本发明涉及生物技术领域，具体为一种大规模生产胎儿干细胞分泌素的方法。
背景技术：
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞(专能干细胞)。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”，干细胞即为起源细胞。干细胞是具有增殖和分化潜能的细胞，具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。简单来讲，它是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。干细胞通常呈圆形或，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞，研究指出干细胞分泌物中所含的外吐小体具有一定医疗用途如美国专利2011/0003008a1所揭示的。虽然间充质干细胞分泌素的市场潜力很大,但是其大量培养存在较大的困难，主要表现为干细胞在生长时所需要较大的表面积，且干细胞非常容易分化，因此我们提出了一种大规模生产胎儿干细胞分泌素的方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种大规模生产胎儿干细胞分泌素的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种大规模生产胎儿干细胞分泌素的方法，包括如下步骤：
1)、在生物反应器中通过培养液对干细胞进行培养，生物反应器的内部条件在37度及含有5％的二氧化碳气体，进行培养得到目标数量的干细胞；
2)、在生物反应器中将步骤1所得的干细胞以磷酸盐缓冲液进行清洗；然后向生物反应器中注入细胞培养液和磷酸盐缓冲液继续培养干细胞24小时；
3)、收集集步骤2生物反应器中的上清液，并将所述上清液超速离心得到蛋白质浓缩液；
4)、以纯水稀释步骤3中取出的蛋白浓缩液，并将所述的蛋白浓缩液以超纯水稀释，通过离心法提纯，得到的蛋白浓缩液中的蛋白即为干细胞分泌素。
优选的，所述步骤1中的培养液要用超纯水或者五蒸水，且水要现用现制，高糖作为基础培养液，葡萄糖的浓度为4.5g/l，有助于干细胞贴壁、增殖及干细胞集落形成，培养前要按照培养液和β-巯基乙醇或者单硫甘油10:1的比例添加β-巯基乙醇或者单硫甘油，β-巯基乙醇的浓度为0.1mmol/l，单硫甘油的浓度为0.15mmol/l，β-巯基乙醇或者单硫甘油能够保护细胞内酶和蛋白质中的巯基不被氧化，促进间充质干细胞的贴壁和克隆形成，在进行培养时，每过12个小时向着培养液的内部按照培养液和白血病抑制因子5:1的比例添加白血病抑制因子，白血病抑制因子能够避免干细胞的分化。
优选的，所述步骤2中对干细胞进行清洗时，磷酸盐缓冲液通过管道缓慢的通入生物反应器中，所述管道的侧壁与生物反应器内腔侧壁相贴合，管道的中液体的冲力使得生物反应器中的混合液旋转。
优选的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01m/l，ph值为7.3，所述磷酸盐缓冲液添加的比例为磷酸盐缓冲液与细胞培养液1:4-5。
优选的，所述干细胞为间充质干细胞，所制备的干细胞分泌素中金属蛋白酶1含量应不低于60ng/ml每100ml培养体系。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：该大规模生产胎儿干细胞分泌素的方法，本发明利用了生物反应器技术替代传统的细胞培养瓶去制作间充质干细胞分泌素,大幅缩减成本及所需空间；本发明添加了β-巯基乙醇或者单硫甘油能够保护细胞内酶和蛋白质中的巯基不被氧化，促进间充质干细胞的贴壁和克隆形成；本发明添加了白血病抑制因子，白血病抑制因子能够避免干细胞的分化。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种大规模生产胎儿干细胞分泌素的方法，包括如下步骤：
1)、在生物反应器中通过培养液对干细胞进行培养，生物反应器的内部条件在37度及含有5％的二氧化碳气体，进行培养得到目标数量的干细胞；所述步骤1中的培养液要用超纯水或者五蒸水，且水要现用现制，高糖作为基础培养液，葡萄糖的浓度为4.5g/l，有助于干细胞贴壁、增殖及干细胞集落形成，培养前要按照培养液和β-巯基乙醇或者单硫甘油10:1的比例添加β-巯基乙醇或者单硫甘油，β-巯基乙醇的浓度为0.1mmol/l，单硫甘油的浓度为0.15mmol/l，β-巯基乙醇或者单硫甘油能够保护细胞内酶和蛋白质中的巯基不被氧化，在进行培养时，每过12个小时向着培养液的内部按照培养液和白血病抑制因子5:1的比例添加白血病抑制因子，白血病抑制因子能够避免干细胞的分化，所述干细胞为间充质干细胞。
2)、在生物反应器中将步骤1所得的干细胞以磷酸盐缓冲液进行清洗；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01m/l，ph值为7.3，所述磷酸盐缓冲液添加的比例为磷酸盐缓冲液与细胞培养液1:4-5。然后向生物反应器中注入细胞培养液和磷酸盐缓冲液继续培养干细胞12小时；所述步骤2中对干细胞进行清洗时，磷酸盐缓冲液通过管道缓慢的通入生物反应器中，所述管道的侧壁与生物反应器内腔侧壁相贴合，管道的中液体的冲力使得生物反应器中的混合液旋转。
3)、在培养过程中连续检测金属蛋白酶1的蛋白浓度，其浓度应不低于60ng/ml。
4)、收集步骤2生物反应器中的上清液，并将所述上清液超速离心得到蛋白质浓缩液；
5)、以纯水稀释步骤3中取出的蛋白浓缩液，并将所述的蛋白浓缩液以超纯水稀释，通过离心法提纯，得到的蛋白浓缩液中的蛋白即为干细胞分泌素，所制备的干细胞分泌素中金属蛋白酶1含量应不低于60ng/ml每100ml培养体系。
实施例：培养4亿个间充质干细胞
首先生物反应器进行消毒杀菌，然后把培养液注入生物反应器中，向培养液中添加定量的β-巯基乙醇或者单硫甘油，再把4百万个间充质干细胞放置在培养液中，维持转速40到50rmp的条件下培养，并且加入适量白血病抑制因子，白血病抑制因子每隔12个小时加入一次，持续约8天，当胚胎干细胞的数目达标时，利用用磷酸盐缓冲液将胚胎干细胞及其附着的微载体清洗三次，然后向生物反应器中注入100ml培养液，继续培养，于12小时后收集生物反应器中的上清液，并将上清液超速离心得到蛋白质浓缩液，再以纯水稀释取出的蛋白浓缩液，并将蛋白浓缩液以超纯水稀释，通过离心法提纯，得到的蛋白浓缩液中的蛋白分装冻存于-80冰箱得到间充质干细胞分泌素成品。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。