达3个氨基酸残基。

gtinvhdvetqfnqykteaasrynltisdvsvsdvpfpfsaqsgagvpgwgiallvlvcvlvalaivylialavcqcrrknygqldifpardtyhpmseyptyhthgryvppsstdrsryekvsagnggsslsytnpavaaasanl(seqidno:5)描述了在其n-端具有nat-psmgfr并且包括跨膜和全长muc1受体的细胞质序列的截短muc1受体同种型。

gtinvhdvetqfnqykteaasrynltisdvsvsdvpfpfsaqsga(seqidno:6)描述了muc1生长因子受体(nat-psmgfr-“psmgfr”的实例)的天然一级序列(primarysequence)。

tinvhdvetqfnqykteaasrynltisdvsvsdvpfpfsaqsga(seqidno:7)描述了muc1生长因子受体(nat-psmgfr-“psmgfr”的实例)的天然一级序列，在seqidno:6的n-端具有单一的氨基酸缺失。

gtinvhdvetqfnqykteaaspynltisdvsvsdvpfpfsaqsga(seqidno:8)描述了具有增强的稳定性的muc1生长因子受体(var-psmgfr-“psmgfr”的实例)的天然一级序列的“spy”功能变体。

tinvhdvetqfnqykteaaspynltisdvsvsdvpfpfsaqsga(seqidno:9)描述了具有增强的稳定性的muc1生长因子受体(var-psmgfr-“psmgfr”的实例)的天然一级序列的“spy”功能变体，在seqidno:8的c-端具有单一的氨基酸缺失。

tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg(seqidno:10)描述了muc1细胞质结构域核苷酸序列。

cqcrrknygqldifpardtyhpmseyptyhthgryvppsstdrspyekvsagnggsslsytnpavaaasanl(seqidno:11)描述了muc1细胞质结构域氨基酸序列。

gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggtatgttgaatacactatattcagtacattttgttaataggagagcaatgtttattttcttgatgtactttatgtatagaaaataa(seqidno:12)描述了nme7核苷酸序列(nme7：genbankaccessionab209049)。

dpetmnhserfvfiaewydpnasllrryellfypgdgsvemhdvknhrtflkrtkydnlhledlfignkvnvfsrqlvlidygdqytarqlgsrkektlalikpdaiskageiieiinkagftitklkmmmlsrkealdfhvdhqsrpffneliqfittgpiiameilrddaicewkrllgpansgvartdasesiralfgtdgirnaahgpdsfasaaremelffpssggcgpantakftnctccivkphavsegmlntlysvhfvnrramfiflmyfmyrk(seqidno:13)描述了nme7核苷酸序列(nme7：genbankaccessionab209049)。

atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(seqidno:14)描述了nm23-h1核苷酸序列(nm23-h1：genbankaccessionaf487339)。

mvllstlgivfqgegppisscdtgtmancertfiaikpdgvqrglvgeiikrfeqkgfrlvglkfmqasedllkehyvdlkdrpffaglvkymhsgpvvamvweglnvvktgrvmlgetnpadskpgtirgdfciqvgrniihgsdsvesaekeiglwfhpeelvdytscaqnwiye(seqidno:15)nm23-h1描述了氨基酸序列(nm23-h1：genbankaccessionaf487339)。

atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(seqidno:16)描述了nm23-h1s120g突变体核苷酸序列(nm23-h1：genbankaccessionaf487339)。

mvllstlgivfqgegppisscdtgtmancertfiaikpdgvqrglvgeiikrfeqkgfrlvglkfmqasedllkehyvdlkdrpffaglvkymhsgpvvamvweglnvvktgrvmlgetnpadskpgtirgdfciqvgrniihggdsvesaekeiglwfhpeelvdytscaqnwiye(seqidno:17)描述了nm23-h1s120g突变体氨基酸序列(nm23-h1：genbankaccessionaf487339)。

atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa(seqidno:18)描述了nm23-h2核苷酸序列(nm23-h2：genbankaccessionak313448)。

manlertfiaikpdgvqrglvgeiikrfeqkgfrlvamkflraseehlkqhyidlkdrpffpglvkymnsgpvvamvweglnvvktgrvmlgetnpadskpgtirgdfciqvgrniihgsdsvksaekeislwfkpeelvdykscahdwvye(seqidno:19)描述了nm23-h2氨基酸序列(nm23-h2：genbankaccessionak313448)。

最佳用于大肠杆菌表达的人nm23-h7-2序列。

(dna)

atgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(seqidno:20)

(氨基酸)

mhdvknhrtflkrtkydnlhledlfignkvnvfsrqlvlidygdqytarqlgsrkektlalikpdaiskageiieiinkagftitklkmmmlsrkealdfhvdhqsrpffneliqfittgpiiameilrddaicewkrllgpansgvartdasesiralfgtdgirnaahgpdsfasaaremelffpssggcgpantakftnctccivkphavsegllgkilmairdagfeisamqmfnmdrvnveefyevykgvvteyhdmvtemysgpcvameiqqnnatktfrefcgpadpeiarhlrpgtlraifgktkiqnavhctdlpedgllevqyffkildn-(seqidno:21)

人nme7-a：

(dna)

atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga(seqidno:22)

(氨基酸)

mektlalikpdaiskageiieiinkagftitklkmmmlsrkealdfhvdhqsrpffneliqfittgpiiameilrddaicewkrllgpansgvartdasesiralfgtdgirnaahgpdsfasaaremelff-(seqidno:23)

人nme7-a1：

(dna)

atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga(seqidno:24)

(氨基酸)

mektlalikpdaiskageiieiinkagftitklkmmmlsrkealdfhvdhqsrpffneliqfittgpiiameilrddaicewkrllgpansgvartdasesiralfgtdgirnaahgpdsfasaaremelffpssggcgpantakft-(seqidno:25)

人nme7-a2：

(dna)

atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga(seqidno:26)

(氨基酸)

mnhserfvfiaewydpnasllrryellfypgdgsvemhdvknhrtflkrtkydnlhledlfignkvnvfsrqlvlidygdqytarqlgsrkektlalikpdaiskageiieiinkagftitklkmmmlsrkealdfhvdhqsrpffneliqfittgpiiameilrddaicewkrllgpansgvartdasesiralfgtdgirnaahgpdsfasaaremelff-(seqidno:27)

人nme7-a3：

(dna)

atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga(seqidno:28)

(氨基酸)

mnhserfvfiaewydpnasllrryellfypgdgsvemhdvknhrtflkrtkydnlhledlfignkvnvfsrqlvlidygdqytarqlgsrkektlalikpdaiskageiieiinkagftitklkmmmlsrkealdfhvdhqsrpffneliqfittgpiiameilrddaicewkrllgpansgvartdasesiralfgtdgirnaahgpdsfasaaremelffpssggcgpantakft-(seqidno:29)

人nme7-b：

(dna)

atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(seqidno:30)

(氨基酸)

mnctccivkphavsegllgkilmairdagfeisamqmfnmdrvnveefyevykgvvteyhdmvtemysgpcvameiqqnnatktfrefcgpadpeiarhlrpgtlraifgktkiqnavhctdlpedgllevqyff-(seqidno:31)

人nme7-b1：

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atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(seqidno:32)

(氨基酸)

mnctccivkphavsegllgkilmairdagfeisamqmfnmdrvnveefyevykgvvteyhdmvtemysgpcvameiqqnnatktfrefcgpadpeiarhlrpgtlraifgktkiqnavhctdlpedgllevqyffkildn-(seqidno:33)

人nme7-b2：

(dna)

atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(seqidno:34)

(氨基酸)

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人nme7-b3：

(dna)

atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(seqidno:36)

(氨基酸)

mpssggcgpantakftnctccivkphavsegllgkilmairdagfeisamqmfnmdrvnveefyevykgvvteyhdmvtemysgpcvameiqqnnatktfrefcgpadpeiarhlrpgtlraifgktkiqnavhctdlpedgllevqyffkildn-(seqidno:37)

人nme7-ab：

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atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(seqidno:38)

(氨基酸)

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人nme7-ab1：

(dna)

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(氨基酸)

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最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-a序列

(dna)

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(氨基酸)

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最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-a1序列

(dna)

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(氨基酸)

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最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-a2序列

(dna)

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(氨基酸)

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最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-a3序列

(dna)

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(氨基酸)

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最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-b序列

(dna)

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(氨基酸)

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最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-b1序列

(dna)

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(氨基酸)

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最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-b2序列

(dna)

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(氨基酸)

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最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-b3序列

(dna)

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(氨基酸)

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最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-ab序列

(dna)

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(氨基酸)

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(seqidno:59)

最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-ab1序列

(dna)

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(氨基酸)

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小鼠nme6

(dna)

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(氨基酸)

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人nme6

(dna)

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(氨基酸)

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人nme61

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(氨基酸)

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人nme62

(dna)

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(氨基酸)

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人nme63

(dna)

atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga(seqidno:70)

(氨基酸)

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用于大肠杆菌表达优化的人nme6序列

(dna)

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(氨基酸)

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用于大肠杆菌表达优化的人nme61序列

(dna)

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(氨基酸)

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用于大肠杆菌表达优化的人nme62序列

(dna)

atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga(seqidno:76)

(氨基酸)

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用于大肠杆菌表达优化的人nme63序列

(dna)

atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga(seqidno:78)

(氨基酸)

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origene-nme7-1全长

(dna)

gacgttgtatacgactcctatagggcggccgggaattcgtcgactggatccggtaccgaggagatctgccgccgcgatcgccatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttctctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataatacgcgtacgcggccgctcgagcagaaactcatctcagaagaggatctggcagcaaatgatatcctggattacaaggatgacgacgataaggtttaa(seqidno:80)

(氨基酸)

mnhserfvfiaewydpnasllrryellfypgdgsvemhdvknhrtflkrtkydnlhledlfignkvnvfsrqlvlidygdqytarqlgsrkektlalikpdaiskageiieiinkagftitklkmmmlsrkealdfhvdhqsrpffneliqfittgpiiameilrddaicewkrllgpansgvartdasesiralfgtdgirnaahgpdsfasaaremelffpssggcgpantakftnctccivkphavsegllgkilmairdagfeisamqmfnmdrvnveefyevykgvvteyhdmvtemysgpcvameiqqnnatktfrefcgpadpeiarhlrpgtlraifgktkiqnavhctdlpedgllevqyffkildntrtrrleqkliseedlaandildykddddkv(seqidno:81)

abnovanme7-1全长(氨基酸)

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abnova部分nme7-b

(氨基酸)

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组氨酸标签

(ctcgag)caccaccaccaccaccactga(seqidno:84)

链霉亲和素(strept)ii标签

(accggt)tggagccatcctcagttcgaaaagtaatga(seqidno:85)

muc1*的配体

本发明人先前公开了muc1*受体的配体可以起生长因子、并且特别是用于干细胞和祖细胞的生长因子的功能。nme家族蛋白(先前称为nm23)是muc1*的配体。因为nme蛋白均具有ndpk(核苷酸二磷酸激酶)结构域，因此它们分组在一起。表达的或纯化的nme1或nme2使得主要群体以二聚体存在，在没有饲养细胞、它们的抽提物、血清或任何其他细胞因子存在的情况下支持胚胎多能干细胞或诱导性多能干细胞的生长。本文中，我们报道了nme7也是muc1*的配体并且也在没有饲养细胞、它们的抽提物、血清或任何其他细胞因子存在的情况下支持胚胎多能干细胞或诱导性多能干细胞的生长。nme6、nme1和nme2均具有单个ndpk结构域并且为相近的分子量。nme7是它们的分子量的两倍并且包含两个ndpk结构域。与nme1相似，nme6可以以二聚体存在。因此，二聚形式的nme1、nme2和nme6和nme7是用于生长干细胞或祖细胞(其包括但不限于，间充质干细胞、造血干细胞、多能干细胞和原始态干细胞干细胞)以及用于维持或诱导多能性的优选的nme家族蛋白。特别优选的是nme1和nme7。更优选的是二聚形式的nme和nme7。并不意在将本发明限于天然形式的蛋白质。为了商业的优势，可以将蛋白制备为带有突变、截短或另外的序列的重组蛋白。本文中，该nme7变异体被简单地称为nme7，因为本发明并不意在由具体的变异体所限制，具体的变异体可以提高所表达的重组蛋白的产率、溶解度等。此外，本发明设想使用nme1或nme6的单链变异体，其中，单链蛋白质由两个连接的单体组成，其中，每个单体可以由单一的ndpka或ndpkb结构域组成。

诱导性多能性

已经示出强势表达(forcedexpression)转录因子的组合oct4、sox2、klf4和c-myc或oct4、sox2、nanog和lin28引起成熟细胞回复至多能性状态(takahashiandyamanaka,2006)。诱导多能性的每个转录因子调节约十二个基因的转录。在这些之中，有一些本发明人已经确定为muc1-相关的因子。oct4和sox2结合至muc1启动子自身。多能性蛋白sox2和nanog结合至nme7启动子，强调其对于干细胞的多能性的重要性。由本发明人先前将nm23(也被称为nme)确定为muc1*的激活配体(mahanta等人，2008)。nme7是muc1*的激活配体。oct4和sox2均结合至mmp16(申请人在本文中公开其为muc1的切割酶)的启动子。oct4、sox2或nanog也结合至切割酶mmp2、mmp9、mmp10、adamtsl-1、adamts-4、adam-17(muc1切割酶)、adam-ts16、adam-19和adam-28的启动子位点。这些切割酶中的一些或全部可以被上调以增强muc1至muc1*形式的切割以诱导或维持多能性(boyer等人，2005)。综上，清楚的是muc1*(切割形式)和其配体nme7是多能性的激活剂，因为关键的多能性蛋白sox2和nanog结合至nme7启动子而oct4和sox2结合至muc1启动子，并且开启这些基因的表达。

申请人先前的使用胚胎干细胞(其仅表达muc1的切割形式，muc1*)的工作示出其胞外域的二聚化刺激生长并且抑制分化(hikita等人，2008)。通过使用优先形成二聚体的二价抗mucl*抗体(图15)、重组nm23或突变体nm23(s120g)使muc1*胞外域二聚实现了这些效果(kim等人，2003)。使用一价抗muc1*fab抑制muc1*胞外域在数小时内是致死的。

进行表面等离子体共振(spr)实验，其表明仅nme1二聚体结合至muc1*胞外结构域肽。图17的a示出nm23-wt、nm23-s120g-混合、nm23-s120g-六聚体和nm23-s120g-二聚体的非还原凝胶的照片，其示出了野生型蛋白和s120g突变体的三个不同的制剂的多聚化状态。图17的b示出了表面等离子体共振(spr)测量结果的重叠图(overlay)，示出四个不同的nm23结合至附着于spr芯片表面的muc1*胞外结构域肽(psmgfr)的能力。结果示出nm23与其同源受体muc1*的结合的量是存在于样品中的二聚体的量的函数。spr在芯片-溶液界面处测量蛋白质量，因此如果六聚体结合至muc1*肽表面，其将产生大于如果是二聚体结合的3倍的spr信号。图17的c示出纳米粒子实验的照片，其示出仅nm23二聚体结合至同源受体muc1*。muc1*胞外结构域肽被固定到金纳米粒子上。将nm23-wt、nm23-s120g-二聚体或nm23-s120g-六聚体中的任一种加入每个等分样品的纳米粒子。如果nm23结合至纳米粒子固定的muc1*肽，其将引起纳米粒子变得被牵引靠拢在一起，其引起溶液从粉红色变化为蓝色。实验示出仅nm23-s120g-二聚体结合至muc1*肽。加入抗mucl*fab竞争地抑制溶液中nm23-s120g-二聚体与纳米粒子上的muc1*肽的结合。图17的d-图17的g示出针对它们支持多能干细胞增长的能力测试的不同的nm23多聚体。在图17的d-nm23-s120g-二聚体、图17的e-nm23-s120g-六聚体、图17的f-nm23-wt或图17的g-nm23-s120g-二聚体加muc1*胞外结构域肽(psmgfr)的任一种中培养人类es(胚胎干)细胞以竞争地抑制nm23二聚体与muc1*受体在干细胞表面上的结合。诱导分化是容易观察的(集落变厚、变暗)，以(g)、(e)、(f)的顺序，示出了与在其并不结合至muc1*的nm23六聚体中进行培养细胞一样，抑制nm23-二聚体-mucl*相互作用诱导分化。仅nm23-s120g的二聚体制剂(d)能够支持未分化干细胞生长。

图18示出天然、非变性凝胶，其示出nm23-wt与重组nm23-s120g的三个不同制剂比较的多聚状态。

图19示出a)nm23野生型(wt)和b)nm23-s120g-“混合”的制剂(其产生60％二聚体)的spr测量结果。以五个不同的浓度注射蛋白。结果示出了与nm23-wt相比，8倍的nm23-s120g-混合蛋白结合至muc1*胞外结构域肽表面。因为该野生型蛋白是六聚体，ru的数目必须除以3以与结合的二聚体的量相比。尽管野生型和s120g-二聚体两者示出在结合中的浓度依赖性，结合的野生型六聚体的量是如此少使得其仍然可以在系统的噪声范围之内。

这些发现显示muc1*是重要的“严格(stermness)”因子。此外，oct4和sox2结合至muc1基因启动子并且也结合至其切割酶的启动子。sox2和nanog结合至nm23(nme7)启动子。由于阻断muc1*的胞外域对于hes细胞是致命的，由此可见多能性基因oct4、sox2和nanog结合至muc1、其切割酶和其激活配体nme7的启动子位点，并且诱导它们的muc1的表达。可以通过转染该基因或引入针对仅muc1*或除了其切割酶和/或激活配体(nme7、nme-h1、nme-h2)的基因产物或使muc1或muc1*的psmgfr表位二聚的抗体，可以代替已经示出诱导多能性的一种或多种基因或基因产物。

使用标准方案(其使用基于fgf的培养基)或改变的方案(其使用基于nme的培养基)进行实验以测试在体细胞中诱导多能性的效率。

常规使用的标准方案是首先将成真皮细胞(dermablast)或成纤维细胞(新生的人包皮成纤维细胞，“hffn”：#pc501a-hff，systembiosciences，mountainview，ca)接种在塑料板上并且在每24小时更换的成纤维细胞培养基(fm)中培养它们。在5天之后，将细胞转移至用灭活的(inactivated)成纤维细胞饲养细胞(其可以是小鼠的(mef)或人类的(hs27))涂覆的表面。对于紧接着2天，细胞保持在fm中。在第7天，将培养基更换为基于bfgf的培养基并且每24小时更换培养基。最初的接种后～2-4周，选择具有胚胎干(es)细胞样形态的集落(克隆)并且单独接种至涂覆有灭活的饲养细胞(mef或hs27)的新孔中，并且连续地每3-4天传代(passage)。增殖(propagate)继续如es-样细胞生长的孔并且针对多能性标记的存在进行测试。

与常规使用的标准方案相反，我们始终在nme培养基中(nme1二聚体：“nm23-mm-a”)培养体细胞。此外，我们在成纤维细胞饲养细胞的层上或在抗mucl*抗体(识别该n-10psmgfr肽的c3或c8)的层上接种细胞。在第4天(图31的a)或第20天(图31的b)进行rt-pcr测量以量化在各种条件下表达的oct4的量。在第4天，唯一的条件(其产生诱导多能性，如通过oct4的表达水平测量的)是对于用oct4、sox2和klf4(“osk”)(无c-myc)转染的成纤维细胞并且培养在最小培养基(“mm”)的nme1二聚体中。对于那些细胞oct4为起始细胞的119倍并且为培养在成纤维细胞培养基中的相同细胞的接近200倍。在第20天，仅用三个基因(osk)转染的并且培养在表达nm23-mm-a中的细胞为对照的109倍表达oct4。随后将已经用oskm转染的并且始终培养在nm23-mm中的、具有是培养在成纤维细胞培养基(fm)中的相同的细胞3倍的oct4表达的细胞转换至bfgf培养基(标准)，同时培养在fm中随后转换至nm23-mm中的细胞仅具有是培养在fm中随后培养在bfgf-m中的细胞的1.3倍的oct4表达。在第20天对于多能性标记tra1-60的细胞的免疫细胞化学染色示出使用基于nme的培养基在细胞中诱导多能性的主要优势。与用所有的四个多能性基因oct4、sox2、klf4和c-myc转染的、并且根据标准方案在fgf培养基中培养的细胞(图31的d、图31的e)相比，用oct4、sox2和klf4转染的、并且在在最小培养基中的nme1二聚体中并且在在没有加入fgf的情况下培养细胞具有在诱导多能性的效率方面的巨大增加(图31的f、图31的g)。用三个多能性基因oct4、sox2和klf4转染的细胞，不具有可检测的多能性标记并且缺少干细胞样形态。

在优选的实施方式中，nm23(nm23-h1、nm23-h2或nme7)以编码其的基因、以蛋白本身或以带有前导序列如聚精氨酸束(poly-arginetract)的蛋白被引入至细胞，以促进进入细胞中，以帮助诱导或维持多能性。发明人最近示出了当nm23是由多能干细胞(以及癌细胞)分泌时，其是muc1的切割形式——muc1*的激活配体并且引发map激酶增殖途径。示出nm23刺激muc1*以促进多能性hesc的生长并且抑制它们的分化(hikita等人，2008)。nm23还诱导c-myc的转录(dexheimer等人，2009)并且取代对c-myc的需要。外源地加入其天然状态的nm23以激活muc1*生长因子受体或外源地加入具有聚精氨酸束的nm23以促进进入细胞和细胞核，其中其诱导c-myc表达。可以以编码核苷酸或以有或者没有促进进入细胞的修饰的表达蛋白加入nm23(nme)。可以以它们的天然状态或以有利于二聚状态的突变体形式如s120g突变体或nme7使用nmel或nme2。

在本发明的另一方面，将结合至muc1*的胞外域(psmgfr)的二价抗体或二聚的muc1*配体如nm23，或编码它们的基因加入至muc1*表达细胞以诱导多能性、提高诱导多能性的效率、维持多能性或抑制分化。这些muc1或muc1*互相作用蛋白被加入于其中的细胞可以是天然存在的细胞或是已经加入基因以诱导干细胞样特征的那些细胞、或已经进入分化过程或可以是干细胞。

用于诱导多能性的基因可以被引入至相同的或不同的质粒上，其可以是慢病毒载体(lentiviralvector)驱动的或腺病毒载体或任何整合的或非整合的病毒性载体或非病毒载体，或是有利于将这些基因引入期望细胞的任何其他系统。

在很多情况下，优选通过引入蛋白本身而不是编码它们的核苷酸或基因以实现多能性诱导蛋白的效果。本发明包括在此公开的用于诱导干细胞样特征或多能性的基因，其可以由基因产物、以它们的天然状态或具有如聚精氨酸束(丛，tracts)的前导序列的修饰的蛋白质代替，以使得能够进入该细胞。这些基因的产物，即蛋白质，或与该转染基因的一种或多种产物相互作用的其他蛋白质被引入细胞以诱导或维持多能性或其他干细胞样特征。

nm23蛋白如但不限于nme-h1、nme-h2、nme6或nme-7提高多能性的诱导或维持。将nm23连同一种或多种先前确定的多能性因子(包括但不限于oct4、sox2、klf4以及本文中公开的其他因子)一起引入。

nm23家族蛋白

nm23作为蛋白家族存在，其中，在这些蛋白之中共同的是存在核苷二磷酸激酶(ndpk)结构域，其催化atp至adp的转化。nm23先前被称为肿瘤转移因子。其中近来识别的十个nm23家族成员，它们现在也被称为nme蛋白1-10(boissan等人，molcellbiochem(2009)329:51-62,"themammaliannm23/ndpkfamily:frommetastasiscontroltociliamovement,")。

科学家们首先从人类白血病细胞分离了分化抑制剂并示出添加该因子阻断某些类型的白血病细胞和骨髓细胞的化学诱导的分化(okabe-kado,1985,cancerresearch45,4848-4852,"characterizationofadifferentiation-inhibitoryactivityfromnondifferentiatingmousemyeloidleukemiacells)；该抑制剂随后被确定为nme1(nm23-hl)(okabe-kado,1992,"identityofadifferentiationinhibitingfactorformousemyeloidleukemiacellswithnm23/nucleosidediphosphatekinase",biochembiophysrescomm,182no.3987-994)。白血病细胞是终末分化被阻断的血细胞。有趣地，示出抑制白血病细胞的分化的能力不依赖其催化结构域。在ndpk结构域中的突变(其丧失(abrogate)其酶活性)对蛋白质阻断一些类型的白血病细胞的分化的能力没有影响。然而，关于nm23是否抑制分化、促进分化或完全没有效果，随后数十年的科学文献描绘了完全混乱的景象。

许多研究论文提供了表明nm23诱导分化的证据。rosengard等人，1989、dearolf等人1993和timmons等人1993报道了在体内，对于适当的分化，果蝇(drosophila)nm23同源生物awd是需要的。lakso等人1992报道了nm23(小鼠体内)随着组织分化的开始增加，暗示其诱导分化。yamashiro等人1994报道了在人红白血病细胞的分化期间在体外nm23水平升高。lombardi等人1995得出结论，nm23(小鼠体外)随着细胞分化的开始增加，再次表明nm23诱导分化。gervasi1996，报道了过表达nm23(大鼠体外)诱导神经元分化并随着反义dna抑制的分化下调nm23。amendola等人1997示出了在人神经母细胞瘤细胞中转染nm23增加了分化。

与报道nm23诱导分化的许多研究论文直接抵触，相等数量的论文在相同的期间内报道了相反结果：nm23抑制分化。munoz-dorado等人1990发现，ndk(粘球菌(myxococcus)nm23同源物)对生长是必要的但是在发育期间是下调的，暗示其存在将抑制分化。okabe-kado1992示出了在体外分化抑制剂(随后由相同的研究组确定为nm23)抑制小鼠白血病的分化。yamashiro等人1994报道了在人类巨核母细胞的分化期间nm23水平降低，与nm23抑制分化一致。okabe-kado1995示出了重组nm23抑制白血病细胞系hel、ku812和k562的红系(erythroid)分化，但并不抑制祖代(progenitors)hl60、u937或hel/s细胞的单核细胞或粒性白细胞分化。venturelli等人1995报道了nm23过表达抑制人类造血祖细胞(hematopoieticprogenitors)的g-csf依赖的粒性白细胞分化。willems等人1998发现，当人类cd34+造血祖细胞从骨髓细胞分化时，nm23表达降低。2002年，willems等人示出nm23对细胞增殖没有影响，并不诱导或抑制分化但是使cd34+细胞的分化朝向红系后代(lineage)偏斜。

在2000年的一篇综述中，lombardi概括了与nm23在分化中的功能有关的这些和其他矛盾的结果并且得出结论，“尽管nm23基因在控制细胞分化中的功能正在被广泛地研究中，nm23表达水平和这种过程之间的功能联系仍然有待于彻底地阐明”。换言之，仍不理解nm23和分化之间的功能联系。

本发明人先前发现muc1切割产物muc1*的生长因子受体功能由诱导其胞外结构域的二聚化的配体激活，并且该muc1*的配体是nm23。本发明人进一步证明是二聚体形式的nm23抑制分化并且支持干细胞和祖细胞的生长。此外，发明人发现nm23物质诱导多能性。我们现在已经发现一些nm23家族成员具有干细胞相关功能。nme1(nm23-h1)仅当其是二聚体时促进干细胞生长和抑制分化。nme6具有与nme1大致的相同的分子量并且据报道在海绵(suberitesdomuncula)中以二聚体存在(perina等人，2011，"characterizationofnme6-likegene/proteinfrommarinespongesuberitesdomuncula"naunyn-schmiedeberg'sarchpharmacol,384:451-460)。尽管nme7(nm23-h7)是单体(monomelic)蛋白，本发明人已经发现其功能类似于二聚体。其包含两个ndpk催化结构域，为nme1或nme6单体的分子量的约两倍，并且是由人类胚胎干细胞(es)和诱导性多能干细胞(ips)表达和分泌的(参见图23和图24)。从干细胞排除(depletion)nme7和nme1引起该细胞分化(数据未显示)。在夹心酶联免疫分析(elisa)试验中，重组nme7(nme7-ab)同时结合至两个muc1*胞外结构域肽，其中，两个肽为完整的psmgfr序列。第一肽通过c-末端半胱氨酸结合至卵清蛋白并且被涂覆到elisa板上。加入重组nme7产生显著的特异性结合而有甚少或没有背景。随后将nme7添加至肽表面至饱和。第二psmgfr肽带有组氢酸标签或生物素分子。随后，加入hrp标记的抗his标签抗体或链霉亲和素，其示出第二muc1*肽与nme7的强的并且浓度依赖性的结合。结果示出了单体的nme7能够在细胞表明使muc1*二聚。

nme7也可以以～25kda分子量的小蛋白质存在。随后通过质谱法进行干细胞裂解物和上清液的拉下实验(pulldownassay)。小分子量形式的nme7均包含来自其ndpka结构域而非来自b结构域的肽序列。这可以是可变剪接同种型或切割产物。与nme1相似，该小a结构域nme7可以二聚。

nme家族蛋白在细胞和组织发育的不同的时期差别表达。尽管我们在胚胎干细胞中检测nme6、nme7和nme1，在成熟(成体，adult)细胞或成熟干细胞中，仅nme1和nme2是常规表达的。因为nme1形成六聚体(其诱导而不是抑制干细胞分化)，由此可见nme6和nme7在胚胎发育中和在真正的多能干细胞中早期表达，因为它们不能形成六聚体。

在胚胎发育的最早期阶段中，生长和分化的抑制将是默认的，在晚期阶段中，当达到某个密度的干细胞时，当想要开始分化时，六聚体的调节功能变得重要。支持我们的发现，boyer等人(boyer等人，2005，"coretranscriptionalregulatorycircuitryinhumanembryonicstemcells",cell,vol.122,947-956)报道了多能性诱导性蛋白sox2和nanog结合至nme7而非其他nme家族成员的启动子，表明其是表达的第一个nme蛋白并且与其可以诱导或维持多能性而不能形成六聚体(其关闭(turnoff)其功能)的概念相一致。boyer等人还报道了多能性诱导性蛋白sox2和oct4结合至muc1(切割为muc1*之后nme7的靶受体)的启动子。sox2和oct4还结合至muc1切割酶mmp-16的启动子。事实上，这些多能性诱导性蛋白冗余结合至muc1、其切割酶和其配体(nme7)的启动子，说明该蛋白亚型(subset)对多能性来说是重要的并且nme7是在发育胚胎中表达的第一多能性蛋白。如果人类干细胞培养在偏好形成二聚体的nm23变异体中，则nme7由人类干细胞高表达。

实施例7描述了这样的实验，其中bgolv人类胚胎干细胞生长在已经再折叠并纯化以主要地作为二聚体存在的nm23-s120g中(图16-图17)、生长在抗mucl*单克隆抗体mn-c3的涂层上或培养在小鼠成纤维细胞饲养细胞上的bfgf中。生成的细胞的蛋白质印迹示出nme7在已经培养在nm23-s120g二聚体中的干细胞中高表达(图23部分ic-泳道1)但是在培养在bfgf中的干细胞中弱表达(泳道2)。这些结果暗示培养在nm23二聚体中的干细胞回复到更具多能性的状态(也称为原始态干细胞)，然而培养在bfgf中的干细胞驱动干细胞进入更加分化的状态(称为“致敏”(primed)状态)。研究显示在致敏状态中的干细胞不能分化为任何细胞类型，而真正的多能干细胞应当是能够的。

jaenisch和同事报道了原始状态的一组标记和其是致敏状态的特征的第二组标记(j.hanna,a.w.cheng,k.sahaetal.,procnatlacadsciusa107(20),9222(2010),jacobh.hanna,krishanusaha,andrudolfjaenisch,cell143(4),508(2010))。进行实验其中将人类胚胎干细胞(es)或诱导的多能性干细胞(ips)培养在各种最小培养基中的nme1二聚体或在nme7中或将它们培养在基于fgf的培养基中。也改变将干细胞接种于其上的表面。对于培养在基于nme培养基中(与基于fgf的培养基相比)的细胞，随后进行rt-pcr测量以测量原始基因对比致敏基因的表达水平。就一切情况而论，与培养在基于fgf的培养基中的细胞相比，基于nme的培养基产生的干细胞处于更原始状态。例如，与在最小培养基(mm)的nme1二聚体中、其中细胞被接种在涂覆有抗mucl*抗体的塑料皿(plasticware)上的相同来源的细胞相比，在最小培养基(mm)中的fgf中、在mef饲养细胞上生长的细胞具有较高表达的致敏标记和较低表达的原始标记。另一个基于fgf的培养基称为mtesr甚至进一步更差，具有超高水平的致敏基因和较低水平的原始基因(图13)。随着先前培养在fgf中的干细胞被转移至基于nme的培养基，随着连续的传代数，存在朝向表达较高水平的原始基因和较低水平的致敏基因的趋势。作为该趋势的实施例之一，参见实施例13c。这些结果与在细胞核中的组蛋白-3的测量一致，其是原始态干细胞的更有说服力的决定性因素(determinant)。组蛋白-3作为浓缩的点在致敏干细胞的细胞核中而不是在原始干细胞的细胞核中被检测到。100％的fgf生长的细胞在致敏状态中并且在它们的细胞核中具有浓缩的(condensed)组蛋白-3。通过在nme1二聚体或nme7中第6次传代，约25-30％的干细胞(其已经先前地在fgf中生长)被转变至完全的原始态干细胞，其是前-x-失活(pre-x-inactivation)。通过第10次传代，在真实的原始态干细胞中的百分比增加至50-60％。这些的一些实例参见图34-图40。这些结果与在图23部分i.c中示出的发现一致。将泳道1与泳道2相比较，nme7在较大程度上在期望的原始干细胞中表达，原始干细胞能够分化为人体中的任何细胞类型。因此，增加nme7在细胞中的表达的策略，例如通过引入能够引起nme7的表达的核苷酸或通过加入nme7蛋白、或偏好形成二聚体的nme突变体或变异体的方法，是维持多能性、维持在胚胎干细胞或诱导性多能干细胞中的原始干细胞状态和/或在更成熟的细胞类型(包括体细胞、成真皮细胞和成纤维细胞)中诱导多能性的策略。除了nme7或nme1二聚体形成或二聚体模拟性变异体外，这些策略可以包括异位(ectopic)表达多能性基因oct4、sox2、nanog、klf4或c-myc中的一种或多种。

nme以单一蛋白存在但是结构上由两个单体组成因此以二聚体行使功能。nme7包含两个ndpk结构域，其部分结合至muc1*生长因子受体。实施例7也描述了称为拉下实验的结合实验。在这些实验中，muc1*胞外结构域肽被附着于珠上，其随后用来自bgolv人类胚胎干细胞的裂解物孵育。在洗涤步骤并从该珠释放之后，在sds-page凝胶上分离由与muc1*肽相互作用俘获的物质，随后用抗nme7抗体探测(probed)。图23部分ii-f)-泳道1示出nme7结合至muc1*胞外结构域。nme7中部分的双ndpk结构域结合至muc1*生长因子受体并使其二聚，其激活维持多能性、诱导多能性并抑制干细胞和祖细胞的分化的途径。

nme6以二聚体存在，并且抵抗形成高阶多聚体(higherordermultimers)。nme6二聚体结合至muc1*生长因子受体并使其二聚，其激活维持多能性、诱导多能性并抑制干细胞和祖细胞的分化的途径。与偏好二聚体形成的nme1突变体和变异体相似，nme6和nme7两者能够维持并且诱导多能性并且抑制干细胞和祖细胞(包括ips细胞)的分化。

与偏好二聚体形成的nme1突变体和变异体相似，可以将nme6和nme7外源地加入至干细胞(胚胎干细胞或诱导的多能性干细胞)或祖细胞以诱导生长、维持它们为未分化状态或抑制它们的分化。可以将nme6和nme7外源地加入至干细胞或祖细胞以诱导多能性。此外，可以将偏好二聚体形成的编码nme1突变体和变异体的核苷酸nme6和/或nme7或它们的变异体包括相当于二聚体的单链变异体引入细胞以诱导细胞回复至低分化状态或将细胞维持在低成熟状态。

因为nme在所有物种中是高度保守的，在本文中所描述的方法既不意在限制为人类nme物质也不意在限制为与人细胞一起使用。

在本发明的另一方面，我们发现加入外源的nme7充分地维持干细胞生长和多能性、抑制分化并且也能够诱导多能性。nme7是具有两个ndpk结构域(a和b)的单体蛋白。迄今为止，其功能尚未被阐明。先前仅已知nme7在睾丸、卵巢和大脑中表达。怀疑nme7参与鞭毛的运动性并且由于缺乏某些关键残基而并不认为具有ndpk活性。

将在大肠杆菌中表达并且作为可溶蛋白分泌的nme7添加到在缺少任何其他生长因子、饲养细胞的最小量干细胞培养基或它们的条件培养基中培养的人类干细胞。通过附着至识别干细胞表面抗原的抗体层，干细胞被吸附到细胞培养板上。以这种方式，避免了由存在于表面涂层如基质胶(matrigel)中的生长因子和其他细胞因子的干扰。

作为对比，将来自相同来源的干细胞并列培养，但代替加入外源的重组nme，加入已经复性并纯化的、作为二聚体的群体的重组nm23-h1(也被称为nme1)(参见实施例9并且实施例10以及图25-图30)。在nme7和nm23-h1二聚体两者中，干细胞增殖而没有分化。图27-图30示出细胞具有干细胞形态，因为它们以具有高的核质比例(nucleustocytoplasmratio)的一层细胞生长。此外，免疫细胞化学和定量的pcr示出生成的细胞两者都表达多能性标记但是不表达分化标记如foxa2和mir-145。细胞计数示出培养在nme7中的干细胞产生了是培养在nm23-h1二聚体中的那些的1.4倍的细胞。这代表了在现有技术水平上的显著的改进，因为nm23-h1同种型可以以二聚体、四聚物或六聚体存在，其中，仅二聚体是活性形式并且六聚体诱导分化。因此，添加仅激活如nme7的nme形式是有利的。由商业的观点出发，其是更加成本有效的以产生nme7，由于其作为单体是活性的、表达在大肠杆菌中并且作为可溶蛋白分泌。这消除了变性、复性、诱导形成二聚体和作为二聚体的稳定群体分离的问题和费用。也可以体外或体内外源地加入nme7以诱导细胞回复到低成熟状态或在体细胞中诱导多能性。在一些情况下，当加入外源nme7时，使用sirna、反义核苷酸或任何其他用于抑制基因表达的方法抑制nm23-h1(nme1)的表达可以是有利的。如我们已经证明的，nm23-h1(nme1)随着其浓度增加形成四聚体和六聚体，其随后诱导分化。因此，本发明的又一个方面在于，当期望细胞分化至更加成熟的状态时，外源地加入nmel六聚体或遗传诱导nmel以在干细胞内表达。

为了辅助蛋白表达和纯化，制备并测试了一些nme7结构。尽管先前已经报道了可以使用小麦胚芽细胞抽提物在体外表达系统中表达nme7(mw36.52kda)以及在人类hek293细胞中表达nme7(mw38kda)，我们发现可以在大肠杆菌中将基本上仅包含ndpka和b结构域的小的结构表达为具有很高产率的可溶蛋白。我们制备了具有组氨酸标签或链霉亲和素标签的nme7-ab，然而可以制备没有亲和标记或具有任何其他亲和标记的那些。nme7-ab促进多能性并抑制人类干细胞的分化，与先前由申请人示出的充分支持干细胞生长、维持多能性、能够的诱导多能性以及抑制分化的nmel(nm23-h1)二聚体一样好甚至更好。我们的实验示出nme7可以替代nmel二聚体而不影响(threatof)随着时间形成六聚体，并且处于更加成本有效的以及商业的可应用的方式。

nme家族蛋白跨越(across)所有的物种(包括植物)是高度保守的。因此，本发明的nme家族成员、同种型以及变异体，特别是nmel、nme6以及nme7结构的序列，可以由来自任何物种的序列或来自不同物种的序列的组合组成，其中优选哺乳动物物种，更优选小鼠物种，并且最优选人类物种。这些nme家族成员、同种型和变异体可以用于在任何物种中扩增、自我更新、维持多能性，诱导多能性或抑制分化，其中，优选哺乳动物物种，更优选小鼠物种并且最优选人类物种。

二聚形式的nmel或nme7也可以用于维持原始人类干细胞或用于从致敏状态的干细胞诱导原始干细胞或用于在产生ips细胞的过程中从体细胞制备原始干细胞。原始态干细胞特征在于，与在包含bfgf的培养基中生长的干细胞相比，多能性基因oct4、klf2和nanog或klf4的高表达水平以及foxa2、otx、lhx和xist的低表达水平。原始态干细胞的更加有说服力的指标是细胞尚未经历x-失活。高水平的xist是x染色体之一失活的指标，但是更加明确的决定性因素是组蛋白3的免疫细胞化学染色。如果已经发生x-失活，组蛋白3是浓缩的(condensed)并且可以可见为细胞的细胞核中的离散的物质。如果x尚未失活，组蛋白3是末检出的或遍及细胞核分散，有时被称为“云”。

与培养在fgf中并且在基于nme的培养基中至少8-10次传代之后在～50％的细胞的细胞核中同样也不具有可检测的或浓缩的组蛋白3的细胞相比，培养在nme1二聚体中在nme7中的胚胎干细胞(es)和诱导性多能干细胞(ips)两者都产生具有降低水平的foxa、otx、lhx和xist的干细胞。培养在基于nme的培养基中持续6次传代的细胞仅有25％的该细胞为前x-失活，其是原始态干细胞的标记。除了异位表达性基因外，通过用各种生化试剂和抑制剂处理细胞而能够将致敏的干细胞暂时地回复至原始态干细胞的研究人员(j.hanna,a.w.cheng,k.sahaetal.,procnatlacadsciusa107(20),9222(2010),jacobh.hanna,krishanusaha,andrudolfjaenisch,cell143(4),508(2010))报告说在10,000个细胞中约1个处于原始态干细胞中。通过使用单细胞克隆技术，他们能够分离原始人类干细胞的纯的群体，但是它们是不稳定的并且仅可以维持在原始态干细胞下持续数代，在大多数情况下少于5代。出于原始态干细胞中的干细胞的另一个指标是细胞具有较高的克隆效率(cloningefficiency)，其计算为每给定的接种的细胞数量中可以计数的离散的集落的数目。通过培养在包含mlif(鼠科动物白血病诱导因子)的培养基中，小鼠干细胞(其与人类干细胞不同)的克隆效率被容易地维持在原始状态中，为～30％。通过严格(stark)对比，培养在基于fgf的培养基中的人类干细胞的克隆效率为-1％。培养在nme1二聚体中的胚胎干细胞具有18％的克隆效率而培养在nme7中的相同细胞具有23％的克隆效率。然而，这些是仅具有通过组蛋白-3染色在原始态干细胞中的细胞的约50％的细胞群体。因此，在该群体中的原始细胞的实际的克隆效率为测量的20％的至少2倍，其为约40％克隆效率，高于小鼠原始干细胞的克隆效率。总之，这些数据表明培养在nme1或nme7中的干细胞从致敏状态回复至原始态干细胞并且维持在原始态干细胞中。

本发明同样设想nme1或nme7产生基本上是100％的多能性并且在原始态中的干细胞的群体的应用。仅通过在包含nme1二聚体或nme7的培养基中培养目前商业可获得的es或ips细胞，产生为约50％在完全原始态中的细胞群体。使用本领域技术人员已知的克隆技术，如极限稀释(limitingdilution)，在原始干细胞和致敏干细胞的混合群体上，产生全部在原始态中的干细胞的群体。在本发明的又一个方面，产生新的干细胞系。使用先前所描述的技术产生胚胎干细胞系(embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts.jamesa.thomson,josephitskovitz-eldor,sanders.shapiro,michellea.waknitz,jenniferj.swiergiel,viviennes.marshall,jeffreym.joneseial.science282,1145(1998)；doi:10.1126/science.282.5391.1145；isolationofembryonicstem(es)cellsinmediasupplementedwithrecombinantleukemiainhibitoryfactor(lif).shirleypease,paolabraghetta,jdavidgearing,diannegrail,andr.lindsaywilliamsdevelopmentalbiology141,344-352(1990))除了不是在fgf中培养细胞(其驱使天然原始细胞进入致敏状态)外，细胞被培养在包含nme7或nmel的培养基中，其中，至少一些nmel蛋白质处于二聚状态下，更优选其中至少25％的该蛋白处于二聚状态下并且甚至更优选其中至少50％的该蛋白为二聚体。在一方面，细胞衍生自人类囊胚(blastcyst)的内细胞群(innercellmass)并培养在包含nme7或nmel二聚体的培养基中。在本发明的另一方面，通过培养在包含nme或nmel二聚体的培养基中，体细胞，如成真皮细胞或成纤维细胞被诱导回复到较不成熟状态。在本发明的又一个方面，通过用一种或多种多能性基因oct4、sox2、klf4、nanog、c-myc或lin28转导(transducing)体细胞、成真皮细胞或成纤维细胞，或通过用那些基因的产物(即蛋白)或用引起蛋白产生并且在包含nmel二聚体或nme7的培养基存在下可引起蛋白产生的试剂处理细胞产生了ips细胞系。概括来说，本发明设想使用将细胞诱导回复至较不成熟状态(包括多能性状态)的任何方法，通过在nmel二聚体或nme7的存在下培养细胞，产生新的ips细胞系，其是以更高的效率产生的或是与通过传统方法(其包括使用fgf)产生的ips细胞相比处于更原始状态中。在优选的实施方式中，排除了使用fgf。在另一个优选的实施方式中，经历产生ips细胞的方法的细胞不转移到成纤维细胞饲养细胞上。

用于生长干细胞的表面

并不意在通过干细胞或经历诱导多能性的细胞生长于其上的表面的性质限制本发明。用于干细胞生长或诱导多能性的任何合适的表面可以与包含nmel、nme6或nme7的培养基一起使用。这些表面包括但不限于，饲养细胞、基质胶、水凝胶、整联蛋白(integrin)和整联蛋白衍生物、上皮细胞钙粘蛋白(e-cadherin)和上皮细胞钙粘蛋白衍生物、玻连蛋白、细胞表面受体的抗体、识别muc1*胞外结构域的抗体、识别psmgfr序列的抗体、vita^tm牌的平板(thermofisher)、涂覆有抗mucl*抗体的vita^tm平板等。将可以形成稳定二聚体的nme1突变体和变异体(p96s、s120g突变体和单链结构)添加至最小干细胞培养基(mm)并用于增殖干细胞，该干细胞生长在基质胶表面或抗mucl*抗体涂覆的表面上。在全部三个培养基中以及在两种表面上，干细胞的生长和它们抵抗自发分化的能力基本相等(图20，图21)。一些表面负面影响生长于其上的干细胞的质量。饲养细胞分泌迄今仍未知的因子，其引起致敏状态干细胞。整联蛋白，如玻连蛋白，结合至细胞表面上的同源受体并产生生物学信号，对于维持原始态干细胞干细胞其可能是或可能不是期望的。原始和致敏状态的标记的测量结果示出，附着于玻连蛋白的粘附层的干细胞，即使当培养在nme1二聚体中时，具有致敏标记的增加和原始标记的表达的减少。在优选的实施方式中，表面(其可以是塑料的、可生物降解的、网筛或固体、平的或颗粒样的)涂覆有识别muc1*胞外结构域(主要由psmgfr序列组成)的抗体。在仍然更优选的实施方式中，表面是涂覆有识别psmgfr肽的抗体的vita^tm牌的平板。在更优选的实施方式中，该抗mucl*抗体识别psmgfr肽的n端部分，包括n端15个氨基酸。

在一些情况下，rho激酶抑制剂被用于提高细胞与表面的粘附力。许多rho激酶抑制剂，包括但不限于ha100、y27632和thiozivincan被用于辅助提高干细胞与表面、特别是涂覆有抗mucl*抗体的塑料制品的表面的粘附力。对于目前可获得的大多数干细胞系，加入rho激酶抑制剂仅持续第一个24-48小时。

可替换地，将鸟嘌呤交换因子(gef)的抑制剂而不是rho激酶抑制剂添加至培养基持续至少一部分的培养期以提高与不是细胞或由复杂细胞混合物组成的表面如基质胶的粘附力。在一些情况中使用gef的抑制剂而不是rho激酶抑制剂以提高干细胞与涂覆有抗mucl*抗体的表面的附着。在本发明的一方面，鸟嘌呤交换因子抑制剂是六聚体形式的nme1。在本发明的另一方面，鸟嘌呤交换因子抑制剂是衍生自nme1的肽。

对于致敏干细胞或致敏干细胞和原始干细胞的混合群体与某些表面(如涂覆有抗mucl*抗体的平板)的最大的粘附力，rho激酶或鸟嘌呤交换因子的抑制剂可能是需要的。然而，纯的原始干细胞的群体不需要使用rho激酶抑制剂或鸟嘌呤交换因子抑制剂。在本发明的一方面，在没有fgf或rho激酶抑制剂的情况下培养纯的原始干细胞的群体。

rho激酶抑制剂是抑制rho激酶i或ii的试剂。它们可以是小分子、肽或蛋白rathn,olsonmf.rho-associatedkinasesintumorigenesis:re-consideringrockinhibitionforcancertherapy.emborep.2012；13(10):900-8。rho激酶抑制剂的实例是y27632、ha-1077(也称为法舒地尔)、h-1152和thiazovivin(olsonmf.applicationsforrockkinaseinhibition.curropincellbiol.2008；20(2):242-8；watanabek,uenom,kamiyad,etal.arockinhibitorpermitssurvivalofdissociatedhumanembryonicstemcells.natbiotechnol.2007；25(6):681-6；breitenlechnerc,gasselm,hidakah,etal.proteinkinaseaincomplexwithrho-kinaseinhibitorsy-27632,fasudil,andh-1152p:structuralbasisofselectivity.structure.2003；ll(12):1595-607；lint,ambasudhanr,yuanx,etal.achemicalplatformforimprovedinductionofhumanipscs.natmethods.2009；6(ll):805-8)。除了rho激酶抑制剂外，本发明设想使用相关途径的抑制剂代替rho激酶抑制剂。例如，在相同途径中，鸟嘌呤交换因子(gef)为rho激酶的上游。gef激活rho激酶。因此代替使用rho激酶抑制剂，本发明设想使用gef抑制剂。由于当结合至gdp时rho激酶处于非活性状态，增加存在于细胞中的gdp的量的任何试剂，如rad、gem和rhoe以及其他，可以用于代替rho激酶抑制剂以辅助干细胞生长、生存并附着至表面(rientok,guaschrm,gargr,jinb,ridleyaj(2003)rhoebindstorockiandinhibitsdownstreamsignaling.molcellbiol23:4219-4229；komanderd,gargr,wanpt,ridleyaj,barfordd(2008)mechanismofmulti-sitephosphorylationfromarock-i:rhoecomplexstructure.emboj27:3175-3185；wardy,yapsf,ravichandranv,matsumuraf,itom,spinellib,kellyk(2002)thegtpbindingproteinsgemandradarenegativeregulatorsoftherho-rhokinasepathway.jcellbiol157:291-302)，在它们的位置中。肌球蛋白也在与rho激酶相同的路径中。通过rho激酶间接地激活肌球蛋白并因此在相同途径中是rho激酶的下游。因此，根据本发明的方法，肌球蛋白抑制剂也可以用于代替rho激酶抑制剂以帮助干细胞生存和/或帮助干细胞附着至表面。ii型肌球蛋白抑制剂(blebbistatin)是肌球蛋白抑制剂并可以用于代替根据本发明的方法所使用的任何rho激酶抑制剂(ohgushim,matsumuram,eirakum,murakamik,aramakit,nishiyamaa,etal.molecularpathwayandcellstateresponsiblefordissociation-inducedapoptosisinhumanpluripotentstemcells.cellstemcell2010；7:225-39；ohatah,ishigurot,aiharay,etal.inductionofthestem-likecellregulatorcd44byrhokinaseinhibitioncontributestothemaintenanceofcoloncancer-initiatingcells.cancerres.2012；72(19):5101-10)。另一个替换方式是使用rho相关的激酶抑制剂以激活或抑制引起增加的细胞迁移的任何靶。增加细胞迁移的rac途径的激活效应物(activationofmodulators)，包括pi3k、cdc42、pak、n-wasp以及rac1和片足(lamellipodium)。提高它们在细胞中的表达水平或增加它们的活性的试剂被用于提高干细胞存活和与表面的附着。rac1鸟苷三磷酸酶(gtpase)表达随着干细胞分解降低并相反地rho相关激酶提高，其导致细胞迁移和凋亡的损失(ohgushim,matsumuram,eirakum,etal.molecularpathwayandcellstateresponsiblefordissociation-inducedapoptosisinhumanpluripotentstemcells.cellstemcell.2010；7(2):225-39.)因此，应当抑制pi3k或rac路径的抑制剂，或增加rac路径的激活子以提高干细胞存活和与表面的附着，使得抗体涂层(其中抗体结合至干细胞表面蛋白如muc1*、六聚体形式的nme1和nme2，同样也为六聚体形式)分别结合至geftiaml和dbl-1以抑制鸟苷三磷酸酶rac1和cdc42鸟苷三磷酸酶((ohgushim,matsumuram,eirakum,etal.molecularpathwayandcellstateresponsiblefordissociation-inducedapoptosisinhumanpluripotentstemcells.cellstemcell.2010；7(2):225-39；murakamim,menesespi,knightjs,lank,kaulr,vermasc,robertsones.nm23-hlmodulatestheactivityoftheguanineexchangefactordbl-1.intjcancer.2008；123:500-10；miyamotom,iwashitas,yamaguchis,onoy.roleofnm23intheregulationofcellshapeandmigrationviarhofamilygtpasesignals.molcellbiochem.2009；329:175-9)。因此，通过nme1和nme2六聚体调节的rac和cdc42的抑制降低细胞迁移并限制干细胞附着和存活。我们已经在培养在nme7培养基中的胚胎干细胞中和诱导性多能干细胞中抑制了nme1和nme2并且注意到没有不良作用。在培养在包含nme6或nme7的培养基中的干细胞和祖细胞中抑制nme1和nme2是用于提高干细胞和祖细胞存活以及与用于离体培养的表面的附着的优选的方法。在优选的实施方式中，胚胎干细胞或ips细胞被培养在包含nme7和sirna的培养基中以抑制nme1和nme2。在优选的实施方式中，抑制nme1和nme2的核苷酸是用胆固醇部分衍生的sirna分子以使得能够进入细胞(darmicon)。在更优选的实施方式中，干细胞不与rho激酶(rock1)抑制剂如y27632接触。

可替换地，培养在包含nme1、nme6或nme7的培养基中的干细胞是悬浮生长的。用于细胞悬浮生长的许多技术是本领域技术人员熟知的。波形袋(wavebag)、滚筒瓶(rollerbottle)等可以与包含nme的培养基联合使用用于干细胞生长或用于在更成熟的细胞如体细胞、成真皮细胞或成纤维细胞中诱导多能性。在优选的实施方式中，nme蛋白是二聚体形式的nme1。在更优选的实施方式中，nme蛋白是nme7。

并不意在由nme1、nme6或nme7加入于其中的培养基的性质限制本发明。nme家族蛋白可以被添加至适合于干细胞或祖细胞生长的任何培养基，或适合于诱导多能性的任何培养基。优选基础培养基如dmem、dmem/f12或进一步包含knockout血清替代品或类似物以及非必需氨基酸的类似的培养基。在优选的实施方式中，基础培养基包含60-80％dmem样基础以及20-40％knockout血清替代品或类似物，加上浓缩的非必需氨基酸。在其它情况下，基础培养基包含dmem样基础加上胰岛素、硒以及转铁蛋白。在其中生成的细胞被指定用于人类的情况下，蛋白质组分的优选的物种是人类。

muc1*生长因子受体(特别是nme家族蛋白)的配体促进干细胞和祖细胞的生长，并且维持干细胞和祖细胞的多能性。培养基中的muc1*配体也支持制备诱导的多能性干细胞(ips)的方法并且支持诱导细胞回复到较不成熟状态的方法。此外，在没有其他因子如转染或转导多能性基因(包括oct4、sox2、klf4、nanog或c-myc)的情况下，muc1*配体本身诱导细胞回复到较不成熟状态。

发明人先前公开了muc1*受体的配体可以起生长因子的作用。示出使muc1*胞外结构域二聚的配体增加muc1-阳性癌细胞并且也增加表达muc1*的干细胞和祖细胞的生长。本申请公开了nme7也是muc1*生长因子受体的配体。nme7是由干细胞分泌的。在缺少任何其他细胞因子的基础培养基中nme7充分地支持胚胎干细胞或诱导性多能干细胞的生长。nme7以与nmel二聚体非常相似的方式起到促进干细胞的生长和维持干细胞的多能性的作用。表达的或纯化的nmel使得主要群体以二聚体存在，充分地支持胚胎干细胞或诱导性多能干细胞的生长并且确实无需血清或任何其他细胞因子。二聚形式的nmel和nme7在处于与原始态干细胞或基态干细胞相比更加成熟的状态下的细胞中也诱导多能性。然而，在包含fgf的培养基中生长人类干细胞生产在“致敏”状态下的干细胞，在nmel二聚体或nme7中生长人类干细胞诱导那些细胞回复到较早的状态(称为“原始”状态或“基态”)。近来的研究提供证明，在致敏状态下的干细胞不能发育成人体内的所有细胞类型，但是原始干细胞却可以。因此，培养在nmel或nme7中的干细胞(其处于更加原始状态)对于在人类治疗中使用是理想地适合的，因为该原始状态是人类干细胞的自然状态并且那些原始干细胞能够发育成人体内的任何细胞。在优选的实施方式中，培养在nmel或nme7中的干细胞被用于任何以及全部人类干细胞疗法。

本申请公开了nm23作为确定的无异种蛋白成分(xeno-free)培养基的组分支持干细胞生长，包括胚胎干细胞以及诱导性多能性干细胞两者，并且可以进一步用作在其中重编程(reprogram)体细胞、祖细胞或稍微成熟的细胞使得它们成为多能干细胞(它们也被称为ips细胞)的培养基。

将nm23加入基础培养基dmem/f12(或类似的)加上胰岛素(优选人类的)、硒、转铁蛋白、1-抗坏血酸，其中使用nahcc调节ph值>3充分地支持es细胞和ips细胞生长(当细胞附着于玻连蛋白涂覆的表面或抗mucl*涂覆的表面时)。使用rho激酶抑制剂ha100或y27632持续至少第一个24小时极大地提高了干细胞表面附着。特别优选的是可以以二聚体表达和/或分离的nm23和nm23变异体。其他生长因子如fgf-2或tgf-β可以可选地添加至在该培养基中的nm23。此外，细胞可以在用于改良性能的含氧量低的条件下生长。

将nm23加入基础培养基dmem/f12(或类似的)加上胰岛素(优选人类的)、硒、转铁蛋白、1-抗坏血酸，其中使用nahcc调节ph值>3充分地支持es细胞和ips细胞生长(当细胞附着于玻连蛋白涂覆的表面、抗mucl*涂覆的表面、基质胶和其他干细胞附着的表面时)。使用rho激酶抑制剂ha100或y27632持续至少第一个24小时极大地提高了干细胞表面附着。加入任何rho激酶抑制剂(rocki)改变细胞形状和附着性能并且可以在包含nm23的培养基中使用以提高干细胞、祖细胞和其他非贴壁细胞与表面的附着。在rho激酶抑制剂的存在下，细胞在24至48小时内从具有弱的表面附着的圆形形状转变至具有许多表面附着的更加扁平的形状。尽管已经先前描述了使用rho激酶抑制剂用于干细胞以提高存活，rho激酶抑制剂并不增加在基于nme的培养基中的存活。对于那个原因，其仅用于产生变平细胞并且形成与表面的更高的附着。

已经先前描述了与基于bfgf的培养基一起使用rho激酶抑制剂也增加存活。本文中，我们描述了当在培养基中使用nmel、nme6或nme7时，使用rho激酶抑制剂以辅助与表面的附着。特别优选的是可以以二聚体表达和/或分离的nm23和nm23变异体以及nme，其是具有两个ndpk结构域的单体。尽管这些ndpk结构域迄今仅已知具有酶活性，发明人已经发现部分ndpk结构域包含与muc1*胞外结构域结合的基序。

图14示出，在拉下实验中，来自人类干细胞的nme7结合至具有psmgfr肽的序列的合成肽。发明人已经示出：1)仅nmel二聚体(非六聚体)支持多能干细胞生长；2)在纳米粒子试验中，nmel二聚体(非六聚体)结合至两个或更多个muc1*胞外结构域肽；和3)muc1*的多能性活性和生长因子受体活性发生在配体诱导的其胞外结构域的二聚化之后；二价的抗muc1*抗体产生了生长作为抗体浓度的函数的钟形曲线，其示出是胞外结构域的二聚化引起了生长因子受体功能。

我们也已经示出nme7与nmel二聚体在它们支持多能干细胞生长和抑制分化的能力方面行使类似功能。nme7通过ndpk结构域结合至muc1*受体的胞外结构域以促进多能性的、原始干细胞生长并抑制分化。特别地，nme7结合至psmgfr肽，其是muc1*胞外结构域的一部分。

nm23-h1，其也被称为nmel，仅当以二聚体形式时是活性的干细胞或祖细胞生长因子。随浓度以及其序列而变，nmel可以以二聚体、四聚物或六聚体存在。具有或不具有c-末端缺失的突变如s120g或p96s偏好二聚体形成并稍微抵抗六聚体形成因此优选作为干细胞或祖细胞生长因子。与nmel二聚体相似，nme6作为二聚体存在并也是优选用作生长因子，用于维持并诱导多能性并用于抑制分化。nme7是单体但是可以通过它的两个ndpk结构域像二聚体那样结合。在拉下实验中，nme7结合至muc1*胞外结构域肽，表明至少一个ndpk结构域的部分结合至muc1*受体，并且与nmel二聚体相似，获得维持或诱导多能性同时抑制分化。在夹心分析法中，示出nme7同时结合至两个mucl*胞外结构域肽(psmgfr)，表明nme7-ab蛋白可以使细胞表面上的mucl*二聚。nmel也结合至细胞上的mucl*胞外结构域肽和mucl*受体。nmel六聚体不结合至mucl*受体并且不维持或诱导多能性。可以在适合于培养干细胞或祖细胞的许多不同的基础培养基中使用用于生长、维持、诱导多能性并且抑制分化的nmel二聚体、nme6二聚体或nme7。相容的基础培养基的组分可以变化。在一些情况下，其他生长因子或细胞因子可以与nme蛋白一起加入到培养基内。其他生长因子如fgf-2或tgf-β可以可选地添加至在该培养基中的nm23。在大多数优选的实施方式中，nmel二聚体、nme6二聚体或nme7被添加到确实不包含其他生长因子或细胞因子的基础培养基中。细胞可以在用于改良性能的含氧量低的条件下生长。

可以实践本发明的方法以提供与生长因子一起的细胞以刺激特定的细胞群体的增殖，该细胞的群体可以携带遗传突变或校正(correction)。在一个实施方式中，nme家族蛋白编码在核酸序列中，核酸序列可以包含在被引入细胞的质粒内。编码nme家族蛋白的核酸序列可以是质粒或还携带期望其表达的基因的序列的表达载体的一部分。基因可以是校正的基因或待表达的基因。本发明还设想将编码nme家族成员的核苷酸进入干细胞内使得该细胞组成型表达其拥有的生长因子，使培养简单化，因为其将仅需要用于生长的最小量溶液。在优选的实施方式中，核苷酸是表达质粒，其可以具有可诱导的或可控制的启动子。在优选的实施方式中，nme家族成员是nmel、nme6或nme7。在更优选的实施方式中，nme家族成员是nme7。在最优选的实施方式中，nme家族成员是nme7-ab。本发明还包括这些方法在患者中、在指定用于移植至患者的细胞中、在胚囊和胚胎中以及在受精或未受精的卵(其可以用于体外受精)中的应用。

本发明另外设想了用于所述新的干细胞系产生的基于nme的培养基的应用，该干细胞系可以是胚胎来源的或由更成熟的细胞诱导而来。在优选的实施方式中，所述基于nme的培养基是包含重组nme7的最小培养基。但更优选的培养基包含nme7-ab。

建立的新干细胞系如下：人细胞收获自囊胚内细胞团或使用整个囊胚细胞。所述囊胚细胞在包含nme7的培养基中维持和培养。在优选的实施方式中，所述培养基不含有其他生长因子或细胞因子。所述收获的细胞可置于(接种、涂布，plate)一层饲养细胞或抗体层之上，该饲养细胞可以是成纤维细胞或muc1-阳性肿瘤细胞。在优选的实施方式中，所述抗体是抗muc1*抗体。也更优选的是结合至所述n-10psmgfr肽的抗体。可替换的是所述细胞可以在包含nme7的培养基中悬浮培养或维持。随后可使用本领域内技术人员已知的多种技术来分离干细胞样细胞，随后其可克隆以获得具有期望的核型(染色体组型)的克隆，以及所述期望的基因表达谱。在优选的实施方式中，分离并增殖克隆，该克隆具有能反映原始态而不是致敏态(始发态)的基因表达并且如果所述细胞是雌性，其进一步未经x-失活。在典型的干细胞衍生方法中，所述囊胚或来自囊胚的细胞置于表面之上并且培养一段时间直至可以观察到胚细胞长大呈现干细胞样。收获并使这些细胞生长，和分离并维持具有所述期望的特征的克隆。采用标准的克隆技术来分离克隆，该克隆对多能性标记和原始标记是阳性的，对于致敏态标记如foxa2、otx、lhx或有时xist具有较低表达或没有表达，或在细胞核中缺少浓缩组蛋白-3。克隆在包含nme7的最小培养基中维持并增殖和可选择地通过在抗-muc1*抗体的层上生长所述细胞来保持在所述原始态。在可替换的方法中，细胞悬浮培养。rho激酶抑制剂可以加入所述包含nme7的培养基。在优选的实施方式中，所述培养基不含有fgf。

已经证实，在小鼠和人类中，通过转录因子的异位表达可以重新编码该体细胞以成为多能的(lowryetal.,2008；maheralietal.,2007；nakagawaetal.,2008；okitaetal.,2007；parktaal.,2008；takahashiteal.,2006；takahashiandyamanaka,2006；wernigetal.,2007；yuetal.,2006)。所述诱导多能干细胞(ips)的产生对于真正的个性化再生药物的实现持有很多希望(ymanaka,2007；jaenishandyoung,2008)，因为来源于患者自身的皮肤细胞的干细胞可用于产生细胞和组织来修复由于疾病或衰老导致的损伤。所述转录因子oct、sox2、klf4、和c-myc或oct4、sox2、nanog和lin28的组合的强势表达已表明可致使成熟的细胞回复至多能状态。然而，这些方法在所述过程中使用基于fgf的培养基，其可能减缓或中断诱导多能干细胞(ips)的产生过程。

在所述已知技术上的改进是产生ips细胞系如下：来自供体或患者的体细胞、成真皮细胞(皮肤胚细胞，dermablast)或成纤维细胞在含有nme家族蛋白的培养基中培养。在优选实施方式中，所述nme家族蛋白是nme1二聚体，nme6或nme7。在更优选的实施方式中，所述nme家族成员是nme7，其中nme7-ab是特别优选的。所述细胞可使用致使细胞中多能基因或蛋白质水平升高的核酸、小分子、或蛋白质处理，其中所述多能基因或基因产物可选自oct4、nanog、klf4、c-myc、lin28、和nme7。在优选的实施方式中，所述起始细胞使用oct4、sox2、klf4转染。作为体细胞、成真皮细胞、成纤维细胞或其他细胞的所述起始细胞最初置于含有约2-50nm的nme7的基本培养中的塑料多孔板上，更优选的是8-16nm。典型的是每24-72小时更换培养基。当细胞开始失去至所述塑料板的粘附时，它们可以转移至将粘附的表面，如失活的成纤维细胞、失活的癌细胞表面或使用抗体包被的表面至干细胞表面蛋白，其中优选的是抗-muc1*抗体。除所述nme家族成员外，rho激酶抑制剂可以加入至所述培养基。大约2-3周后，将出现干细胞样细胞并可以分离和克隆该细胞。挑选并增殖具有期望的基因型和基因表达谱的克隆作为稳定的自我更新细胞系。在优选的实施方式中，挑选原始态的克隆。对于产生新干细胞系的这类方法，优选的是人细胞。

这并不意味这通过所述干细胞或祖细胞类型而限制本发明，本发明的方法对所述干细胞或祖细胞类型是有用的。基本上表达所述裂解的muc1，即muc1*的任意干细胞或祖细胞可以连同本发明的方法和培养基使用。

由于多种原因，包括fda认证，总体限定和无异种成分的培养基对用于治疗应用的人体干细胞的生长是可取的。本发明实施例和附图证实nme1二聚体和nme7充分支持多能原始态干细胞生长和抑制分化并且这类功能独立于基础培养基成分。事实上任何适合干细胞生长的基础培养基是满足的。优选的不包含其他生长因子或细胞因子的基础培养基。

研究者最近报道了称为e8的基础培养基(basemedia)，其包含dmem/f12、胰岛素、硒、转铁蛋白、1-抗坏血酸、和用于ph调节的nahco3，以及bfgf和tgf-β作为生长因子，该培养基是用于人体干细胞生长的限定的并且无异种成分的培养基(cheng，gulbransond，houzetal,“用于人体ipsc诱导和培养的化学限定的环境”naturemethods,vol.8no.5,2011pgs424-431)。该基础培养基，我们称为“mn6”，不含有bfgf和tgf-β，但具有nme1或nme6双聚体或nme7，表明充分支持人和鼠多能干细胞生长，抑制分化，也还支持在ips产生过程中多能的诱导。nme1或nme6二聚体、或在mn2培养基中的nme7某种程度上支持多能干细胞生长，该mn2培养基是基础培养基并且仅含非必须氨基酸(见实施例1)。这些发现强调所述事实即nme1二聚体和nme7是人体干细胞的天然的生长因子并且可以用于适于干细胞或祖细胞生长的多种培养基中。和e8培养基类似，适于和nme1二聚体和nme7使用的培养基由诸如dmem/f12或dme/f12/glutamaxi的基础培养基、l-抗坏血酸、硒酸钠、胰岛素、转铁蛋白、以及诸如碳酸氢钠的调节ph的试剂组成。在本发明的另一个方面，加入nme1二聚体或nme7的所述基础培养基由dme/f12/glutamaxi、血清替代品如knockout血清替代品(lifetechnologies/invitrogen)，氨基酸、诸如非必需氨基酸溶液(lifetechnologies/invitrogen)、和可选择的β-巯基乙醇组成。可预见包含这些基础培养基的每种成分的培养基。事实上，任何适于干细胞或祖细胞生长的基础培养基可以和nme1二聚体以及nme7使用以用于干细胞或祖细胞的生长、抑制分化甚至达到致敏态，并且在更成熟的细胞中诱导多能性，该细胞可以是体细胞、成真皮细胞、成纤维细胞或祖细胞。

当与nme1二聚体或nme7混合时，多种培养基支持干细胞生长并且抑制分化。所述nme1二聚体、nme6二聚体或nme7的浓度可以变化。在一个方面，所述nme的浓度在1nm和100nm之间(基于所述单体的分子量)。在优选实施方式中，nme1二聚体、nme6二聚体、或nme7的所述浓度从2nm到64nm。仍在更优选的实施方式中，nme1二聚体、nme6二聚体、或nme7的所述浓度从4nm到32nm。

一种称为最小培养基“mm”的培养基当与nme1二聚体或nme7混合(以8nm-16nm)时，充分支持人体干细胞生长和鼠干细胞生长并且使得人致敏态干细胞回复至所述原始态，该培养基由以下组成：

400mldme/f12/glutamaxi(invitorgen#10565-018)，

100mlknockout血清替代品(ko-sr，invitrogen#10828-028)

5ml100xmem非必须氨基酸溶液(invitrogen#11140-050)和

0.9ml(0.1mm)β-巯基乙醇(55mm储存液，invitrogen#21985-023).

当nme1二聚体或nme7以8nm-16nm加入时，另一种培养基同样起作用，该培养基是“mn6”，由以下组成：

dmem/f12

l-抗坏血酸64mg/l，

硒酸钠14μg/l，

胰岛素19.4mg/l，

碳酸氢钠543mg/l，和

转铁蛋白10.7mg/l

使用nme1二聚体检测或以8nm-16nm加入nme7的另一种培养基是“mn2”，由以下组成：

400mldme/f12/glutamaxi(invitrogen#10535-018)，和

5ml100xmem非必需氨基酸溶液(invitrogen#11140-050)

在“mm”或“mn6”中的nme1二聚体和nme7与所述包含fgf的培养基“e8”或mtesr相同或更好地支持人体干细胞生长。通过将干细胞置于玻连蛋白层上进行图1-图10中所示的实验，而通过将干细胞置于抗-muc1*抗体层上进行图11和图12的所述实验。nme1二聚体或nme7在在任意基本或确定的培养基中促进多能性并且抑制分化。适于干细胞生长的任意表面或基础培养基与nme1、nme6或nme7中生长是相容的。本发明的方法不是限制于使用胚胎干细胞。nme1二聚体或nme7也充分支持人胚胎干(es)细胞和ips细胞以及鼠胚胎干(es)细胞ips细胞的生长。此外，nme1二聚体或nme7在体细胞中支持所述多能性诱导和事实上增加了所述ips产生的效率。

在该确定的无异种成分培养基中，除使用nm23用于所述生长并维持es和ips细胞外，还用于由祖细胞或成熟的体细胞如成真皮细胞制备ips细胞的所述过程。

细胞培养基

可以使用任意细胞培养物，只要muc1*的配体加入所述培养基或由所述细胞表达。尤其地，优选的最小培养基包括muc1*配体如nm23家族蛋白加入所述培养基或由所述细胞表达。制备最小培养基仅包含dmem/f12，胰岛素(优选人的)，硒、转铁蛋白、l-抗坏血酸和使用nahco3调节ph；我们称该培养基为“mn6”，详细配方见下。制备另一个最小培养基，仅包含400mldme/f12/glutamaxi(invitrogen#10565-018)和5ml100xmem非必需氨基酸溶液(invitrogen#11140-050)；我们称该培养基为mn2，详细配方见下。在另一基础培养基中的nme7、nme6或nme1(nm23-s120g)称为基础干细胞培养基或“mm”，该培养基由mn2培养基以及100mlknockout血清替代品(ko-sr，invitrogen#10828-028)和0.9ml(0.1mm)β-巯基乙醇(55mm储备液，invitrogen#21985-023)组成。这三种基础培养基中，加入8nm-16nmnme7、nme6、或nme1(nm23-s120g)，其中nme1可复性并且纯化使得所述群体基本上都是二聚体。在一些例子中，加入rho激酶抑制剂(roci)如y27632。在这些培养基任意一种中存在的nme1、nme6或nme7促进了多能干细胞的生长并抑制分化。

将之前已报道的mn6和fgf-2以及tgf-β的培养基，“e8”(g.chen，d.r.gulbranson，z。hou等人，naturemethods,8(5),424(2011))，加上/减去y27632，与基于nme的培养基比较。此外，作为另一对照，将fgf-2(也称为bfgf)加上50％mef调节培养基作为所述培养基。

本发明并不由本文所述的具体的实施方式限定其范围。实际上，从之前所述以及附图中，本发明除了本文描述的那些之外的各种修改，对于本领域技术人员将变得显而易见。这类修改旨在落入所附权利要求的范围之内。以说明本发明而不是限制的方式提供下列实施例。

实施例

实施例1-培养基

实施例1.1-最小干细胞培养基成分(“mm”)(500ml)

400mldme/f12/glutamax1(invitrogen#10565-018)

100mlknockout血清替代品(ko-sr，invitrogen#10828-028)

5ml100xmem非必需氨基酸溶液(invitrogen#11140-050)

0.9ml(o.lmm)β-巯基乙醇(55mm储备液，invitrogen#21985-023)

实施例1.2-e8培养基成分

dmem/f12

l-抗坏血酸64mg/l

硒酸钠14ug/l

胰岛素19.4mg/l

碳酸氢钠543mg/l

转铁蛋白10.7mg/l

tgfβ12ug/l

fgf2100ug/l

实施例1.3-mn7的组分是e8培养基减去bfgf

实施例1.4-mn6培养基的组分

dmem/f12

l-抗坏血酸64mg/l

硒酸钠14ug/l

胰岛素19.4mg/l

碳酸氢钠543mg/l

转铁蛋白10.7mg/l

实施例1.5-mn2培养基的组分

400mldme/f12/glutamaxi(invitrogen#10565-018)

5ml100xmem非必需氨基酸溶液(invitrogen#11140-050)

实施例1-3和图1-图14来自70124

实施例1.6

人胚胎干细胞(h9s)接种至玻连蛋白层或6孔细胞培养板上的抗muc1*抗体(mn-c3)的层之上。对于每种条件，rho激酶抑制剂，y27632，可以存在或不存在。该rho激酶抑制剂(rhokinaseinhibitor)在至少最初24小时的存在下可以改善细胞的附着和性能，但对于未分化的干细胞生长不是绝对必不可少的。

该结果是在6-组分确定的无异种培养基中以二聚体形式的nm23与对照一样并且相同甚至优于fgf-2和tgf-β的组合完全支持多能干细胞生长。图1-图10是干细胞接种培养四天后的照片图像。

图11和图12示出了人es细胞(h9s)接种至抗muc1*抗体(mn-c3)的层。根据标准操作说明在4ng/mlbfgf小鼠饲养细胞(mef)上已培养该源细胞以用于55次传代。图11显示了第一次传代(p1)至抗muc1*抗体表面的接种4天的干细胞(d4)，其中，在最小干细胞培养基中8nm的nm23二聚体下培养a、c，在mn6完全确定的(defined)无异种培养基中8nm的nm23二聚体下培养“mm”和b、d。可以看出，基于不同基础培养基得到的干细胞的融合(汇合)或全能性之间没有什么区别。图12示出在接种2天后(d2)二次传代(p2)的所述相同的源干细胞，其中，a，c在mtesr培养基中培养，和b、d在mn6培养基加8nmnm23二聚体中培养。可以看出，在基于不同的基础培养基得到的干细胞的融合和多能性方面，mn6培养基中的nm23作用等同或优于mtesr。对于每次传代，仅在首个48小时后，所有培养基补充有rho激酶抑制剂即10um的y27632。图13比较了对于在不同培养基中培养的抗muc1抗体*表面或玻连蛋白上的相同的细胞的生长率。

除了nm23-s120g作为二聚体复性和纯化，单链nm23结构(包括由g4s12次重复的柔性接头nm23-gs2连接的两个nm23单体亚基)和单链nm23结构(包括由较长的接头-nm23-x42连接的两个nm23单体)经测试和运行与天然二聚的nm23-s120g一样。

实施例2-使用缺少fgf的基于nme的培养基诱导多能性

常规使用的标准方案是首次接种成真皮细胞或成纤维细胞(人包皮新生成纤维细胞，"hffn":#pc501a-hff，systembiosciences，mountainview，ca)至塑料板上和将其在成纤维细胞培养基中培养(fm)，每24小时更换培养液。5天后，将细胞转移到用灭活的成纤维细胞饲养细胞包被的表面，该细胞可以是鼠(mef)或人(hs27)细胞。在随后的2天，细胞维持在fm中培养。在第7天将培养基更换为基于bfgf的培养基，并且每24小时更换培养基。最初接种的约2-4周后，挑选具有胚胎干(es)细胞样形态的集落(克隆)并单独接种于包被有失活的饲养细胞(mef或hs27)的新孔中，并每3-4天依次传代。孔继续生长为es样细胞，增殖并用于检验多能性标记的存在。

与常规使用的标准方法相反，我们在nme培养基中培养体细胞(nme1二聚体：“nm23-mm-a”)。此外，我们或者将细胞接种至成纤维饲养细胞层或抗muc1抗体的层上(识别所述n-10psmgfr肽的c3或c8。进行rt-pcr测量以量化由第4天(图31的a)或20天(图31的b)各种条件下的oct4的表达量。到第4天，所述导致多能性诱导的唯一条件是正如由oct4的表达水平测定的，是用于oct4，sox2和klf4(“osk”)(无c-myc)转染的成纤维细胞，并在最小培养基(“mm”)的nme1二聚体中培养。对于这些细胞的oct4是比起始细胞高119倍并且比在成纤维细胞培养基中培养的相同的细胞高近200倍。到20天，仅使用三个基因osk转染细胞，并在nm23-mm-a中培养，该细胞表达的oct4高于对照109倍。使用oskm转染并在nm23-mm中培养的细胞总是表达oct4，并且比在成纤维细胞培养基(fm)中然后转移至bfgf培养基(标准)中的相同细胞，该表达量为3倍之高，而在fm中培养然后转换至nm23-mm的细胞具有的表达量仅高于首先在fm随后在bfgf-m(图31的c)中培养的细胞的表达量的1.3倍。在20天时，对多能性标记tra1-60的细胞免疫化学染色显示了使用基于nme的培养基在细胞中诱导多能性的主要优点。相比于四个多能性基因oct4，sox2，klf4和cmyc转染并根据标准说明在fgf-培养基中培养的细胞(图31的d，e)，该oct4，sox2和klf4转染并在最小培养基的nme1二聚体中培养的细胞，在没有添加fgf情况下，具有在多能性诱导的效率上巨大的提升(图31的f，g)。使用三个多能性基因oct4，sox2和klf4转染的细胞没有检测到多能性标记，并且缺乏干细胞样形态。

实施例3

在此系列实验中，我们检测了在干细胞和癌细胞中nme6和nme7的表达。此外，我们鉴定muc1*作为nme7靶标。我们首先对细胞裂解物蛋白印迹测定法(westernblotassays)来确定nme1和nme7的存在或缺失。在图14的a中，将从包被有抗muc1抗体的表面的nme1二聚体上培养的bgo1v人胚胎干细胞裂解物(泳道1)或在mef的bfgf中培养的bgo1v人胚胎干细胞裂解物(泳道2)或t47d人乳腺癌细胞裂解物(泳道3)或nme1-野生型(wt)作为阳性对照，通过sds-page分离，然后用抗nme1特异性抗体探测(probe)。结果表明，无论是在nme1二聚体或是bfgf，以及t47d癌细胞中，nme1在人es细胞中均强烈表达。在图14的b中，所述相同的细胞裂解物通过sds-page分离，然后用抗nme7特异性抗体探测。结果表明，nme7在抗-muc1*抗体表面的nme1二聚体中培养的人类胚胎干细胞内强烈表达，在mef上的bfgf中培养的所述相同es细胞中微弱表达(泳道2)，并在乳腺癌细胞中强烈表达(泳道3)。加入nme1的泳道4是空白的，这表明所述nme7抗体与nme1没有交叉反应。该nme7在nme1二聚体中培养的干细胞中有更大的表达量的事实表明，相比于其在致敏态细胞中的表达量，nme7在原始态细胞中具有更高水平的表达，我们已经表明表达标记意味着相比于在bfgf中培养的细胞，它们处于更原始的状态。

为测定nme7是否作为生长因子的同时将muc1*作为其靶受体起作用，我们进行了拉下实验。在这些实验中，合成的muc1*胞外结构域肽(his-标记的psmgfr序列)固定在nta-ni磁珠上。这些磁珠和所述bgo1v人胚胎干细胞裂解物孵育，该细胞在包被muc1*抗体的表面上的nme1二聚体(泳道1)中培养，或在mef上的bfgf中培养(泳道2)或t47d人乳癌细胞裂解物(泳道3)中培养。磁珠都漂洗并且捕获的蛋白由于咪唑的加入而释放。通过sds-page分离蛋白并且随后使用抗-nme1抗体(图14的c)或nme7抗体(图14的d)探测。所述结果表明nme7结合至所述muc1*胞外结构域肽。这意味着在干细胞和癌细胞中，nme7通过它的两个ndpk结构域的其部分，经二聚化所述muc1*胞外结构域而激活多能性通路。

实施例4-蛋白结构(构建体，construct)的产生

实施例4.1-nm23-wt

使用所述下列引物经聚合酶链式反应(pcr)扩增nm23wt：

正向：5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt-3(seqidno:86)

反向：5'-gtggtgctcgagttcatagatccagttctga-3'(seqidno:87)

随后所述片段纯化，酶解(ndei，xhoi)并在所述表达载体pet21b的ndei和xhoi的酶切位点之间克隆。

实施例4.2-nm23-s120g

按照制造商说明，利用下列引物：5'-gcaggaacattatacatggcggtgattctg-3'(seqidno:88)和5'-ccatgtataatgttcctgccaacttgtat-3'(seqidno:89)，使用genetailor^tm定点诱变系统(lifetechonogies)获得nm23-h1突变s120g(丝氨酸#120突变为甘氨酸)。图16表明比较所述野生型蛋白和未复性的s120突变体以及所述复性的s120g的多聚化状态的fplc迹线的重叠(overlay)。图17-图19表明只有所述二聚化的形式的蛋白结合至muc1*(非六聚物)并且只有所述二聚体能够支持多能干细胞的生长。图21表明非还原sds-page的特性以及对于所述表达的和复性的蛋白质的相应的fplc迹线以及表明所述nm23-s120g支持多能干细胞生长的能力的人干细胞的图片。

实施例4.3-nm23p96s和删除结构

使用所述quickchange定点突变试剂盒(agilent)按照所述制造商说明利用所述下列引物：5'-tcggggagaccaactctgcagactccaag-3'(seqidno:90)和5'-cttggagtctgcagagttggtctccccga-3'(seqidno:91)，我们产生了所述nm23-h1突变p96s(脯氨酸#96突变为丝氨酸)。用于pcr反应的所述模板是在ndei和xhoi限制位点之间克隆的野生型nm23。在确认序列后，通过pcr产生所述删除结构。使用所述下列引物：5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'(seqidno:92)和5'-gtggtgaccggtatagatccagttctgagcaca-3'(seqidno:93)来扩增nm23p96sδc1。使用所述下列引物：5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'(seqidno:94)和5'-gtggtgaccggtgatccagttctgagcacagct-3，(seqidno:95)来扩增nm23p96sδc2。使用所述下列引物：5'-atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc-3'(序列no:96)和5'-gtggtgaccggtagcacagctcgtgtaatctacca-3'(seqidno:97)来扩增nm23p96sδc6。纯化、酶切(ndei、agei)所述得到的片段并且在所述表达载体pet21b的ndei、agei限制位点之间克隆。最初利用重叠pcr(overlappcr)方法通过用agei置换所述xhoi酶切位点改良所述pet21b。当nm23-p96s克隆至ndei、agei之间时，可观察到最佳的二聚体形成。当克隆至ndei、agei之间时，对于所有删除突变，可观察到最佳的二聚体形成。图20表明它们支持多能干细胞生长的能力。

实施例5-突变和变异nme1种的表达和复性

实施例5.1-蛋白表达和可选的复性/纯化

接种1/10的过夜培养物至lb肉汤培养基(luria-bertani肉汤)并在37℃培养直到od600达到～0.5。在该点，重组蛋白表达使用0.4mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg,goldbiotechonlogy)孵育并且在5小时后停止培养。通过离心(6000rpm,4℃,10min)收获细胞后，使用运行缓冲液重悬细胞沉淀：pbspbsph7.4，360mmnacl和80mm咪唑。随后加入溶菌酶(lmg/ml，sigma)，mgcl2(0.5mm)和dnase(0.5ug/ml,sigma)。细胞重悬液接种在37℃的转台(旋转平台)上30min，并且冰上超声处理5min。不溶的细胞碎片通过离心移除(20000rpm30min4℃)。澄清的裂解物施加至ninta柱(qiagen)，使用运行缓冲液平衡。所述柱在使用补充有420mm咪唑的所述运行缓冲液(6cv)洗脱柱上的蛋白质前，洗柱(8cv)。

实施例5.2-用于随后复性的可选蛋白变性

对于蛋白变性，汇集所述洗脱级分(流分，fraction)并通过加入1体积的100mmtrisph8.0和8m尿素变性。所述溶液通过加入另1.5体积的100mmtrisph8.0和8m尿素浓缩。重复该循环直到最终的尿素浓度达到约7m。随后所述蛋白质通过透析复性。

实施例6-跨种功能(crossspeciesfunction)

nm23支持具有多能集落形态的小鼠es细胞的增殖

小鼠es细胞(129/s6，emdmilliporebillerica，ma)在小鼠es细胞最小培养基(mesc-mm)中失活的mef饲养细胞层上培养两天，该培养基补充有1000u/ml重组mlif(a，c)(emdmillipore)或者16nmnm23-s120g-rs(bd)，并在相衬照明下低倍率照相。图标尺寸(sizebar)表示500微米。在两种情况下，在第一天的一些细胞组成的单个细胞和集落产生了较大的多细胞椭圆形集落，其具有亮的限定边界，这对于多能性小鼠es细胞来说是典型的。mesc-mm由knockoutd-mem基础培养基，15％knockout血清替代品，1xglutamaxi，1xoptimem非必需氨基酸，0.1mmb-me(lifetechnologies，carlsbad，ca)，和1x青霉素/链霉素(lonza，allendale，nj)组成。

图22所示结果证明了小鼠干细胞在nm23(人)中生长同样较好，正如它们在具有小鼠lif作为生长因子的小鼠干细胞培养基中时一样。因此，本文中描述的nm23变异体可以在小鼠细胞系统中使用，而小鼠nm23和小鼠nm23变异体可以在人细胞系统中使用。

实施例7

为确定人干细胞除了nme1(h1)和nme2(h2)是否表达nme6或nme7，我们对来自各种人干细胞系中的裂解物和上清液进行蛋白印迹分析。人胚胎干细胞系bgo1v细胞或者在a)仅在包被抗-muc1*单克隆抗体mn-c3的细胞培养板上的二聚形式的nm23-s120g或b)在小鼠饲养细胞上的(mef)4ng/ml的bfgf中培养。培养3天后，收获所述干细胞并裂解，随后通过使用抗体经蛋白免疫印迹分析以探测所述nme1、nme6和nme7的存在。为比较，对t47dmuc1*阳性乳腺癌平行地进行同样的分析。作为对照，重组nm23-h1野生型(nm23-wt)蛋白上样至凝胶并且使用抗体进行探测，该抗体可识别所述3种不同的nme。注意所述凝胶是变性凝胶，使得所述nm23-s120g二聚体和所述野生型六聚体的表观分子量将表现为单体的重量。用于探测所述凝胶的抗体是：对于nme1:nm23-h1(c-20)；对于nme6:nm23-h6(l-17)以及对于nme7:nm23-h7(b9)(均购自santacruzbiotechnology，inc)：

图23示出6个蛋白印迹凝胶的图片。部分i.a-c示出所述蛋白印迹，其中所述细胞裂解物由凝胶电泳分离并且随后使用抗体检测：a)nme1，b)nme6和c)nme7。在每个部分中，泳道1对应在包被有抗-muc1*单克隆抗体mn-c3的细胞培养板上nm23-s120g中(以二聚体形式)培养的bgo1v干细胞；泳道2对应在mef上的bfgf中培养的bgo1v干细胞；泳道3对应t47乳腺癌细胞；泳道4对应纯化的重组nm23-h1野生型(nm23-wt)。

图23的a)示出了nme1存在于bgo1v人类胚胎干细胞，无论细胞在抗muc1*抗体中表面上的二聚体形式nm23中培养(泳道1)，或是在小鼠饲养细胞的表面的bfgf中培养(mef细胞)(泳道2)。nme1也存在于人乳腺癌细胞中(泳道3)。并且所述阳性对照，示出了所述使用的抗体实际上识别了nme1纯化蛋白。

图23的b)示出了使用这些抗体nme6在任意检测样品中不存在。

图23的c)示出了如果它们在抗-muc1*表面的nm23(二聚体)中培养(泳道1)，nme7在人干细胞中强烈表达，但在mef饲养细胞上的bfgf中培养的所述干细胞中微弱表达(泳道2)。nme7也在人乳腺癌细胞中强烈表达(泳道3)，但并不被对于所述h1同种型假设是特异性的c-20抗体识别。

该实验的结论之一是，nme7是在一个更原始的干细胞中表达的nm23的早期形式。我们已经示出了以二聚体形式的nm23诱导干细胞回复到一个更多能的通常被称为原始态(初始态)的状态。我们和他人的实验证明，在bfgf中培养干细胞或在小鼠成纤维细胞饲养层中(mef)培养干细胞可促使或维持干细胞处于称为“致敏”态的较低的多能态。参照图23的c)中，这些致敏态干细胞表达显著更少的nme7，这与nme7和更初始并且因此真正多能干细胞状态相关的观点是一致的。由于所述原始态人干细胞被预测为能更好地分化为功能性的成体细胞，所述原始态的干细胞是期望的细胞以用于研究和治疗用途。因此，涉及nme7的诱导表达的策略是期望的，以获得细胞用于治疗用途。反之，减少癌症中nme7表达的策略会是抗癌疗法。

图23的d)-f)显示拉下实验的蛋白印迹照片以确定哪些nme连接至muc1*胞外结构域肽。本文中，组氨酸标签muc1*胞外结构域肽(gtinvhdvetqfnqykteaasrynltisdvsvsdvpfpfsaqsga-hhhhhh(seqidno：98))被连接到nta-ni琼脂珠，随后与所述相同的细胞裂解物孵育，如图23的部分1。在4℃孵育1小时后，珠体在15000rpm离心5min。弃去上清液，用pbs洗涤珠体以除去通过非特异性结合所结合的物质。加入咪唑将复合体从珠体中释放。离心后，使用抗nme1(d)、nme6(e)和nme7(f)抗体，通过凝胶电泳将上清液分离并分析，如图23部分1中所示。图23的d)示出了干细胞中的nme1，无论是在nm23(二聚体)培养(泳道1)或是在bfgf中(泳道2)，均结合至muc1*胞外结构域肽，如本发明人之前所示。泳道3示出了在乳腺癌细胞裂解物中的nme1也结合至muc1*胞外结构域肽，和泳道4示出了c-20nme1特异性抗体结合至所述纯化的重组野生型nme1。e)该凝胶表明在图23部分i中的nme6中并未显示在这些细胞裂解物中，是未被被muc1*肽拉下的。图23的f)重要地说明nme7结合至muc1*胞外结构域肽。来自nm23中培养的干细胞且位于muc1*抗体表面的nme7表达量高于bfgf中培养的nme上的干细胞。与图23的部分i一致，nme7显示结合至muc1*肽并且通过该相互作用在试验中被拉下(泳道1)。然而，nme7在泳道2中未出现，这可能是由于在bfgf中培养的细胞的表达降低。泳道3显示，在乳腺癌细胞中表达的nme7结合至muc1*并且泳道4无蛋白显示，因为所述nme7抗体不识别所述nme1的同型(isotype)。nme7可能结合至两个muc1*肽以二聚化细胞上的muc1*受体，从而刺激多能性、生长和抑制分化。

实施例8

人干细胞系bgo1v和hes-3细胞的蛋白印迹分析显示据称对于nme7特异性的nme抗体识别nme7(nm23-h7b9来自santacruzbiotechnology，inc)和与nme6具有相同分子量的其他物种(抗-nme6来自abnova)(图24)。

实施例9

产生重组nme7–形成第一结构以制得重组nme7，其可有效地表达且是可溶形式。首要方法是构建可以编码天然nme7(-1)或具有n-末端缺失的可变剪接变异体(alternativesplicevariant)nme7(-2)的结构。在一些情况下，结构携带组氨酸标签或链霉亲和素标签(链霉标签，streptag)以助于纯化。nme7-1在大肠杆菌表达较少(图25的a，图25.1的a，图25.2的a)并且nme7-2在大肠杆菌(图25b，图25.1的b，图25.2的b)根本未表达。然而，构建新的结构，其中所述靶序列被删除，并且nme7基本上包含具有31kda的计算分子量的ndpka和b结构域。这种新的nme7-ab在大肠杆菌表达很好，并作为可溶性蛋白存在(图26的a)。单一的ndpk结构域在其中表达的结构，nme-a，在大肠杆菌不表达(图26的b)。所述nme7-ab首先通过nta-ni柱纯化(图27的a)，然后通过经sephadex200柱的尺寸排阻色谱法(fplc)进一步纯化(图27的b)。所述纯化的nme7-ab蛋白，随后测试其促进多能性并抑制干细胞分化的能力。

实施例10

测试重组的nme7保持多能性和抑制分化的能力。nme7的可溶性变体，nme7-ab如实施例9所述生成和纯化。人类干细胞(ipscat#sc101a-1，systembiosciences)按照制造商指示在用于四次传代小鼠成纤维细胞饲养细胞层上的4ng/ml的bfgf上生长。随后这些源干细胞接种至已包被12.5μg/well的单克隆抗muc1*抗体mn-c3的6孔细胞培养板(vita^tm，thermofisher)中。细胞以30万细胞每孔的密度接种。所述基础培养基是由以下组成的最小干细胞培养基：400mldme/f12/glutamaxi(invitrogen#10565-018)、100mlknockout血清替代品(ko-sr，invitrogen#10828-028)、5ml100x的mem非必需氨基酸溶液(invitrogen#11140-050)和0.9ml(0.1mm)β-巯基乙醇(55mm储备液，invitrogen#21985-023)。所述基础培养基可以是任何培养基。在一个优选的实施方式中，基础培养基不含有其它生长因子和细胞因子。将8nm的nme7-ab或8nm的作为稳定的二聚体复性和纯化的nm23-h1加入至基础培养基。每48小时更换培养基并且在接种3天后，由于加速增长必需收获并传代。图27-图30记录nm23-h1二聚体的增长与nme7单体中的增长的逐天比较。即使100％汇合时，nme7和nm23-h1(nmel)二聚体的多能性均增长并且没有分化。如见于所述照片，nme7细胞生长比nm23-h1二聚体中细胞更快。第一次收获细胞计数证实，相比于在nm23-h1二聚体中培养，在nme7中培养产生1.4倍的细胞。

实施例11

设计和生成下列新的nme6和nme7变异体：

人nm23-h7-2序列优化用于大肠杆菌表达：

(dna)

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(氨基酸)

mhdvknhrtflkrtkydnlhledlfignkvnvfsrqlvlidygdqytarqlgsrkektlalikpdaiskageiieiinkagftitklkmmmlsrkealdfhvdhqsrpffneliqfittgpiiameilrddaicewkrllgpansgvartdasesiralfgtdgirnaahgpdsfasaaremelffpssggcgpantakftnctccivkphavsegllgkilmairdagfeisamqmfnmdrvnveefyevykgvvteyhdmvtemysgpcvameiqqnnatktfrefcgpadpeiarhlrpgtlraifgktkiqnavhctdlpedgllevqyffkildn-(seqidno:21)

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(氨基酸)

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人nme7-a1：

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(氨基酸)

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(氨基酸)

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(氨基酸)

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(氨基酸)

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(氨基酸)

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人nme7-b3：

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(氨基酸)

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人nme7-ab1：

(dna)

atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(seqidno:40)

(氨基酸)

mektlalikpdaiskageiieiinkagftitklkmmmlsrkealdfhvdhqsrpffneliqfittgpiiameilrddaicewkrllgpansgvartdasesiralfgtdgirnaahgpdsfasaaremelffpssggcgpantakftnctccivkphavsegllgkilmairdagfeisamqmfnmdrvnveefyevykgvvteyhdmvtemysgpcvameiqqnnatktfrefcgpadpeiarhlrpgtlraifgktkiqnavhctdlpedgllevqyff-(seqidno:41)

最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-a序列

(dna)

atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga(seqidno:42)

(氨基酸)

mektlalikpdaiskageiieiinkagftitklkmmmlsrkealdfhvdhqsrpffneliqfittgpiiameilrddaicewkrllgpansgvartdasesiralfgtdgirnaahgpdsfasaaremelff-(seqidno:43)

最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-a1序列

(dna)

atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttacctga(seqidno:44)

(氨基酸)

mektlalikpdaiskageiieiinkagftitklkmmmlsrkealdfhvdhqsrpffneliqfittgpiiameilrddaicewkrllgpansgvartdasesiralfgtdgirnaahgpdsfasaaremelffpssggcgpantakft-(seqidno:45)

最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-a2序列

(dna)

atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga(seqidno:46)

(氨基酸)

mnhserfvfiaewydpnasllrryellfypgdgsvemhdvknhrtflkrtkydnlhledlfignkvnvfsrqlvlidygdqytarqlgsrkektlalikpdaiskageiieiinkagftitklkmmmlsrkealdfhvdhqsrpffneliqfittgpiiameilrddaicewkrllgpansgvartdasesiralfgtdgirnaahgpdsfasaaremelff-(seqidno:47)

最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-a3序列

(dna)

atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttacctga(seqidno:48)

(氨基酸)

mnhserfvfiaewydpnasllrryellfypgdgsvemhdvknhrtflkrtkydnlhledlfignkvnvfsrqlvlidygdqytarqlgsrkektlalikpdaiskageiieiinkagftitklkmmmlsrkealdfhvdhqsrpffneliqfittgpiiameilrddaicewkrllgpansgvartdasesiralfgtdgirnaahgpdsfasaaremelffpssggcgpantakft-(seqidno:49)

最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-b序列

(dna)

atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(seqidno:50)

(氨基酸)

mnctccivkphavsegllgkilmairdagfeisamqmfnmdrvnveefyevykgvvteyhdmvtemysgpcvameiqqnnatktfrefcgpadpeiarhlrpgtlraifgktkiqnavhctdlpedgllevqyff-(seqidno:51)

最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-b1序列

(dna)

atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(seqidno:52)

(氨基酸)

mnctccivkphavsegllgkilmairdagfeisamqmfnmdrvnveefyevykgvvteyhdmvtemysgpcvameiqqnnatktfrefcgpadpeiarhlrpgtlraifgktkiqnavhctdlpedgllevqyffkildn-(seqidno:53)

最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-b2序列

(dna)

atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(seqidno:54)

(氨基酸)

mpssggcgpantakftnctccivkphavsegllgkilmairdagfeisamqmfnmdrvnveefyevykgvvteyhdmvtemysgpcvameiqqnnatktfrefcgpadpeiarhlrpgtlraifgktkiqnavhctdlpedgllevqyff-(seqidno:55)

最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-b3序列

(dna)

atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(seqidno:56)

(氨基酸)

mpssggcgpantakftnctccivkphavsegllgkilmairdagfeisamqmfnmdrvnveefyevykgvvteyhdmvtemysgpcvameiqqnnatktfrefcgpadpeiarhlrpgtlraifgktkiqnavhctdlpedgllevqyffkildn-(seqidno:57)

最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-ab序列

(dna)

atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(seqidno:58)

(氨基酸)

mektlalikpdaiskageiieiinkagftitklkmmmlsrkealdfhvdhqsrpffneliqfittgpiiameilrddaicewkrllgpansgvartdasesiralfgtdgirnaahgpdsfasaaremelffpssggcgpantakftnctccivkphavsegllgkilmairdagfeisamqmfnmdrvnveefyevykgvvteyhdmvtemysgpcvameiqqnnatktfrefcgpadpeiarhlrpgtlraifgktkiqnavhctdlpedgllevqyffkildn-(seqidno:59)

最佳用于大肠杆菌表达的人nme7-ab1序列

(dna)

atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(seqidno:60)

(氨基酸)

mektlalikpdaiskageiieiinkagftitklkmmmlsrkealdfhvdhqsrpffneliqfittgpiiameilrddaicewkrllgpansgvartdasesiralfgtdgirnaahgpdsfasaaremelffpssggcgpantakftnctccivkphavsegllgkilmairdagfeisamqmfnmdrvnveefyevykgvvteyhdmvtemysgpcvameiqqnnatktfrefcgpadpeiarhlrpgtlraifgktkiqnavhctdlpedgllevqyff-(seqidno:61)

小鼠nme6

(dna)

atgacctccatcttgcgaagtccccaagctcttcagctcacactagccctgatcaagcctgatgcagttgcccacccactgatcctggaggctgttcatcagcagattctgagcaacaagttcctcattgtacgaacgagggaactgcagtggaagctggaggactgccggaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagcggctggtggagttcatgacaagtgggccaatccgagcctatatccttgcccacaaagatgccatccaactttggaggacactgatgggacccaccagagtatttcgagcacgctatatagccccagattcaattcgtggaagtttgggcctcactgacacccgaaatactacccatggctcagactccgtggtttccgccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaggaaccccagctgcggtgtggtcctgtgcactacagtccagaggaaggtatccactgtgcagctgaaacaggaggccacaaacaacctaacaaaacctag(seqidno:62)

(氨基酸)

mtsilrspqalqltlalikpdavahplileavhqqilsnkflivrtrelqwkledcrrfyrehegrffyqrlvefmtsgpirayilahkdaiqlwrtlmgptrvfraryiapdsirgslgltdtrntthgsdsvvsasreiaaffpdfseqrwyeeeepqlrcgpvhyspeegihcaaetgghkqpnkt-(seqidno:63)

人nme6

(dna)

atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga(seqidno:64)

(氨基酸)

mtqnlgsemasilrspqalqltlalikpdavahplileavhqqilsnkflivrmrellwrkedcqrfyrehegrffyqrlvefmasgpirayilahkdaiqlwrtlmgptrvfrarhvapdsirgsfgltdtrntthgsdsvvsasreiaaffpdfseqrwyeeeepqlrcgpvcyspeggvhyvagtgglgpa-(seqidno:65)

人nme61

(dna)

atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga(seqidno:66)

(氨基酸)

mtqnlgsemasilrspqalqltlalikpdavahplileavhqqilsnkflivrmrellwrkedcqrfyrehegrffyqrlvefmasgpirayilahkdaiqlwrtlmgptrvfrarhvapdsirgsfgltdtrntthgsdsvvsasreiaaffpdfseqrwyeeeepqlrcgpv-(seqidno:67)

人nme62

(dna)

atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga(seqidno:68)

(氨基酸)

mltlalikpdavahplileavhqqilsnkflivrmrellwrkedcqrfyrehegrffyqrlvefmasgpirayilahkdaiqlwrtlmgptrvfrarhvapdsirgsfgltdtrntthgsdsvvsasreiaaffpdfseqrwyeeeepqlrcgpv-(seqidno:69)

人nme63

(dna)

atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga(seqidno:70)

(氨基酸)

mltlalikpdavahplileavhqqilsnkflivrmrellwrkedcqrfyrehegrffyqrlvefmasgpirayilahkdaiqlwrtlmgptrvfrarhvapdsirgsfgltdtrntthgsdsvvsasreiaaffpdfseqrwyeeeepqlrcgpvcyspeggvhyvagtgglgpa-(seqidn0:71)

用于大肠杆菌表达优化的人nme6序列

(dna)

atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga(seqidno:72)

(氨基酸)

mtqnlgsemasilrspqalqltlalikpdavahplileavhqqilsnkflivrmrellwrkedcqrfyrehegrffyqrlvefmasgpirayilahkdaiqlwrtlmgptrvfrarhvapdsirgsfgltdtrntthgsdsvvsasreiaaffpdfseqrwyeeeepqlrcgpvcyspeggvhyvagtgglgpa-(seqidno:73)

用于大肠杆菌表达优化的人nme61序列

(dna)

atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga(seqidno:74)

(氨基酸)

mtqnlgsemasilrspqalqltlalikpdavahplileavhqqilsnkflivrmrellwrkedcqrfyrehegrffyqrlvefmasgpirayilahkdaiqlwrtlmgptrvfrarhvapdsirgsfgltdtrntthgsdsvvsasreiaaffpdfseqrwyeeeepqlrcgpv-(seqidno:75)

用于大肠杆菌表达优化的人nme62序列

(dna)

atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga(seqidno:76)

(氨基酸)

mltlalikpdavahplileavhqqilsnkflivrmrellwrkedcqrfyrehegrffyqrlvefmasgpirayilahkdaiqlwrtlmgptrvfrarhvapdsirgsfgltdtrntthgsdsvvsasreiaaffpdfseqrwyeeeepqlrcgpv-(seqidno:77)

用于大肠杆菌表达优化的人nme63序列

(dna)

atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga(seqidno:78)

(氨基酸)

mltlalikpdavahplileavhqqilsnkflivrmrellwrkedcqrfyrehegrffyqrlvefmasgpirayilahkdaiqlwrtlmgptrvfrarhvapdsirgsfgltdtrntthgsdsvvsasreiaaffpdfseqrwyeeeepqlrcgpvcyspeggvhyvagtgglgpa-(seqidno:79)

nme6和nme7以及新的变异体可以表达有任意亲和标签但是可以表达有下列标签：

组氨酸标签

(ctcgag)caccaccaccaccaccactga(seqidno:84)

链霉亲和素(strept)ii标签

(accggt)tggagccatcctcagttcgaaaagtaatga(seqidno:85)

实施例12-nme6和n1e7结构产生

实施例12.1-人nme7-1序列优化用于大肠杆菌的表达

nme7wt-cdna，密码子优化以用于在大肠杆菌中表达，由genscript(nj)根据我们的请求生成。使用所述下列引物由聚合酶链反应(pcr)扩增nme7-1：

正向5'-atcgatcatatgaatcactccgaacgc-3'(seqidno:98)

反向5'-agagcctcgagattatccagaattttgaaaaagtattg-3'(seqidno:99)

随后将该片段纯化，酶切(ndei，xhoi)并且在表达载体pet21b的ndei和xhoi限制性位点之间克隆。

实施例12.2-人nme7-2序列优化以用于大肠杆菌的表达

使用所述下列引物由聚合酶链反应(pcr)扩增nme7-2：

正向5'-atcgatcatatgcatgacgttaaaaatcac-3'(seqidno:100)

反向5'-agagcctcgagattatccagaattttgaaaaagtattg-3'(seqidno:101)

随后将该片段纯化，酶切(ndei，xhoi)并且在表达载体pet21b的ndei和xhoi限制性位点之间克隆。

实施例12.3-人nme7-a序列优化以用于大肠杆菌的表达

使用所述下列引物由聚合酶链反应(pcr)扩增nme7-a：

正向5'-atcgacatatggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatg-3'(seqidno:102)

反向5'-actgcctcgaggaaaaacagttccatttcacgagctgccgatg-3'(seqidno:103)

随后将该片段纯化，酶切(ndei，xhoi)并且在表达载体pet21b的ndei和xhoi限制性位点之间克隆。

实施例12.4-人nme7-ab序列优化以用于大肠杆菌的表达

使用所述下列引物由聚合酶链反应(pcr)扩增nme7-ab：

正向5'-atcgacatatggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatg-3'(seqidno:104)

反向5'-agagcctcgagattatccagaattttgaaaaagtattg-3'(seqidno:105)

随后将该片段纯化，酶切(ndei，xhoi)并且在表达载体pet21b的ndei和xhoi限制性位点之间克隆。所示蛋白表达有c-termhis标签。

使用所述下列引物由聚合酶链反应(pcr)扩增nme7-ab：

正向5'-atcgacatatggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatg-3'(seqidno:106)

反向5'-agagcaccggtattatccagaattttgaaaaagtattg-3'(seqidno:107)

随后将该片段纯化，酶切(ndei，agei)并且在表达载体pet21b的ndei和agei限制性位点之间克隆，其中xhoi由age1替换，随后由链霉亲和素标签ii和所述his标签之前的两个终止子替换。所述蛋白表达有c-term链霉亲和素标签ii

实施例12.5-人nme6序列优化以用于大肠杆菌的表达

使用所述下列引物由聚合酶链反应(pcr)扩增nme6：

正向5'-atcgacatatgacgcaaaatctgggctcggaaatg-3'(seqidno:108)

反向5'-actgcctcgagtgccggacccagaccacccgtgc-3'(seqidno:109)

随后将该片段纯化，酶切(ndei，xhoi)并且在表达载体pet21b的ndei和xhoi限制性位点之间克隆。所述蛋白表达有c-termhis标签。

使用所述下列引物由聚合酶链反应(pcr)扩增nme6：

正向5'-atcgacatatgacgcaaaatctgggctcggaaatg-3'(seqidno:110)

反向5'-actgcaccggttgccggacccagaccacccgtgcg-3'(seqidno:111)

随后将该片段纯化，酶切(ndei，agei)并且在表达载体pet21b的ndei和agei限制性位点之间克隆，其中xhoi由age1替换，随后由链霉标签ii和所述his标签之前的两个终止子替换。并且所述蛋白表达有c-term链霉亲和素标签ii(c-termstreptagii)。

实施例12.6-产生重组nme7-ab

lb肉汤培养基(lb肉汤培养基)中接种1/10过夜培养物，并在37℃培养直到od600值达到～0.5。在该点，使用0.4mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg，goldbiotechnology)诱导重组蛋白表达并且5h后培养停止。经离心(6000rpm，40℃10min)收集细胞，用运行缓冲液重悬细胞沉淀：pbsph值为7.4，360mmnacl和80mm咪唑。然后加入溶菌酶(1mg/ml，sigma)，mgcl2(0.5mm)和dna酶(0.5ug/mlsigma)。细胞悬浮液在37℃转台(275rpm)上孵育30min，并在冰上超声5min。不溶的细胞碎片通过离心(20000rpm离心30min，40℃)除去。然后将澄清的裂解液施加至用运行缓冲液(runningbuffer)平衡的ni-nta柱(qiagen)。该柱用4cv运行缓冲液清洗，然后用补充有30mm咪唑的4cv的运行缓冲液清洗，再使用补充有70mm咪唑运行缓冲液(6cv)从柱中洗脱蛋白质，随后使用补充有490mm咪唑的运行缓冲液(4cv)进行二次洗脱。nme7-ab通过尺寸排阻色谱法(superdex200)“fplc”进行进一步纯化。

实施例12.7-产生重组nme6

lb肉汤培养基(lb肉汤培养基)中接种1/10过夜培养物，并在37℃培养直到od600值达到～0.5。在该点，使用0.4mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg，goldbiotechnology)诱导重组蛋白表达并且5h后培养停止。经离心(6000rpm，40℃10min)收集细胞，用运行缓冲液(电泳缓冲液，runningbuffer)重悬细胞沉淀：pbsph值为7.4，360mmnacl和80mm咪唑。随后加入溶菌酶(1mg/ml，sigma)，mgcl2(0.5mm)和dna酶(0.5ug/mlsigma)。细胞悬浮液在37℃转台(275rpm)上孵育30min，并在冰上超声5min。不溶的细胞碎片通过离心(20000rpm30min，40℃)除去。然后将澄清的裂解液施加至用运行缓冲液平衡的ni-nta柱(qiagen)。在使用补充有420mm咪唑运行缓冲液(6cv)从柱中洗脱蛋白质之前，清洗该柱(8cv)。nme6通过尺寸排阻色谱法(superdex200)“fplc”进行进一步纯化。

实施例13-相比于基于bfgf的培养基，在基于nme的培养基中培养的干细胞中的原始态和致敏态基因的定量pcr分析。

培养人类esh9细胞(wicell)用于指定数目的传代培养，或者在mef饲养细胞上的4ng/mlbfgf(peprotech)中，或者在基质胶上的mtesr中(stemcelltechnologies)或在最小培养基“mm”中的8nm的nm23(nme1s120g二聚体)中，其中所述细胞接种至包被有12.5ug/mlc3抗muc1*mab的vita^tm板(thermofisher)上，在图13中简称为“nm23/muc1*ab”。使用试剂(invitrogen)分离rna并且cdna用randomhexamers(invitrogren)使用superscriptii(invitrogen)进行逆转录，随后使用应用生物系统的基因表达分析(oct4p/nhs00999634_gh，nanog的p/nhs02387400_gl，klf2p/nhs00360439_gl，klf4的p/nhs00358836_ml，foxa2的p/nhs00232764_ml，otx2p/nhs00222238_ml，lhx2p/nhs00180351_ml，xistp/nhs01079824_ml和gapdhp/n4310884e)测定所述基因：foxa2，xist，klf2，klf4，nanog和oct4，在appliedbiosystems7500实时仪上。a)在mef上的bfgf中，基质胶上的mtesr中，抗muc1*c3抗体上的nm23中培养细胞。每个样片一式3份进行。基因表达标准化(归一化)为gapdh。数据表示为相对于所述的bfgf/mef对照的倍数变化。b)h9细胞在基质胶上的mtesr中培养用于指示数目的传代，并且如上述测定基因表达。数据表示为相对于所述bfgf/mef对照的倍数变化。c)在一层抗muc1*c3单克隆抗体上8nm的nm23(h1s120g二聚体)中培养h9细胞用于指示的传代数并且如上述测定基因表达。数据表示为相对于所述bfgf/mef对照的倍数变化。d)如上所述，除了细胞接种在人玻连蛋白层上外，或者在nm23、bfgf中，或者在mtesr中培养之前已在mef的bfgf中培养的h9细胞用于单次传代。为了进行比较，在抗mucl*抗体上的nm23中培养细胞。如上所述测定基因表达。数据表示为相对于所述的bfgf/mef对照的倍数变化。图a显示了当细胞培养在mucl*抗体层上的nm23中时，大部分的多能性基因(oct4，nanog，klf4和klf2)均高水平表达，相较于或者培养在标准的基于fgf的培养基或在另一基于fgf培养基mtesr中的培养。最引人注目的是，当干细胞被培养在基于fgf的培养基中时(标准或mtesr)，致敏的标记foxa2和xist均显著较高。图b显示了作为传代次数的函数，mtesr中的生长可能趋向于增加已升高的致敏态基因表达水平。图c示出相反情况，作为传代次数的函数，muc1*抗体上的nm23中的生长趋向于减少致敏态(不需要的)基因的表达。图d显示了玻连蛋白表面上的生长负面影响所述基因表达特征，其中高的oct4，nanog，klf4和klf2同时foxa2和xist的低表达是期望的，并认为是原始态的特性。

实施例14-muc1拉下试验表明nme1、nme6和nme7结合至mnc1物种蛋白。

使用对muc1*细胞质尾区(ab-5)抗体的拉下试验在一组细胞上进行。通过sds-page分离，然后使用蛋白质印迹技术利用特异于nme1、nme6和nme7的抗体探测通过muc1抗体拉下(pulldown)的蛋白。muc1*阳性乳腺癌细胞系t47d细胞(atcc)、人胚胎干细胞系bgo1v(lifetechnologies)、人类es细胞(hes-3,biotimeinc.)和人类ips细胞(sc101a-1,systembiosciencesinc.)t47d癌细胞根据atcc方案在rpmi-1640(atcc)加10％fbs(vwr)中生长。所有干细胞在具有8nmnm23-rs(重组nme1s120g二聚体)的最小干细胞培养基“mm”中培养。干细胞在用12.5μg/ml的抗-muc1*c3mab涂覆(包被)的塑料制品上生长。在冰上，将细胞用200μl的ripa缓冲液溶解10min。在通过离心法去除细胞碎片之后，将上清液用于免疫共沉淀试验中。使用识别muc1细胞质尾区并且连接至免疫磁珠蛋白g(dynabeadsproteing)(lifetechnologies)的ab-5抗体(抗-muc-1ab-5，thermoscientific)拉下muc1*。珠用ripa缓冲液洗涤两次并且再悬浮在还原缓冲液中。将上清液样品进行还原sds-page，随后将蛋白转移到pvdf膜。图32示出了膜随后用以下进行探测：a)抗-nm23-h1(nme1)抗体(c-20,santacruzbiotechnology)；b)抗-nme6(abnova)；或c)抗nm23-h7抗体(b-9,santacruzbiotechnology)；d)使用超强信号(supersignal)(pierce)增强nme6的染色；以及e)使用超强信号增强nme7的染色。在用它们各自的连接至hrp的二级抗体温育之后，通过化学发光检测蛋白(参见图32，a-e)。照片示出了天然的nme1、nme6和nme7存在于muc1*阳性乳腺癌细胞、人类es细胞和人类ips细胞中，并且它们结合至muc1*。注意到存在于hes-3颗粒中的细胞数目少于存在于其他样品中的数目。

实施例15-重组nm23(s120g突变体h1二聚体)、nme7-ab、以及天然nme7结合至muc1*胞外结构域肽并且能够诱导受体二聚化。

根据thompsonetal.(acsappl.mater.interfaces,2011,3(8),pp2979-2987)，用nta-sam表面涂覆30.0nm直径的金纳米颗粒。然后，将nta-sam涂覆的金纳米颗粒用等体积的180μmniso4活化，在室温下温育10min，洗涤，并且再悬浮在10mm的磷酸盐缓冲液(ph7.4)中。然后，在0.5μm的最终浓度下将金纳米颗粒用psmgfrn-10肽(qfnqykteaasrynltisdvsvsdvpfpfsaqsgahhhhhh)(seqidno:112)负载，并且在室温下温育10min。将从大肠杆菌表达并且纯化的重组nme7-ab蛋白在指示浓度下游离地加入至溶液中。当颗粒固定的蛋白彼此结合，或同时结合至两种不同颗粒上的两种不同的肽时，颗粒溶液颜色从粉红色/红色变化至紫色/蓝色。如果游离地加入至溶液中的蛋白引起颗粒聚集，由于结合至单肽将不会诱导两种或多种颗粒达到彼此靠近，存在强有力的证据表明游离蛋白二聚同源肽。

图33(a)示出了nta-ni-sam涂覆的用psmgfrn-10肽负载的纳米颗粒。将nme7-ab在指示浓度下游离地加入至溶液中。来自颗粒聚集的从粉红色到紫色/蓝色的溶液颜色变化，表明颗粒上的muc1*和溶液中游离的nme7之间的结合。该结果表明溶液中的nme7具有针对muc1*肽的两个结合位点。抗-muc1*抗体的fab完全抑制结合，表明颗粒聚集是由于muc1*肽和nme7的特异性相互作用。(b)示出了在较宽的浓度范围内游离地加入至溶液中的nme7-ab。观察到了表明nme7可以同时结合至两种肽的颗粒聚集。(c)示出了加入至溶液中的所有蛋白，nme7-ab几乎立即变为紫色。nm23-rs(h1二聚体)也开始几乎立即变化为紫色。包含天然nme7的t47d乳腺癌细胞系溶解产物也显著地变为紫色。

实施例16-在nme1二聚体或nme7中培养的人类es和ips细胞处于如通过在具有标明的x染色体失活、致敏状态标志的细胞核中缺少浓缩的(condensed)组蛋白-3证明的原始状态。

在最小培养基(“mm”)加nme1二聚体(nm23-rs)或nme7(nme7-ab结构)中培养人类es(hes-3干细胞，biotimeinc)和ips(sc101a-ipsc,systembiosciences)细胞8-10代。将细胞接种到已经用12.5μg/ml的结合至muc1*受体的psmgfr序列的远端部分的抗-muc1*单克隆抗体(mn-c3)涂覆的vita^tm板(thermofisher)上。周期性地贯穿10代，干细胞的样品通过免疫细胞化学(icc)试验测定并且在共聚焦显微镜(zeisslsm510共聚焦显微镜)上分析以确定组蛋白-3的细胞定位。如果组蛋白-3在细胞核(以单点出现)中浓缩，那么x染色体的拷贝已经失活并且细胞不再处于纯基态或原始态。如果干细胞已经从致敏状态(通过在fgf中培养，所有商业可获得的干细胞已经被驱动至致敏状态)回复至原始状态，那么组蛋白-3将被视为遍及斑点的“云”或不可检测。图34的f示出了根据标准方案，除它们已经在mef上的fgf中生长之外，来自相同来源的对照细胞均示出了在细胞核中浓缩的组蛋白-3(h3k27me3)，证实它们均100％处于致敏状态而不是处于原始状态。相反地，在nme7中培养10代的相同来源的细胞具有多个不含浓缩的(condensed)组蛋白-3的干细胞区域，表明它们是前x失活并且处于真正的原始状态(参见图34的d、e，白色箭头指向对于浓缩的组蛋白-3阴性的细胞)。约50％或更多的这些细胞处于原始状态，通过缺乏细胞核中浓缩的组蛋白-3而证明。图36的a-h表明在第6代下的nm23-s120g二聚体中培养的相同细胞仅约25-30％是原始的。组蛋白-3染色的“云”可以在图36的b、f中看到，而c、g表明白色箭头指向缺乏浓缩的组蛋白-3的细胞。在抗-muc1*抗体表面上的nm23-s120g二聚体中培养8代的hes-3细胞的共聚焦icc图像(图37-图39)为约50％处于原始状态并且在细胞核中缺少组蛋白-3染色。

实施例17-量化实施例16中获得的组蛋白-3染色的共聚焦图像。

使用比较在具有4ng/ml的fgf(p72)对8nmnme1(p6、p8、p10)对8nmnme7(p10)的mef上生长的细胞的共聚焦显微镜(zeisslsm510)上采集的免疫荧光图像进行hes-3干细胞(biotimeinc)的x活化状态的半定量分析。针对每个生长因子，采集×20放大倍数下随机视野区域的5-6个图像。使用oct3/4(#sc-5279,santacruz)和/或nanog(#d73g4,cellsignaling)染色鉴别多能性干细胞。通过核中的亮焦斑(brightfocusedspot)鉴别针对h3k27me3抗体(标记物，用于xist；#c36b11，cellsignaling)是阳性的多能性干细胞。针对h3k27me3染色是阴性的细胞具有微弱的漫射非聚焦染色或其不存在。使用cellcountermacroinimagej计数每个图像的细胞总数目(针对h3k27me3染色是阳性和阴性的)并且将数据表示为针对h3k27me3抗体是阴性的细胞(即，x活化的细胞)的百分比。

实施例18-与mef饲养细胞上的fgf培养基中的传统培养相比，测量在nme1二聚体(8nm)或nme7(8nm)中培养的人类es和ips细胞的克隆效率。

将人类es细胞(hes-3,biotimeinc.)和人类ips细胞(sc101a-1,systembiosciencesinc.)在最小培养基“mm”加nme1-二聚体(8nm)或nme7(8nm)中培养至少10代。将细胞接种到已经用12.5μg/ml的称为“c3”或“mn-c3”的单克隆抗-muc1*抗体涂覆的vita^tm6孔板(thermofisher)上。在以下密度下接种细胞：每孔1,000个细胞、3,000个细胞和5,000个细胞。作为对照，将来自相同亲本细胞系的相同数目的细胞接种在mef饲养细胞层上并且在4ng/ml的bfgf中培养。在4至6天之后，根据包装上的说明将细胞用碱性磷酸酶(白细胞碱性磷酸酶试剂盒，sigma-aldrich)染色，并且计数针对每个条件出现的离散集落的数目。参见图41a。每一定数目细胞的集落数目和计算的百分比效率显示在图41b中。无论是es或ips细胞，在nme1或nme7中培养的干细胞的克隆效率为约20％。然而，通过第10代显示的这些细胞群的组蛋白-3icc分析表明，仅有～50％的细胞处于是真正的原始状态的前x失活状态。因此，原始细胞的实际的克隆效率为至少两倍并且是～40％。小鼠原始干细胞的克隆效率是～30％。在该实验中，进行对照克隆效率实验，其中相同细胞在mef饲养细胞上的4ng/ml的bfgf中培养，并且产生的克隆效率是1％。

实施例19-在最小培养基(mm)或e8培养基、减fgf和tgf-β(“mn6”)加重组人类nm23-rs(nme1s120g二聚体)或nme7-ab中培养的人类ips和es细胞。

将人类ips细胞(sc101a-1,systembiosciencesinc.)接种到用12.5μg/ml的抗-muc1*mab(c3)涂覆的costar板上，并且在最小培养基(“mm”)或e8减用8nm的nm23-rs(nme1s120g二聚体)或nme7(nme7-ab)补充的fgf和tgf-β(“mn6”)中培养，其中，也将rho激酶抑制剂(roci)加入至培养基(总是)，仅用于第一个48小时，或永远不使用(参见图42-图45)。图示出了，在不存在roci的情况下，细胞连接并且具有扩散的形态，在培养基更换后留下更多的细胞被连接。在不存在roci的情况下，当基础培养基是mn6而不是mm最小培养基时，用nm23-rs或nme7培养的细胞具有更多的细胞连接。除了在基质胶上接种细胞之外，当进行相同的实验时，roci存在与否是无关紧要的(参见图46-图48)。使用具有本质上相同结果(图49-图50)的人类es细胞(hes-3,biotimeinc.)进行相同实验。

实施例20-用于在最小培养基(mm)或e8培养基减fgf和tgf-β(“mn6”)加重组人类nm23-rs(nme1s120g二聚体)或nme7-ab中培养的基质胶上的人类ips和es细胞的原始和致敏基因的rt-pcr量化表达。

将接种到基质胶上的人类es细胞(hes-3,biotimeinc.)在用8nm的nme7加/减rho激酶抑制剂(roci)补充的mn6培养基或mm培养基中培养。为了比较，将细胞也在含bfgf的e8培养基中培养。rt-pcr如以上实施例13中描述的进行并且归一化为e8对照。不期望的致敏态的标记是foxa2、otx、lhx和xist。不期望的原始态的标记是oct4、nanog、klf4和klf2。图51示出了：与e8相比，在mn6/nme7中培养的细胞具有一些多能性基因的增加的表达并且具有致敏(primed)基因foxa2降低的表达。

实施例21

将人类es细胞(hes-3,biotimeinc.)接种到用抗-muc1*抗体(c3)涂覆的vita^tm板(thermofisher)上并且在最小培养基(mm)中的重组人类nm23(nme1s120g二聚体)或nme7-ab中培养。rt-pcr如实施例13中描述的进行。不期望的致敏态的标记是foxa2、otx、lhx和xist。不期望的原始态的标记是oct4、nanog、klf4和klf2。如图52所示：在nm23和nme7中培养的细胞之间本质上没有区别。

实施例22-在nme蛋白对fgf中并且在存在或不存在rho激酶抑制剂的多个表面上培养的人类es细胞的rt-pcr分析。

将人类es细胞(hes-3,biotimeinc.)接种到用抗-muc1*抗体(c3)、mef饲养细胞涂覆的vita^tm板(thermofisher)或基质胶上。在最小培养基(mm)加nm23-h1s120g二聚体(nme1二聚体)或nme7-ab中将vita/c3抗体表面上的细胞培养3代。根据标准操作，将通过mef接种的细胞在mm加fgf中培养23代。在mm培养基或mn6培养基中的nme7中并且在存在或不存在rho激酶抑制剂(roci)的情况下，将基质胶上的细胞培养1代。不期望的致敏态的标记是foxa2、otx、lhx和xist。不期望的原始态的标记是oct4、nanog、klf4和klf2。如图53所示，针对nme7-ab和nm23-h1二聚体的基因表达谱基本上相等。注意到：在来自fgf生长的nme蛋白中的仅3代之后，细胞还未完全是原始，而xist，x失活的指标仍然很高。参照实施例17，在第6代，仅25-30％的细胞具有两个活性x染色体并且在第10代，大于50％的细胞处于真正的原始状态(前x失活)。图53表明：与nme生长细胞相比，一些原始态标记是较低的(klf2/4)并且一些致敏态标记是较高的(foxa2)。与在muc1*抗体的表面上的生长相比，在基质胶上的nme7中的生长不利地影响原始基因减少并且致敏基因增加的基因表达的迹象。在相同实验中，还可以在mm培养基或mn6培养基加或减roci(rho激酶抑制剂)中的nm23-s120g二聚体中培养接种到基质胶上的细胞(图54)。再次，基质胶表面消极地影响基因表达谱并且似乎使得细胞较不原始。

实施例23-检测nme7

实施例23.1-检测胚胎干细胞和ips细胞中的nme7

将人类es细胞(bgo1v和hes-3)以及ips细胞(sc101-a1)在其中细胞通过抗-muc1*抗体的层接种的基于nme的培养基中培养。为了鉴别nme7物种，用利用蛋白酶抑制剂(pierce)补充的ripa缓冲液(pierce)收获并且溶解细胞。细胞溶解产物(20μl)通过12％sds-page还原凝胶上的电泳分离并且转移到pvdf膜(gehealthcare)。印迹用包含3％的牛奶的pbs-t封闭，然后在4℃下用初级抗体(抗nm23-h7克隆b-9，santacruzbiotechnology)温育过夜。在用pbs-t洗涤之后，膜用辣根过氧化物酶(hrp)-共轭二级抗体(山羊抗小鼠，pierce)在室温下温育1h。用immun-star化学发光试剂盒(bio-rad)检测信号。图55的a、图55的c的蛋白质印迹示出了nme7以～40kda物质以及可以是可变剪接同种型或翻译后修饰如切割的～25-30kda的较小分子量nme7物质存在。

此外，人类ips细胞(sc101-a1)如以上描述或在存在抑制oct4、nme1、nme6或nme7的sirna的情况下培养。图56的蛋白质印迹表明当抑制oct4、nme6或nme7时，高分子量带(～40kda)消失。然而，当抑制nme1时其不会消失。该结果与nme6、nme7和oct4是关键多能性基因的设想一致。该结果还与高分子量形式是响应于抑制调节其表达的相关基因的表达形式(在切割产品之前将消失)的设想一致。

实施例23.2-检测ips条件培养基中的nme7

ips条件培养基(conditionedmedia)(20μl)通过12％sds-page还原凝胶上的电泳分离并且转移到pvdf膜(gehealthcare)。印迹用包含3％的牛奶的pbs-t封闭，然后在4℃下用初级抗体(抗nm23-h7克隆b-9，santacruzbiotechnology)温育过夜。在用pbs-t洗涤之后，膜用辣根过氧化物酶(hrp)-共轭二级抗体(山羊抗小鼠，pierce)在室温下温育1h。用immun-star化学发光试剂盒(bio-rad)检测信号。图55的b的蛋白质印迹示出了分泌的具有约30kda的分子量的nme7物质。注意到：重组nme7-ab具有30kda的分子量并且如此能够同时结合至两个muc1*肽并且还完全支持多能性干细胞生长，诱导多能性并且抑制分化。～25-30kda的nme7物质可以是可变剪接同种型(alternativespliceisoform)或翻译后修饰如可以使得能够从细胞分泌的切割。

实施例23.3-nme7免疫沉淀和通过质谱分析

使用nme7特异性抗体(nm23h7b9,santacruz)，在一组muc1*阳性细胞上进行拉下试验。根据标准方案(t47d)培养乳腺癌细胞(t47d)以及人类es(bgo1v和hes-3)和ips(sc101-a1)细胞或在抗-muc1*抗体表面上的基于nme的培养基中培养。细胞用由蛋白酶抑制剂(pierce)补充的ripa缓冲液(pierce)溶解。细胞溶解产物用在4℃下温育2h的10μg的重组nme7-ab补充。然后，nme7在4℃下用连接至磁珠蛋白g(lifetechnologies)的抗nm23-h7(b-9,santacruzbiotechnology)免疫沉淀过夜。珠用pbs洗涤两次并且免疫沉淀蛋白通过12％sds-page还原凝胶上的电泳分离。通过银染(pierce)检测蛋白。与nme7共免疫沉淀的来自t47d样品和bgo1v细胞的蛋白的～23kda带被切除并且通过质谱分析(taplinmassspectrometryfacility,harvardmedicalschool)。质谱分析表明被切除的蛋白条带均包含来自如以下示出的nme7ndpka结构域的序列。通过质谱鉴定nme7的a结构域中的下划线序列。

mnhserfvfiaewydpnasllrryellfypgdgsvemhdvknhrtflkrtkydnlhledlfignkvnvfsrqlvlidygdqytarqlgsrkektlalikpdaiskageiieiinkagftitklkmmmlsrkealdfhvdhqsrpffneliqfittgpiiameilrddaicewkrllgpansgvartdasesiralfgtdgirnaahgpdsfasaaremelffpssggcgpantakfinctccivkphavsegllgkilmairdagfeisamqmfnmdrvnveefyevykgvvteyhdmvtemysgpcvameiqqnnatktfrefcgpadpeiarhlrpgtlraifgktkiqnavhctdlpedgllevqyffkildn(seqidno:113)

用nme7免疫沉淀的较高分子量(～30kda)的蛋白条带没有使用质谱分析并且可以相应于可以是切割产物的内源性nme7蛋白或可变剪接同种型或可替换地可以是添加至细胞溶解产物的nme7-ab～33kda。

实施例24-表明nme7-ab同时结合至两种muc1*胞外结构域肽的elisa试验

使用imject马来酰亚胺活化的bsa试剂盒(thermofisher)，将带有c-端半光氨酸(psmgfr-cys)的psmgfr肽共价结合至bsa。在0.1m碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液ph9.6中，将psmgfr-cys连接的bsa稀释成10μg/ml，并且将50μl加入至96孔板的每一孔中。在4℃下过夜温育之后，用pbs-t将板洗涤两次并且加入3％的bsa溶液以封闭孔上的剩余结合位点。在室温下1h之后，用pbs-t将板洗涤两次并且以不同的浓度加入在pbs-t+1％bsa中稀释的nme7。在室温下1h之后，用pbs-t将板洗涤3x次并且以1/500稀释率加入在pbs-t+1％bsa中稀释的抗-nm23-h7(b-9,santacruzbiotechnology)。在室温下1h之后，用pbs-t将板洗涤3x次并且以1/3333的稀释率加入在pbs-t+1％bsa中稀释的山羊抗小鼠-hrp。在室温下1h之后，用pbs-t将板洗涤3x次并且使用abts溶液(pierce)在415nm下测定nme7的结合。

elisamuc1*二聚：使用针对nme7结合的方案并且在11.6μg/ml下使用nme7。

在室温下1h之后，用pbs-t将板洗涤3x次并且以不同的浓度加入在pbs-t+1％bsa中稀释的his标记的psmgfr肽(psmgfr-his)或生物素化psmgfr肽(psmgfr-生物素)。在室温下1h之后，用pbs-t将板洗涤3x次并且以1/5000的浓度加入在pbs-t+1％bsa中稀释的抗his标签-hrp(abcam)或链霉亲和素-hrp(pierce)。在室温下1h之后，用pbs-t将板洗涤3x次并且使用abts溶液(pierce)在415nm下测定psmgfr肽与已经结合至另一个psmgfr肽(通过抗-his抗体或通过链霉亲和素可能没有信号)连接bsa的nme7的结合。

实施例25-nme6克隆、表达和纯化

通过genscript,nj对于我们的要求合成了用于大肠杆菌表达的密码子优化的wtnme6cdna。然后，使用以下引物通过聚合酶链反应(pcr)扩增wtnme6cdna：5'-atcgacatatgacgcaaaatctgggctcggaaatg-3'(seqidno:114)和5'-actgcctcgagtgccggacccagaccacccgtgc-3'(seqidno:115)。在用ndei和xhoi限制性酶(newenglishbiolabs)消化之后，将纯化的片段克隆到用相同限制性酶消化的pet21b载体(novagen)中。

实施例26-nme6蛋白表达/纯化

lb肉汤培养(luria-bertanibroth)用1/10的过夜培养基接种并且在37℃下培养直至od600达到～0.5。在该点，用0.4mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg,goldbiotechnology)诱导重组蛋白表达并且在5h之后停止培养。在通过离心法(在4℃下以6000rpm离心10min)收获细胞之后，用运行缓冲液：pbsph7.4、360mmnacl、10mm咪唑和8m尿素再悬浮细胞沉淀。在37℃下在转台(275rpm)上温育细胞悬浮液30min并且在冰上超声处理5min。通过离心(在4℃下以20000rpm离心30min)除去不溶的细胞碎片。然后，将澄清的溶解产物施加到用运行缓冲液平衡的ni-nta柱(qiagen)。用4cv的运行缓冲液洗涤柱，然后，用30mm的咪唑补充4cv的运行缓冲液，再用由420mm咪唑补充的运行缓冲液(8cv)从柱洗脱蛋白之前。然后，通过透析将蛋白复性(图59)。

实施例27-复性方案

1.对100mmtrisph8.0、4m尿素、0.2mm咪唑、0.4ml-精氨酸、1mmedta和5％的甘油透析过夜。

2.对100mmtrisph8.0、2m尿素、0.2mm咪唑、0.4ml-精氨酸、1mmedta和5％的甘油透析24h。

3.对100mmtrisph8.0、1m尿素、0.2mm咪唑、0.4ml-精氨酸、1mmedta和5％的甘油透析24h。

4.对100mmtrisph8.0、0.2mm咪唑、0.4ml-精氨酸、1mmedta和5％的甘油透析8h。

5.对25mmtrisph8.0、0.2mm咪唑、0.1ml-精氨酸、1mmedta和5％的甘油透析过夜。

6.对pbsph7.4、0.2mm咪唑、1mmedta和5％的甘油透析3x3h。

7.对pbsph7.4、0.2mm咪唑、1mmedta和5％的甘油透析过夜。

8.在4℃下离心复性蛋白(18,500rpm)30min并且收集上清液用于进一步纯化。

通过尺寸排阻色谱法(superdex200)进一步纯化蛋白。

通过引用将本文中引用的所有参考文献的全部内容合并于此。

部分引用的参考文献列表

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*****

本领域技术人员只需使用常规试验就将会意识到或能够确定本文中具体描述的本发明的具体实施方式的许多等同物。这些等同物旨在包含在权利要求的范围内。

序列表

<110>米纳瓦生物技术公司（minervabiotechnologiescorporation）

<120>用于干细胞增殖和诱导的培养基

<130>13150-70124pct

<140>pct/us12/60684

<141>2012-10-17

<160>116

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1255

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>全长muc1受体

<400>1

metthrproglythrglnserprophepheleuleuleuleuleuthr

151015

valleuthrvalvalthrglyserglyhisalaserserthrprogly

202530

glyglulysgluthrseralathrglnargserservalproserser

354045

thrglulysasnalavalsermetthrserservalleuserserhis

505560

serproglyserglyserserthrthrglnglyglnaspvalthrleu

65707580

alaproalathrgluproalaserglyseralaalathrtrpglygln

859095

aspvalthrservalprovalthrargproalaleuglyserthrthr

100105110

proproalahisaspvalthrseralaproaspasnlysproalapro

115120125

glyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproaspthr

130135140

argproalaproglyserthralaproproalahisglyvalthrser

145150155160

alaproaspthrargproalaproglyserthralaproproalahis

165170175

glyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyserthrala

180185190

proproalahisglyvalthrseralaproaspthrargproalapro

195200205

glyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproaspthr

210215220

argproalaproglyserthralaproproalahisglyvalthrser

225230235240

alaproaspthrargproalaproglyserthralaproproalahis

245250255

glyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyserthrala

260265270

proproalahisglyvalthrseralaproaspthrargproalapro

275280285

glyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproaspthr

290295300

argproalaproglyserthralaproproalahisglyvalthrser

305310315320

alaproaspthrargproalaproglyserthralaproproalahis

325330335

glyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyserthrala

340345350

proproalahisglyvalthrseralaproaspthrargproalapro

355360365

glyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproaspthr

370375380

argproalaproglyserthralaproproalahisglyvalthrser

385390395400

alaproaspthrargproalaproglyserthralaproproalahis

405410415

glyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyserthrala

420425430

proproalahisglyvalthrseralaproaspthrargproalapro

435440445

glyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproaspthr

450455460

argproalaproglyserthralaproproalahisglyvalthrser

465470475480

alaproaspthrargproalaproglyserthralaproproalahis

485490495

glyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyserthrala

500505510

proproalahisglyvalthrseralaproaspthrargproalapro

515520525

glyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproaspthr

530535540

argproalaproglyserthralaproproalahisglyvalthrser

545550555560

alaproaspthrargproalaproglyserthralaproproalahis

565570575

glyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyserthrala

580585590

proproalahisglyvalthrseralaproaspthrargproalapro

595600605

glyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproaspthr

610615620

argproalaproglyserthralaproproalahisglyvalthrser

625630635640

alaproaspthrargproalaproglyserthralaproproalahis

645650655

glyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyserthrala

660665670

proproalahisglyvalthrseralaproaspthrargproalapro

675680685

glyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproaspthr

690695700

argproalaproglyserthralaproproalahisglyvalthrser

705710715720

alaproaspthrargproalaproglyserthralaproproalahis

725730735

glyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyserthrala

740745750

proproalahisglyvalthrseralaproaspthrargproalapro

755760765

glyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproaspthr

770775780

argproalaproglyserthralaproproalahisglyvalthrser

785790795800

alaproaspthrargproalaproglyserthralaproproalahis

805810815

glyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyserthrala

820825830

proproalahisglyvalthrseralaproaspthrargproalapro

835840845

glyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproaspthr

850855860

argproalaproglyserthralaproproalahisglyvalthrser

865870875880

alaproaspthrargproalaproglyserthralaproproalahis

885890895

glyvalthrseralaproaspthrargproalaproglyserthrala

900905910

proproalahisglyvalthrseralaproaspthrargproalapro

915920925

glyserthralaproproalahisglyvalthrseralaproaspasn

930935940

argproalaleuglyserthralaproprovalhisasnvalthrser

945950955960

alaserglyseralaserglyseralaserthrleuvalhisasngly

965970975

thrseralaargalathrthrthrproalaserlysserthrprophe

980985990

serileproserhishisseraspthrprothrthrleualaserhis

99510001005

serthrlysthraspalaserserthrhishisserservalpro

101010151020

proleuthrserserasnhisserthrserproglnleuserthr

102510301035

glyvalserphephepheleuserphehisileserasnleugln

104010451050

pheasnserserleugluaspproserthrasptyrtyrglnglu

105510601065

leuglnargaspileserglumetpheleuglniletyrlysgln

107010751080

glyglypheleuglyleuserasnilelyspheargproglyser

108510901095

valvalvalglnleuthrleualaphearggluglythrileasn

110011051110

valhisaspvalgluthrglnpheasnglntyrlysthrgluala

111511201125

alaserargtyrasnleuthrileseraspvalservalserasp

113011351140

valprophepropheseralaglnserglyalaglyvalprogly

114511501155

trpglyilealaleuleuvalleuvalcysvalleuvalalaleu

116011651170

alailevaltyrleuilealaleualavalcysglncysargarg

117511801185

lysasntyrglyglnleuaspilepheproalaargaspthrtyr

119011951200

hisprometserglutyrprothrtyrhisthrhisglyargtyr

120512101215

valproproserserthraspargserprotyrglulysvalser

122012251230

alaglyasnglyglyserserleusertyrthrasnproalaval

123512401245

alaalaalaseralaasnleu

12501255

<210>2

<211>19

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>n-端muc-1信号序列

<400>2

metthrproglythrglnserprophepheleuleuleuleuleuthr

151015

valleuthr

<210>3

<211>23

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>n-端muc-1信号序列

<400>3

metthrproglythrglnserprophepheleuleuleuleuleuthr

151015

valleuthrvalvalthrala

20

<210>4

<211>23

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>n-端muc-1信号序列

<400>4

metthrproglythrglnserprophepheleuleuleuleuleuthr

151015

valleuthrvalvalthrgly

20

<210>5

<211>146

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>在其n-端具有nat-psmgfr的截短的muc1受体同种型

<400>5

glythrileasnvalhisaspvalgluthrglnpheasnglntyrlys

151015

thrglualaalaserargtyrasnleuthrileseraspvalserval

202530

seraspvalprophepropheseralaglnserglyalaglyvalpro

354045

glytrpglyilealaleuleuvalleuvalcysvalleuvalalaleu

505560

alailevaltyrleuilealaleualavalcysglncysargarglys

65707580

asntyrglyglnleuaspilepheproalaargaspthrtyrhispro

859095

metserglutyrprothrtyrhisthrhisglyargtyrvalpropro

100105110

serserthraspargserprotyrglulysvalseralaglyasngly

115120125

glyserserleusertyrthrasnproalavalalaalaalaserala

130135140

asnleu

145

<210>6

<211>45

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>muc1生长因子受体的天然一级序列

<400>6

glythrileasnvalhisaspvalgluthrglnpheasnglntyrlys

151015

thrglualaalaserargtyrasnleuthrileseraspvalserval

202530

seraspvalprophepropheseralaglnserglyala

354045

<210>7

<211>44

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>muc1生长因子受体的天然一级序列

<400>7

thrileasnvalhisaspvalgluthrglnpheasnglntyrlysthr

151015

glualaalaserargtyrasnleuthrileseraspvalservalser

202530

aspvalprophepropheseralaglnserglyala

3540

<210>8

<211>45

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>muc1生长因子受体的天然一级序列的"spy"功能性变异体

<400>8

glythrileasnvalhisaspvalgluthrglnpheasnglntyrlys

151015

thrglualaalaserprotyrasnleuthrileseraspvalserval

202530

seraspvalprophepropheseralaglnserglyala

354045

<210>9

<211>44

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>muc1生长因子受体的天然一级序列的"spy"功能性变异体

<400>9

thrileasnvalhisaspvalgluthrglnpheasnglntyrlysthr

151015

glualaalaserprotyrasnleuthrileseraspvalservalser

202530

aspvalprophepropheseralaglnserglyala

3540

<210>10

<211>216

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>muc胞质结构域核苷酸序列

<400>10

tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctac60

catcctatgagcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagt120

accgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttac180

acaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg216

<210>11

<211>72

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>muc1胞质结构域的氨基酸序列

<400>11

cysglncysargarglysasntyrglyglnleuaspilepheproala

151015

argaspthrtyrhisprometserglutyrprothrtyrhisthrhis

202530

glyargtyrvalproproserserthraspargserprotyrglulys

354045

valseralaglyasnglyglyserserleusertyrthrasnproala

505560

valalaalaalaseralaasnleu

6570

<210>12

<211>854

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>nme7核苷酸序列

<400>12

gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatc60

caaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttg120

aaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgc180

acttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaa240

ttgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctag300

ccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaag360

ctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggatt420

ttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactg480

gtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgc540

tgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctct600

ttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggcca660

gagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaat720

ttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggtatgttgaata780

cactatattcagtacattttgttaataggagagcaatgtttattttcttgatgtacttta840

tgtatagaaaataa854

<210>13

<211>283

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>nme7氨基酸序列

<400>13

aspprogluthrmetasnhissergluargphevalpheilealaglu

151015

trptyraspproasnalaserleuleuargargtyrgluleuleuphe

202530

tyrproglyaspglyservalglumethisaspvallysasnhisarg

354045

thrpheleulysargthrlystyraspasnleuhisleugluaspleu

505560

pheileglyasnlysvalasnvalpheserargglnleuvalleuile

65707580

asptyrglyaspglntyrthralaargglnleuglyserarglysglu

859095

lysthrleualaleuilelysproaspalaileserlysalaglyglu

100105110

ileilegluileileasnlysalaglyphethrilethrlysleulys

115120125

metmetmetleuserarglysglualaleuaspphehisvalasphis

130135140

glnserargprophepheasngluleuileglnpheilethrthrgly

145150155160

proileilealametgluileleuargaspaspalailecysglutrp

165170175

lysargleuleuglyproalaasnserglyvalalaargthraspala

180185190

sergluserileargalaleupheglythraspglyileargasnala

195200205

alahisglyproaspserphealaseralaalaargglumetgluleu

210215220

phepheproserserglyglycysglyproalaasnthralalysphe

225230235240

thrasncysthrcyscysilevallysprohisalavalserglugly

245250255

metleuasnthrleutyrservalhisphevalasnargargalamet

260265270

pheilepheleumettyrphemettyrarglys

275280

<210>14

<211>534

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>nm23-h1核苷酸序列

<400>14

atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagc60

tgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggg120

gtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgcctt180

gttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctg240

aaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgcc300

atggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaac360

cctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaac420

attatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcac480

cctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga534

<210>15

<211>177

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>nm23-h1氨基酸序列

<400>15

metvalleuleuserthrleuglyilevalpheglnglygluglypro

151015

proilesersercysaspthrglythrmetalaasncysgluargthr

202530

pheilealailelysproaspglyvalglnargglyleuvalglyglu

354045

ileilelysargphegluglnlysglypheargleuvalglyleulys

505560

phemetglnalasergluaspleuleulysgluhistyrvalaspleu

65707580

lysaspargprophephealaglyleuvallystyrmethissergly

859095

provalvalalametvaltrpgluglyleuasnvalvallysthrgly

100105110

argvalmetleuglygluthrasnproalaaspserlysproglythr

115120125

ileargglyaspphecysileglnvalglyargasnileilehisgly

130135140

seraspservalgluseralaglulysgluileglyleutrpphehis

145150155160

proglugluleuvalasptyrthrsercysalaglnasntrpiletyr

165170175

glu

<210>16

<211>534

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>nm23-h1s120g突变体核苷酸序列

<400>16

atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagc60

tgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggg120

gtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgcctt180

gttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctg240

aaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgcc300

atggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaac360

cctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaac420

attatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcac480

cctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga534

<210>17

<211>177

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>nm23-h1s120g突变体氨基酸序列

<400>17

metvalleuleuserthrleuglyilevalpheglnglygluglypro

151015

proilesersercysaspthrglythrmetalaasncysgluargthr

202530

pheilealailelysproaspglyvalglnargglyleuvalglyglu

354045

ileilelysargphegluglnlysglypheargleuvalglyleulys

505560

phemetglnalasergluaspleuleulysgluhistyrvalaspleu

65707580

lysaspargprophephealaglyleuvallystyrmethissergly

859095

provalvalalametvaltrpgluglyleuasnvalvallysthrgly

100105110

argvalmetleuglygluthrasnproalaaspserlysproglythr

115120125

ileargglyaspphecysileglnvalglyargasnileilehisgly

130135140

glyaspservalgluseralaglulysgluileglyleutrpphehis

145150155160

proglugluleuvalasptyrthrsercysalaglnasntrpiletyr

165170175

glu

<210>18

<211>459

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>nm23-h2核苷酸序列

<400>18

atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctg60

gtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttc120

ctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattc180

ttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggagggg240

ctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaag300

ccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagt360

gattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggtt420

gactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa459

<210>19

<211>152

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>nm23-h2氨基酸序列

<400>19

metalaasnleugluargthrpheilealailelysproaspglyval

151015

glnargglyleuvalglygluileilelysargphegluglnlysgly

202530

pheargleuvalalametlyspheleuargalaserglugluhisleu

354045

lysglnhistyrileaspleulysaspargprophepheproglyleu

505560

vallystyrmetasnserglyprovalvalalametvaltrpglugly

65707580

leuasnvalvallysthrglyargvalmetleuglygluthrasnpro

859095

alaaspserlysproglythrileargglyaspphecysileglnval

100105110

glyargasnileilehisglyseraspservallysseralaglulys

115120125

gluileserleutrpphelysproglugluleuvalasptyrlysser

130135140

cysalahisasptrpvaltyrglu

145150

<210>20

<211>1023

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的编码人类nm23-h7-2序列的dna

<400>20

atgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcat60

ctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatc120

gattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggcc180

ctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcg240

ggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggatttt300

catgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggt360

ccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctg420

ggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgttt480

ggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgt540

gaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaattt600

accaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaa660

attctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatg720

gaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcac780

gatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaat840

gccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctg900

cgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgt960

accgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataat1020

tga1023

<210>21

<211>340

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的人类nm23-h7-2序列

<400>21

methisaspvallysasnhisargthrpheleulysargthrlystyr

151015

aspasnleuhisleugluaspleupheileglyasnlysvalasnval

202530

pheserargglnleuvalleuileasptyrglyaspglntyrthrala

354045

argglnleuglyserarglysglulysthrleualaleuilelyspro

505560

aspalaileserlysalaglygluileilegluileileasnlysala

65707580

glyphethrilethrlysleulysmetmetmetleuserarglysglu

859095

alaleuaspphehisvalasphisglnserargprophepheasnglu

100105110

leuileglnpheilethrthrglyproileilealametgluileleu

115120125

argaspaspalailecysglutrplysargleuleuglyproalaasn

130135140

serglyvalalaargthraspalasergluserileargalaleuphe

145150155160

glythraspglyileargasnalaalahisglyproaspserpheala

165170175

seralaalaargglumetgluleuphepheproserserglyglycys

180185190

glyproalaasnthralalysphethrasncysthrcyscysileval

195200205

lysprohisalavalsergluglyleuleuglylysileleumetala

210215220

ileargaspalaglyphegluileseralametglnmetpheasnmet

225230235240

aspargvalasnvalglugluphetyrgluvaltyrlysglyvalval

245250255

thrglutyrhisaspmetvalthrglumettyrserglyprocysval

260265270

alametgluileglnglnasnasnalathrlysthrphearggluphe

275280285

cysglyproalaaspprogluilealaarghisleuargproglythr

290295300

leuargalailepheglylysthrlysileglnasnalavalhiscys

305310315320

thraspleuprogluaspglyleuleugluvalglntyrphephelys

325330335

ileleuaspasn

340

<210>22

<211>399

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>编码人类nme7-a的dna

<400>22

atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataatt60

gaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaagg120

aaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatc180

cagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgt240

gaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaa300

agcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattct360

tttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga399

<210>23

<211>132

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>人类nme7-a

<400>23

metglulysthrleualaleuilelysproaspalaileserlysala

151015

glygluileilegluileileasnlysalaglyphethrilethrlys

202530

leulysmetmetmetleuserarglysglualaleuaspphehisval

354045

asphisglnserargprophepheasngluleuileglnpheilethr

505560

thrglyproileilealametgluileleuargaspaspalailecys

65707580

glutrplysargleuleuglyproalaasnserglyvalalaargthr

859095

aspalasergluserileargalaleupheglythraspglyilearg

100105110

asnalaalahisglyproaspserphealaseralaalaargglumet

115120125

gluleuphephe

130

<210>24

<211>444

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>编码人类nme7-a1的dna

<400>24

atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataatt60

gaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaagg120

aaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatc180

cagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgt240

gaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaa300

agcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattct360

tttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccg420

gcaaacactgctaaatttacttga444

<210>25

<211>147

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>人类nme7-a1

<400>25

metglulysthrleualaleuilelysproaspalaileserlysala

151015

glygluileilegluileileasnlysalaglyphethrilethrlys

202530

leulysmetmetmetleuserarglysglualaleuaspphehisval

354045

asphisglnserargprophepheasngluleuileglnpheilethr

505560

thrglyproileilealametgluileleuargaspaspalailecys

65707580

glutrplysargleuleuglyproalaasnserglyvalalaargthr

859095

aspalasergluserileargalaleupheglythraspglyilearg

100105110

asnalaalahisglyproaspserphealaseralaalaargglumet

115120125

gluleuphepheproserserglyglycysglyproalaasnthrala

130135140

lysphethr

145

<210>26

<211>669

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>编码人类nme7-a2的dna

<400>26

atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcactt60

cttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgta120

aagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagattta180

tttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggat240

caatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaacca300

gatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactata360

accaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcac420

cagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgcc480

atggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaac540

tctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggc600

ataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttg660

tttttttga669

<210>27

<211>222

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>人类nme7-a2

<400>27

metasnhissergluargphevalpheilealaglutrptyrasppro

151015

asnalaserleuleuargargtyrgluleuleuphetyrproglyasp

202530

glyservalglumethisaspvallysasnhisargthrpheleulys

354045

argthrlystyraspasnleuhisleugluaspleupheileglyasn

505560

lysvalasnvalpheserargglnleuvalleuileasptyrglyasp

65707580

glntyrthralaargglnleuglyserarglysglulysthrleuala

859095

leuilelysproaspalaileserlysalaglygluileilegluile

100105110

ileasnlysalaglyphethrilethrlysleulysmetmetmetleu

115120125

serarglysglualaleuaspphehisvalasphisglnserargpro

130135140

phepheasngluleuileglnpheilethrthrglyproileileala

145150155160

metgluileleuargaspaspalailecysglutrplysargleuleu

165170175

glyproalaasnserglyvalalaargthraspalasergluserile

180185190

argalaleupheglythraspglyileargasnalaalahisglypro

195200205

aspserphealaseralaalaargglumetgluleuphephe

210215220

<210>28

<211>714

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>编码人类nme7-a3的dna

<400>28

atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcactt60

cttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgta120

aagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagattta180

tttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggat240

caatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaacca300

gatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactata360

accaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcac420

cagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgcc480

atggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaac540

tctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggc600

ataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttg660

ttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga714

<210>29

<211>237

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>人类nme7-a3

<400>29

metasnhissergluargphevalpheilealaglutrptyrasppro

151015

asnalaserleuleuargargtyrgluleuleuphetyrproglyasp

202530

glyservalglumethisaspvallysasnhisargthrpheleulys

354045

argthrlystyraspasnleuhisleugluaspleupheileglyasn

505560

lysvalasnvalpheserargglnleuvalleuileasptyrglyasp

65707580

glntyrthralaargglnleuglyserarglysglulysthrleuala

859095

leuilelysproaspalaileserlysalaglygluileilegluile

100105110

ileasnlysalaglyphethrilethrlysleulysmetmetmetleu

115120125

serarglysglualaleuaspphehisvalasphisglnserargpro

130135140

phepheasngluleuileglnpheilethrthrglyproileileala

145150155160

metgluileleuargaspaspalailecysglutrplysargleuleu

165170175

glyproalaasnserglyvalalaargthraspalasergluserile

180185190

argalaleupheglythraspglyileargasnalaalahisglypro

195200205

aspserphealaseralaalaargglumetgluleuphepheproser

210215220

serglyglycysglyproalaasnthralalysphethr

225230235

<210>30

<211>408

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>编码人类nme7-b的dna

<400>30

atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaag60

atcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatg120

gatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcat180

gacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataat240

gctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcattta300

cgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgt360

actgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga408

<210>31

<211>135

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>人类nme7-b

<400>31

metasncysthrcyscysilevallysprohisalavalserglugly

151015

leuleuglylysileleumetalaileargaspalaglyphegluile

202530

seralametglnmetpheasnmetaspargvalasnvalglugluphe

354045

tyrgluvaltyrlysglyvalvalthrglutyrhisaspmetvalthr

505560

glumettyrserglyprocysvalalametgluileglnglnasnasn

65707580

alathrlysthrphearggluphecysglyproalaaspprogluile

859095

alaarghisleuargproglythrleuargalailepheglylysthr

100105110

lysileglnasnalavalhiscysthraspleuprogluaspglyleu

115120125

leugluvalglntyrphephe

130135

<210>32

<211>426

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>编码人类nme7-b1的dna

<400>32

atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaag60

atcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatg120

gatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcat180

gacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataat240

gctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcattta300

cgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgt360

actgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataat420

tagtga426

<210>33

<211>140

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>人类nme7-b1

<400>33

metasncysthrcyscysilevallysprohisalavalserglugly

151015

leuleuglylysileleumetalaileargaspalaglyphegluile

202530

seralametglnmetpheasnmetaspargvalasnvalglugluphe

354045

tyrgluvaltyrlysglyvalvalthrglutyrhisaspmetvalthr

505560

glumettyrserglyprocysvalalametgluileglnglnasnasn

65707580

alathrlysthrphearggluphecysglyproalaaspprogluile

859095

alaarghisleuargproglythrleuargalailepheglylysthr

100105110

lysileglnasnalavalhiscysthraspleuprogluaspglyleu

115120125

leugluvalglntyrphephelysileleuaspasn

130135140

<210>34

<211>446

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>编码人类nme7-b2的dna

<400>34

atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgt60

tgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatc120

cgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgtt180

gaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaa240

atgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacattt300

cgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctc360

agagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagag420

gatggcctattagaggttcaatactt446

<210>35

<211>150

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>人类nme7-b2

<400>35

metproserserglyglycysglyproalaasnthralalysphethr

151015

asncysthrcyscysilevallysprohisalavalsergluglyleu

202530

leuglylysileleumetalaileargaspalaglyphegluileser

354045

alametglnmetpheasnmetaspargvalasnvalglugluphetyr

505560

gluvaltyrlysglyvalvalthrglutyrhisaspmetvalthrglu

65707580

mettyrserglyprocysvalalametgluileglnglnasnasnala

859095

thrlysthrphearggluphecysglyproalaaspprogluileala

100105110

arghisleuargproglythrleuargalailepheglylysthrlys

115120125

ileglnasnalavalhiscysthraspleuprogluaspglyleuleu

130135140

gluvalglntyrphephe

145150

<210>36

<211>471

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>编码人类nme7-b3的dna

<400>36

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<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

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202530

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505560

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<213>人工序列（artificialsequence）

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<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>人类nme7-ab

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151015

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202530

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505560

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<220>

<223>编码人类nme7-ab1的dna

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gaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagct540

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gtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatg660

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<210>41

<211>281

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<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>人类nme7-ab1

<400>41

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151015

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202530

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aspalasergluserileargalaleupheglythraspglyilearg

100105110

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145150155160

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165170175

gluileseralametglnmetpheasnmetaspargvalasnvalglu

180185190

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195200205

valthrglumettyrserglyprocysvalalametgluileglngln

210215220

asnasnalathrlysthrphearggluphecysglyproalaasppro

225230235240

gluilealaarghisleuargproglythrleuargalailephegly

245250255

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260265270

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<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

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<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的人类nme7-a序列

<400>43

metglulysthrleualaleuilelysproaspalaileserlysala

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202530

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505560

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100105110

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<210>44

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<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的编码人类nme7-a1序列的dna

<400>44

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gaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgt120

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<210>45

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<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的人类nme7-a1序列

<400>45

metglulysthrleualaleuilelysproaspalaileserlysala

151015

glygluileilegluileileasnlysalaglyphethrilethrlys

202530

leulysmetmetmetleuserarglysglualaleuaspphehisval

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505560

thrglyproileilealametgluileleuargaspaspalailecys

65707580

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aspalasergluserileargalaleupheglythraspglyilearg

100105110

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lysphethr

145

<210>46

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<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的编码人类nme7-a2序列的dna

<400>46

atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctg60

ctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgtt120

aaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctg180

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<210>47

<211>222

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的人类nme7-a2序列

<400>47

metasnhissergluargphevalpheilealaglutrptyrasppro

151015

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leuilelysproaspalaileserlysalaglygluileilegluile

100105110

ileasnlysalaglyphethrilethrlysleulysmetmetmetleu

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130135140

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180185190

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<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的编码人类nme7-a3序列的dna

<400>48

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<210>49

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<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的人类nme7-a3序列

<400>49

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65707580

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leuilelysproaspalaileserlysalaglygluileilegluile

100105110

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130135140

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145150155160

metgluileleuargaspaspalailecysglutrplysargleuleu

165170175

glyproalaasnserglyvalalaargthraspalasergluserile

180185190

argalaleupheglythraspglyileargasnalaalahisglypro

195200205

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<400>50

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<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

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<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的编码人类nme7-b1序列的dna

<400>52

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tga423

<210>53

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<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的人类nme7-b1序列

<400>53

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151015

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<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

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<400>54

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<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

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asncysthrcyscysilevallysprohisalavalsergluglyleu

202530

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354045

alametglnmetpheasnmetaspargvalasnvalglugluphetyr

505560

gluvaltyrlysglyvalvalthrglutyrhisaspmetvalthrglu

65707580

mettyrserglyprocysvalalametgluileglnglnasnasnala

859095

thrlysthrphearggluphecysglyproalaaspprogluileala

100105110

arghisleuargproglythrleuargalailepheglylysthrlys

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<400>56

atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgc60

tgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatc120

cgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtc180

gaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaa240

atgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgttt300

cgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctg360

cgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaa420

gacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga468

<210>57

<211>155

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的人类nme7-b3序列

<400>57

metproserserglyglycysglyproalaasnthralalysphethr

151015

asncysthrcyscysilevallysprohisalavalsergluglyleu

202530

leuglylysileleumetalaileargaspalaglyphegluileser

354045

alametglnmetpheasnmetaspargvalasnvalglugluphetyr

505560

gluvaltyrlysglyvalvalthrglutyrhisaspmetvalthrglu

65707580

mettyrserglyprocysvalalametgluileglnglnasnasnala

859095

thrlysthrphearggluphecysglyproalaaspprogluileala

100105110

arghisleuargproglythrleuargalailepheglylysthrlys

115120125

ileglnasnalavalhiscysthraspleuprogluaspglyleuleu

130135140

gluvalglntyrphephelysileleuaspasn

145150155

<210>58

<211>861

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的编码人类nme7-ab序列的dna

<400>58

atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatc60

gaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgt120

aaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgatt180

caattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgc240

gaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaa300

tccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactca360

ttcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccg420

gcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtca480

gaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggcc540

atgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggc600

gtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatg660

gaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccg720

gaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatc780

cagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatacttt840

ttcaaaattctggataattga861

<210>59

<211>286

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的人类nme7-ab序列

<400>59

metglulysthrleualaleuilelysproaspalaileserlysala

151015

glygluileilegluileileasnlysalaglyphethrilethrlys

202530

leulysmetmetmetleuserarglysglualaleuaspphehisval

354045

asphisglnserargprophepheasngluleuileglnpheilethr

505560

thrglyproileilealametgluileleuargaspaspalailecys

65707580

glutrplysargleuleuglyproalaasnserglyvalalaargthr

859095

aspalasergluserileargalaleupheglythraspglyilearg

100105110

asnalaalahisglyproaspserphealaseralaalaargglumet

115120125

gluleuphepheproserserglyglycysglyproalaasnthrala

130135140

lysphethrasncysthrcyscysilevallysprohisalavalser

145150155160

gluglyleuleuglylysileleumetalaileargaspalaglyphe

165170175

gluileseralametglnmetpheasnmetaspargvalasnvalglu

180185190

gluphetyrgluvaltyrlysglyvalvalthrglutyrhisaspmet

195200205

valthrglumettyrserglyprocysvalalametgluileglngln

210215220

asnasnalathrlysthrphearggluphecysglyproalaasppro

225230235240

gluilealaarghisleuargproglythrleuargalailephegly

245250255

lysthrlysileglnasnalavalhiscysthraspleuprogluasp

260265270

glyleuleugluvalglntyrphephelysileleuaspasn

275280285

<210>60

<211>846

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的编码人类nme7-ab1序列的dna

<400>60

atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatc60

gaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgt120

aaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgatt180

caattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgc240

gaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaa300

tccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactca360

ttcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccg420

gcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtca480

gaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggcc540

atgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggc600

gtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatg660

gaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccg720

gaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatc780

cagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatacttt840

ttctga846

<210>61

<211>281

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的人类nme7-ab1序列

<400>61

metglulysthrleualaleuilelysproaspalaileserlysala

151015

glygluileilegluileileasnlysalaglyphethrilethrlys

202530

leulysmetmetmetleuserarglysglualaleuaspphehisval

354045

asphisglnserargprophepheasngluleuileglnpheilethr

505560

thrglyproileilealametgluileleuargaspaspalailecys

65707580

glutrplysargleuleuglyproalaasnserglyvalalaargthr

859095

aspalasergluserileargalaleupheglythraspglyilearg

100105110

asnalaalahisglyproaspserphealaseralaalaargglumet

115120125

gluleuphepheproserserglyglycysglyproalaasnthrala

130135140

lysphethrasncysthrcyscysilevallysprohisalavalser

145150155160

gluglyleuleuglylysileleumetalaileargaspalaglyphe

165170175

gluileseralametglnmetpheasnmetaspargvalasnvalglu

180185190

gluphetyrgluvaltyrlysglyvalvalthrglutyrhisaspmet

195200205

valthrglumettyrserglyprocysvalalametgluileglngln

210215220

asnasnalathrlysthrphearggluphecysglyproalaasppro

225230235240

gluilealaarghisleuargproglythrleuargalailephegly

245250255

lysthrlysileglnasnalavalhiscysthraspleuprogluasp

260265270

glyleuleugluvalglntyrphephe

275280

<210>62

<211>570

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>编码小鼠nme6的dna

<400>62

atgacctccatcttgcgaagtccccaagctcttcagctcacactagccctgatcaagcct60

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ttcctcattgtacgaacgagggaactgcagtggaagctggaggactgccggaggttttac180

cgagagcatgaagggcgttttttctatcagcggctggtggagttcatgacaagtgggcca240

atccgagcctatatccttgcccacaaagatgccatccaactttggaggacactgatggga300

cccaccagagtatttcgagcacgctatatagccccagattcaattcgtggaagtttgggc360

ctcactgacacccgaaatactacccatggctcagactccgtggtttccgccagcagagag420

attgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaggaaccccag480

ctgcggtgtggtcctgtgcactacagtccagaggaaggtatccactgtgcagctgaaaca540

ggaggccacaaacaacctaacaaaacctag570

<210>63

<211>189

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>小鼠nme6

<400>63

metthrserileleuargserproglnalaleuglnleuthrleuala

151015

leuilelysproaspalavalalahisproleuileleuglualaval

202530

hisglnglnileleuserasnlyspheleuilevalargthrargglu

354045

leuglntrplysleugluaspcysargargphetyrarggluhisglu

505560

glyargphephetyrglnargleuvalgluphemetthrserglypro

65707580

ileargalatyrileleualahislysaspalaileglnleutrparg

859095

thrleumetglyprothrargvalpheargalaargtyrilealapro

100105110

aspserileargglyserleuglyleuthraspthrargasnthrthr

115120125

hisglyseraspservalvalseralaserarggluilealaalaphe

130135140

pheproaspphesergluglnargtrptyrglugluglugluprogln

145150155160

leuargcysglyprovalhistyrserproglugluglyilehiscys

165170175

alaalagluthrglyglyhislysglnproasnlysthr

180185

<210>64

<211>585

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>编码人类nme6的dna

<400>64

atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccag60

ctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgtt120

catcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggaga180

aaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctg240

gtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatc300

cagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggcccca360

gattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggac420

tctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgc480

tggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagaggga540

ggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga585

<210>65

<211>194

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>人类nme6

<400>65

metthrglnasnleuglyserglumetalaserileleuargserpro

151015

glnalaleuglnleuthrleualaleuilelysproaspalavalala

202530

hisproleuileleuglualavalhisglnglnileleuserasnlys

354045

pheleuilevalargmetarggluleuleutrparglysgluaspcys

505560

glnargphetyrarggluhisgluglyargphephetyrglnargleu

65707580

valgluphemetalaserglyproileargalatyrileleualahis

859095

lysaspalaileglnleutrpargthrleumetglyprothrargval

100105110

pheargalaarghisvalalaproaspserileargglyserphegly

115120125

leuthraspthrargasnthrthrhisglyseraspservalvalser

130135140

alaserarggluilealaalaphepheproaspphesergluglnarg

145150155160

trptyrglugluglugluproglnleuargcysglyprovalcystyr

165170175

serprogluglyglyvalhistyrvalalaglythrglyglyleugly

180185190

proala

<210>66

<211>525

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>编码人类nme61的dna

<400>66

atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccag60

ctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgtt120

catcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggaga180

aaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctg240

gtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatc300

cagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggcccca360

gattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggac420

tctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgc480

tggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga525

<210>67

<211>174

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>人类nme61

<400>67

metthrglnasnleuglyserglumetalaserileleuargserpro

151015

glnalaleuglnleuthrleualaleuilelysproaspalavalala

202530

hisproleuileleuglualavalhisglnglnileleuserasnlys

354045

pheleuilevalargmetarggluleuleutrparglysgluaspcys

505560

glnargphetyrarggluhisgluglyargphephetyrglnargleu

65707580

valgluphemetalaserglyproileargalatyrileleualahis

859095

lysaspalaileglnleutrpargthrleumetglyprothrargval

100105110

pheargalaarghisvalalaproaspserileargglyserphegly

115120125

leuthraspthrargasnthrthrhisglyseraspservalvalser

130135140

alaserarggluilealaalaphepheproaspphesergluglnarg

145150155160

trptyrglugluglugluproglnleuargcysglyproval

165170

<210>68

<211>468

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>编码人类nme62的dna

<400>68

atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggct60

gttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtgg120

agaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagagg180

ctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgcc240

atccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggcc300

ccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcg360

gactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacag420

cgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga468

<210>69

<211>155

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>人类nme62

<400>69

metleuthrleualaleuilelysproaspalavalalahisproleu

151015

ileleuglualavalhisglnglnileleuserasnlyspheleuile

202530

valargmetarggluleuleutrparglysgluaspcysglnargphe

354045

tyrarggluhisgluglyargphephetyrglnargleuvalgluphe

505560

metalaserglyproileargalatyrileleualahislysaspala

65707580

ileglnleutrpargthrleumetglyprothrargvalpheargala

859095

arghisvalalaproaspserileargglyserpheglyleuthrasp

100105110

thrargasnthrthrhisglyseraspservalvalseralaserarg

115120125

gluilealaalaphepheproaspphesergluglnargtrptyrglu

130135140

gluglugluproglnleuargcysglyproval

145150155

<210>70

<211>528

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>编码人类nme63的dna

<400>70

atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggct60

gttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtgg120

agaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagagg180

ctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgcc240

atccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggcc300

ccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcg360

gactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacag420

cgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagag480

ggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga528

<210>71

<211>175

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>人类nme63

<400>71

metleuthrleualaleuilelysproaspalavalalahisproleu

151015

ileleuglualavalhisglnglnileleuserasnlyspheleuile

202530

valargmetarggluleuleutrparglysgluaspcysglnargphe

354045

tyrarggluhisgluglyargphephetyrglnargleuvalgluphe

505560

metalaserglyproileargalatyrileleualahislysaspala

65707580

ileglnleutrpargthrleumetglyprothrargvalpheargala

859095

arghisvalalaproaspserileargglyserpheglyleuthrasp

100105110

thrargasnthrthrhisglyseraspservalvalseralaserarg

115120125

gluilealaalaphepheproaspphesergluglnargtrptyrglu

130135140

gluglugluproglnleuargcysglyprovalcystyrserproglu

145150155160

glyglyvalhistyrvalalaglythrglyglyleuglyproala

165170175

<210>72

<211>585

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的编码人类nme6序列的dna

<400>72

atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaa60

ctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtc120

caccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgt180

aaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctg240

gttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgatt300

cagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccg360

gactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgac420

tctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgt480

tggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggt540

ggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga585

<210>73

<211>194

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的人类nme6序列

<400>73

metthrglnasnleuglyserglumetalaserileleuargserpro

151015

glnalaleuglnleuthrleualaleuilelysproaspalavalala

202530

hisproleuileleuglualavalhisglnglnileleuserasnlys

354045

pheleuilevalargmetarggluleuleutrparglysgluaspcys

505560

glnargphetyrarggluhisgluglyargphephetyrglnargleu

65707580

valgluphemetalaserglyproileargalatyrileleualahis

859095

lysaspalaileglnleutrpargthrleumetglyprothrargval

100105110

pheargalaarghisvalalaproaspserileargglyserphegly

115120125

leuthraspthrargasnthrthrhisglyseraspservalvalser

130135140

alaserarggluilealaalaphepheproaspphesergluglnarg

145150155160

trptyrglugluglugluproglnleuargcysglyprovalcystyr

165170175

serprogluglyglyvalhistyrvalalaglythrglyglyleugly

180185190

proala

<210>74

<211>525

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的编码人类nme61序列的dna

<400>74

atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaa60

ctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtc120

caccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgt180

aaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctg240

gttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgatt300

cagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccg360

gactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgac420

tctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgt480

tggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga525

<210>75

<211>174

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的人类nme61序列

<400>75

metthrglnasnleuglyserglumetalaserileleuargserpro

151015

glnalaleuglnleuthrleualaleuilelysproaspalavalala

202530

hisproleuileleuglualavalhisglnglnileleuserasnlys

354045

pheleuilevalargmetarggluleuleutrparglysgluaspcys

505560

glnargphetyrarggluhisgluglyargphephetyrglnargleu

65707580

valgluphemetalaserglyproileargalatyrileleualahis

859095

lysaspalaileglnleutrpargthrleumetglyprothrargval

100105110

pheargalaarghisvalalaproaspserileargglyserphegly

115120125

leuthraspthrargasnthrthrhisglyseraspservalvalser

130135140

alaserarggluilealaalaphepheproaspphesergluglnarg

145150155160

trptyrglugluglugluproglnleuargcysglyproval

165170

<210>76

<211>468

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的编码人类nme62序列的dna

<400>76

atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcg60

gtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtgg120

cgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgc180

ctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcg240

attcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggca300

ccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagc360

gactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacag420

cgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga468

<210>77

<211>155

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的人类nme62序列

<400>77

metleuthrleualaleuilelysproaspalavalalahisproleu

151015

ileleuglualavalhisglnglnileleuserasnlyspheleuile

202530

valargmetarggluleuleutrparglysgluaspcysglnargphe

354045

tyrarggluhisgluglyargphephetyrglnargleuvalgluphe

505560

metalaserglyproileargalatyrileleualahislysaspala

65707580

ileglnleutrpargthrleumetglyprothrargvalpheargala

859095

arghisvalalaproaspserileargglyserpheglyleuthrasp

100105110

thrargasnthrthrhisglyseraspservalvalseralaserarg

115120125

gluilealaalaphepheproaspphesergluglnargtrptyrglu

130135140

gluglugluproglnleuargcysglyproval

145150155

<210>78

<211>528

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的编码人类nme63序列的dna

<400>78

atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcg60

gtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtgg120

cgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgc180

ctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcg240

attcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggca300

ccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagc360

gactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacag420

cgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaa480

ggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga528

<210>79

<211>175

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>针对大肠杆菌表达优化的人类nme63序列

<400>79

metleuthrleualaleuilelysproaspalavalalahisproleu

151015

ileleuglualavalhisglnglnileleuserasnlyspheleuile

202530

valargmetarggluleuleutrparglysgluaspcysglnargphe

354045

tyrarggluhisgluglyargphephetyrglnargleuvalgluphe

505560

metalaserglyproileargalatyrileleualahislysaspala

65707580

ileglnleutrpargthrleumetglyprothrargvalpheargala

859095

arghisvalalaproaspserileargglyserpheglyleuthrasp

100105110

thrargasnthrthrhisglyseraspservalvalseralaserarg

115120125

gluilealaalaphepheproaspphesergluglnargtrptyrglu

130135140

gluglugluproglnleuargcysglyprovalcystyrserproglu

145150155160

glyglyvalhistyrvalalaglythrglyglyleuglyproala

165170175

<210>80

<211>1306

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>编码origene-nme7-1全长的dna

<400>80

gacgttgtatacgactcctatagggcggccgggaattcgtcgactggatccggtaccgag60

gagatctgccgccgcgatcgccatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtg120

gtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatgg180

atctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatga240

taacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttctctcgacaact300

ggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaa360

aacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataat420

aaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagc480

attggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttat540

tacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaa600

aagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattag660

agccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttc720

tgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacac780

tgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggact840

gttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagat900

gttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgac960

cgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattca1020

acagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgc1080

ccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgc1140

tgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagat1200

cttggataatacgcgtacgcggccgctcgagcagaaactcatctcagaagaggatctggc1260

agcaaatgatatcctggattacaaggatgacgacgataaggtttaa1306

<210>81

<211>407

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>origene-nme7-1全长

<400>81

metasnhissergluargphevalpheilealaglutrptyrasppro

151015

asnalaserleuleuargargtyrgluleuleuphetyrproglyasp

202530

glyservalglumethisaspvallysasnhisargthrpheleulys

354045

argthrlystyraspasnleuhisleugluaspleupheileglyasn

505560

lysvalasnvalpheserargglnleuvalleuileasptyrglyasp

65707580

glntyrthralaargglnleuglyserarglysglulysthrleuala

859095

leuilelysproaspalaileserlysalaglygluileilegluile

100105110

ileasnlysalaglyphethrilethrlysleulysmetmetmetleu

115120125

serarglysglualaleuaspphehisvalasphisglnserargpro

130135140

phepheasngluleuileglnpheilethrthrglyproileileala

145150155160

metgluileleuargaspaspalailecysglutrplysargleuleu

165170175

glyproalaasnserglyvalalaargthraspalasergluserile

180185190

argalaleupheglythraspglyileargasnalaalahisglypro

195200205

aspserphealaseralaalaargglumetgluleuphepheproser

210215220

serglyglycysglyproalaasnthralalysphethrasncysthr

225230235240

cyscysilevallysprohisalavalsergluglyleuleuglylys

245250255

ileleumetalaileargaspalaglyphegluileseralametgln

260265270

metpheasnmetaspargvalasnvalglugluphetyrgluvaltyr

275280285

lysglyvalvalthrglutyrhisaspmetvalthrglumettyrser

290295300

glyprocysvalalametgluileglnglnasnasnalathrlysthr

305310315320

phearggluphecysglyproalaaspprogluilealaarghisleu

325330335

argproglythrleuargalailepheglylysthrlysileglnasn

340345350

alavalhiscysthraspleuprogluaspglyleuleugluvalgln

355360365

tyrphephelysileleuaspasnthrargthrargargleuglugln

370375380

lysleuileserglugluaspleualaalaasnaspileleuasptyr

385390395400

lysaspaspaspasplysval

405

<210>82

<211>376

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>亚诺法（abnova）nme7-1全长

<400>82

metasnhissergluargphevalpheilealaglutrptyrasppro

151015

asnalaserleuleuargargtyrgluleuleuphetyrproglyasp

202530

glyservalglumethisaspvallysasnhisargthrpheleulys

354045

argthrlystyraspasnleuhisleugluaspleupheileglyasn

505560

lysvalasnvalpheserargglnleuvalleuileasptyrglyasp

65707580

glntyrthralaargglnleuglyserarglysglulysthrleuala

859095

leuilelysproaspalaileserlysalaglygluileilegluile

100105110

ileasnlysalaglyphethrilethrlysleulysmetmetmetleu

115120125

serarglysglualaleuaspphehisvalasphisglnserargpro

130135140

phepheasngluleuileglnpheilethrthrglyproileileala

145150155160

metgluileleuargaspaspalailecysglutrplysargleuleu

165170175

glyproalaasnserglyvalalaargthraspalasergluserile

180185190

argalaleupheglythraspglyileargasnalaalahisglypro

195200205

aspserphealaseralaalaargglumetgluleuphepheproser

210215220

serglyglycysglyproalaasnthralalysphethrasncysthr

225230235240

cyscysilevallysprohisalavalsergluglyleuleuglylys

245250255

ileleumetalaileargaspalaglyphegluileseralametgln

260265270

metpheasnmetaspargvalasnvalglugluphetyrgluvaltyr

275280285

lysglyvalvalthrglutyrhisaspmetvalthrglumettyrser

290295300

glyprocysvalalametgluileglnglnasnasnalathrlysthr

305310315320

phearggluphecysglyproalaaspprogluilealaarghisleu

325330335

argproglythrleuargalailepheglylysthrlysileglnasn

340345350

alavalhiscysthraspleuprogluaspglyleuleugluvalgln

355360365

tyrphephelysileleuaspasn

370375

<210>83

<211>98

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>亚诺法（abnova）部分nme7-b

<400>83

aspargvalasnvalglugluphetyrgluvaltyrlysglyvalval

151015

thrglutyrhisaspmetvalthrglumettyrserglyprocysval

202530

alametgluileglnglnasnasnalathrlysthrphearggluphe

354045

cysglyproalaaspprogluilealaarghisleuargproglythr

505560

leuargalailepheglylysthrlysileglnasnalavalhiscys

65707580

thraspleuprogluaspglyleuleugluvalglntyrphephelys

859095

ileleu

<210>84

<211>27

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>编码组氨酸标签的dna

<400>84

ctcgagcaccaccaccaccaccactga27

<210>85

<211>36

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>编码链霉亲和素ii标签的dna

<400>85

accggttggagccatcctcagttcgaaaagtaatga36

<210>86

<211>32

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>86

atcgatcatatggccaactgtgagcgtacctt32

<210>87

<211>31

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>87

gtggtgctcgagttcatagatccagttctga31

<210>88

<211>30

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>88

gcaggaacattatacatggcggtgattctg30

<210>89

<211>30

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>89

gccatgtataatgttcctgccaacttgtat30

<210>90

<211>29

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>90

tcggggagaccaactctgcagactccaag29

<210>91

<211>29

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>91

cttggagtctgcagagttggtctccccga29

<210>92

<211>33

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>92

atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc33

<210>93

<211>33

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>93

gtggtgaccggtatagatccagttctgagcaca33

<210>94

<211>33

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>94

atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc33

<210>95

<211>33

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>95

gtggtgaccggtgatccagttctgagcacagct33

<210>96

<211>33

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>96

atcgatcatatggccaactgtgagcgtaccttc33

<210>97

<211>35

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>97

gtggtgaccggtagcacagctcgtgtaatctacca35

<210>98

<211>51

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>组氨酸标记的muc1*胞外结构域肽

<400>98

glythrileasnvalhisaspvalgluthrglnpheasnglntyrlys

151015

thrglualaalaserargtyrasnleuthrileseraspvalserval

202530

seraspvalprophepropheseralaglnserglyalahishishis

354045

hishishis

50

<210>99

<211>38

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>99

agagcctcgagattatccagaattttgaaaaagtattg38

<210>100

<211>30

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>100

atcgatcatatgcatgacgttaaaaatcac30

<210>101

<211>38

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>101

agagcctcgagattatccagaattttgaaaaagtattg38

<210>102

<211>42

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>102

atcgacatatggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatg42

<210>103

<211>43

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>103

actgcctcgaggaaaaacagttccatttcacgagctgccgatg43

<210>104

<211>42

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>104

atcgacatatggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatg42

<210>105

<211>38

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>105

agagcctcgagattatccagaattttgaaaaagtattg38

<210>106

<211>42

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>106

atcgacatatggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatg42

<210>107

<211>38

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>107

agagcaccggtattatccagaattttgaaaaagtattg38

<210>108

<211>35

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>108

atcgacatatgacgcaaaatctgggctcggaaatg35

<210>109

<211>34

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>109

actgcctcgagtgccggacccagaccacccgtgc34

<210>110

<211>35

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>110

atcgacatatgacgcaaaatctgggctcggaaatg35

<210>111

<211>35

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>111

actgcaccggttgccggacccagaccacccgtgcg35

<210>112

<211>41

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>psmgfrn-10肽

<400>112

glnpheasnglntyrlysthrglualaalaserargtyrasnleuthr

151015

ileseraspvalservalseraspvalprophepropheseralagln

202530

serglyalahishishishishishis

3540

<210>113

<211>376

<212>prt

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>nme7的结构域

<400>113

metasnhissergluargphevalpheilealaglutrptyrasppro

151015

asnalaserleuleuargargtyrgluleuleuphetyrproglyasp

202530

glyservalglumethisaspvallysasnhisargthrpheleulys

354045

argthrlystyraspasnleuhisleugluaspleupheileglyasn

505560

lysvalasnvalpheserargglnleuvalleuileasptyrglyasp

65707580

glntyrthralaargglnleuglyserarglysglulysthrleuala

859095

leuilelysproaspalaileserlysalaglygluileilegluile

100105110

ileasnlysalaglyphethrilethrlysleulysmetmetmetleu

115120125

serarglysglualaleuaspphehisvalasphisglnserargpro

130135140

phepheasngluleuileglnpheilethrthrglyproileileala

145150155160

metgluileleuargaspaspalailecysglutrplysargleuleu

165170175

glyproalaasnserglyvalalaargthraspalasergluserile

180185190

argalaleupheglythraspglyileargasnalaalahisglypro

195200205

aspserphealaseralaalaargglumetgluleuphepheproser

210215220

serglyglycysglyproalaasnthralalysphethrasncysthr

225230235240

cyscysilevallysprohisalavalsergluglyleuleuglylys

245250255

ileleumetalaileargaspalaglyphegluileseralametgln

260265270

metpheasnmetaspargvalasnvalglugluphetyrgluvaltyr

275280285

lysglyvalvalthrglutyrhisaspmetvalthrglumettyrser

290295300

glyprocysvalalametgluileglnglnasnasnalathrlysthr

305310315320

phearggluphecysglyproalaaspprogluilealaarghisleu

325330335

argproglythrleuargalailepheglylysthrlysileglnasn

340345350

alavalhiscysthraspleuprogluaspglyleuleugluvalgln

355360365

tyrphephelysileleuaspasn

370375

<210>114

<211>35

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>114

atcgacatatgacgcaaaatctgggctcggaaatg35

<210>115

<211>34

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>115

actgcctcgagtgccggacccagaccacccgtgc34

<210>116

<211>27

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>引物

<400>116

atcgatcatatgaatcactccgaacgc27