一种微生物土壤活化菌剂及其制备方法与应用与流程

本发明涉及微生物应用领域，具体涉及一种微生物土壤活化菌剂及其制备方法与应用。

背景技术：

中国是农业大国，也是秸秆大国，据统计，我国每年秸秆产出量约为7-8亿吨，其中直接燃用和饲用约占六成，废弃和焚烧为两成，而用于直接还田的不足15％，可以看出，用于直接还田的秸秆占比还较小。而农作物秸秆作为农业生态链条中的重要一环，涉及到农业生产体系中物质转化和能量循环，以及土壤肥力和环境安全问题。在我国，每年产出秸秆中的氮磷钾含量约占当年化肥施用量的八成。大量秸秆被从农业生态体系中取出后，势必加剧土壤有机质的缺失，营养元素氮、磷、钾的流失和比例失调，致使土壤结构恶化、地力下降的问题凸显，制约着农业的可持续发展。

造成秸秆直接还田率低的主要原因有：一是人工和相应机械设备投入不足；二是秸秆全量还田的耕地在开始几年里相对于不还田的地块，易造成后茬作物死苗烂根、生长不良，产量不稳且有明显的下降，进而影响种植户的秸秆还田积极性；三是部分秸秆原位处理技术的不足，表现为采用微生物菌剂处理时，菌株适应性不强，以致秸秆腐解效果达不到要求。

提高耕地有益土壤微生物数量和活力，尤其是提升对短期难以降解的秸秆生物质和矿物质有促腐和分解作用的微生物数量和活力，是解决秸秆还田问题以及提升土壤肥力的关键环节和有效措施。作物秸秆中纤维素和半纤维素含量约35-40％，木质素6-12％，而木质素与半纤维素包裹着纤维素，限制了纤维素的降解。因此，如果要提高秸秆消化率，首先要实现对秸秆木质素的降解，破坏秸秆的刚性结构。木质素的分解需要多种酶的协同作用，其主要降解酶有3种：木质素过氧化物酶(lip)、锰过氧化物酶(mnp)和漆酶(lac)。构建筛选能分泌此类木质素降解酶的微生物菌株施用于作物秸秆，将有助于秸秆木质素的降解、进而有效促进秸秆中纤维素和半纤维的生物降解过程。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题在于秸秆原位还田时土壤消解慢、效率低。

本发明是采用以下技术方案解决上述技术问题的：

菌株说明：本发明所使用的白地霉ggc105(geotrichumcandidum)，保藏日期：2018年9月13日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号：cctccm2018618，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山；枯草芽孢杆菌gbs118(bacillussubtilis)，保藏日期：2018年9月13日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号：cctccm2018617，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。

本发明提供一种微生物土壤活化菌剂，由白地霉ggc105(geotrichumcandidum)和枯草芽孢杆菌gbs118(bacillussubtilis)组成，所述白地霉ggc105(geotrichumcandidum)的保藏编号为cctccm2018618，分离自合肥董铺岛小树林枯枝上，具漆酶酶活；所述枯草芽孢杆菌gbs118(bacillussubtilis)的保藏编号为cctccm2018617，分离自合肥董铺岛耕地土壤，具蛋白酶活和解磷解钾功能。

本发明还提供一种微生物土壤活化菌剂的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)将白地霉ggc105(geotrichumcandidum)和枯草芽孢杆菌gbs118(bacillussubtilis)分别单独培养，单独培养结束时白地霉活菌数达到(1～2.2)×10⁷cfu/ml，枯草芽孢杆菌活菌数达到(1～2.8)×10⁸cfu/ml；

(2)将上述白地霉ggc105(geotrichumcandidum)培养物和枯草芽孢杆菌gbs118(bacillussubtilis)培养物按体积比为(20-30):(70-80)进行混合，制得微生物土壤活化菌剂。

优选的，将白地霉ggc105(geotrichumcandidum)接种于pda培养基上制备斜面菌种后，接种于液体种子培养基进行二级种子培养。

优选的，所述液体种子培养基由2％葡萄糖，0.2％蛋白胨，0.3％酵母膏，0.5％硫酸铵、余量为水组成。

优选的，所述白地霉ggc105(geotrichumcandidum)在液体种子培养基中的培养温度为28-30℃，培养时间为48-96h。

优选的，将枯草芽孢杆菌gbs118(bacillussubtilis)接种于牛肉膏蛋白胨培养基上制备斜面菌种后后，接种于lb液体培养基进行二级种子培养。

优选的，接种于lb液体培养基中后的培养温度为30-33℃，培养时间为24-48h。

本发明还提供将上述微生物土壤活化菌剂在秸秆原位还田中的应用。

优选的，将微生物土壤活化菌剂均匀喷洒在秸秆表面后进行翻堆，将秸秆翻入土壤下，平整后播种后茬作物。

优选的，所述秸秆为玉米秸秆或小麦秸秆。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明制备的微生物土壤活化菌剂由白地霉ggc105(geotrichumcandidum)和枯草芽孢杆菌制成，两株菌具有互不拮抗、稳定持久、适应性强的特点；

(2)本发明制备的微生物土壤活化菌剂能强化秸秆腐解，兼具解磷、解钾的功能，有效活化土壤，增加有效磷、钾供给；

(3)本发明制备的微生物土壤活化菌剂，能快速适应土壤环境，改善土壤有益微生物数量，增加土壤对秸秆等短期难以利用生物质及矿物质的消纳及快速分解能力；

(4)本发明制备的微生物土壤活化菌剂能分泌漆酶、纤维素酶和半纤维素酶等降解酶系，有效促进秸秆纤维素、半纤维素以及木质素的降解以及其它有机质的腐殖化，能提高土壤肥力，改善土壤结构，具有土壤改良作用，减少化肥施用量。

附图说明

图1为白地霉(geotrichumcandidum)的分离培养；

图2为玉米秸秆喷施菌剂原位全量还田后对后茬小麦产量的影响；

白地霉(geotrichumcandidum)ggc105，保藏日期：2018年9月13日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号：cctccm2018618；枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)gbs118，保藏日期：2018年9月13日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号：cctccm2018617。

具体实施方式

为使对本发明的结构特征及所达成的功效有更进一步的了解与认识，用以较佳的实施例对本发明进行详细的说明。

实施例1

白地霉(geotrichumcandidum)ggc105的分离筛选

(1)采样：在树林中选取呈白色腐朽木材样品；

(2)分离：将步骤(1)中获得的样品加入无菌生理盐水中，震荡均匀，梯度稀释后涂布于gu-pda分离平板上；所述gu-pda分离平板培养基制作方法为先制作pda培养基，取去皮土豆200g，切成小块，加适量水煮沸30min后纱布过滤，滤液加入葡萄糖20g，kh2po43g，mgso41.5g，琼脂15-20g和微量维生素b1，加热溶解，定容至1000ml，调节ph至6.5。115℃灭菌30min后，冷却至60℃，加入过滤除菌的愈创木酚-乙醇溶液，使愈创木酚的终浓度为4mmol/l，倒平板；

(3)挑取菌落周围产生褐色变色圈的菌落，于分离平板上反复划线直至获得纯菌株，以pda斜面4℃冰箱保存；

(4)滤纸条培养基的配制：先配制无机盐溶液，每1000ml包含kh2po41g，mgso4·7h2o0.3g，cacl20.1g，nacl0.1g，fecl30.01g，nano32.5g，ph7.0，于直径1.5cm、长15cm试管中加入上述无机盐溶液5ml，加入一条6cm×1cm滤纸垂直立于试管中，并使一部分露出液面，加硅胶塞于121℃灭菌30min后备用；

(5)液体产酶培养基(g/l)的配制：酒石酸铵0.2，葡萄糖10，kh2po42，mgso4·7h2o1.5g，cacl20.1，10ml微量元素溶液，0.5ml维生素溶液，加入dms(2,2-丁二酸二甲酯)至终浓度为20mmol/l，ph4.5。

其中微量元素溶液(g/l)：氨基三乙酸1.5，mgso4·7h2o3.0，mnso40.5，nacl1.0，feso4·7h2o0.1，coso40.1，cacl20.082，znso40.1，cuso4·5h2o0.01，kal(so4)20.01，h3bo30.01，na2moo40.01；

其中维生素溶液(mg/l)：生物素2，叶酸2，盐酸硫胺素(维生素b1)5，核黄素(维生素b2)5，维生素b6盐酸盐10，维生素b120.1，烟酸5，dl-泛酸钙5，对氨基苯甲酸5，硫辛酸5；

(6)漆酶活性检测：配置含0.5mmol/labts(2,2,-连氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))的0.1mol/l乙酸缓冲液(ph5.0)：0.1mol/l乙酸溶液为1l溶液中含冰醋酸(17.5mol/l)5.72ml，0.1mol/l乙酸钠溶液为1l溶液中含8.2g乙酸钠，将乙酸钠溶液缓缓加入乙酸溶液中，不断搅拌，用ph及测定，直至ph为5.0，即为0.1mol/l乙酸缓冲液(ph5.0)，称取0.027gabts溶于100ml0.1mol/l乙酸缓冲液中；

(7)粗酶液的制备：接种斜面菌种到装有50ml液体产酶培养基的150ml三角瓶中，28℃,150rpm震荡培养5-10d，发酵液于5000rpm/min离心10min后取上清液即得粗酶液；

(8)酶活力测定：0.5mmol/labts的0.1mol/l乙酸缓冲液(ph5.0)2ml，加入粗酶液1ml后启动反应，测定在420nm处吸光度的变化，缓冲液和粗酶液都先预热至37℃，再混合反应，以1min内生成1μmol产物的量定义为1个酶活力单位。

按照上述分离筛选方法以及漆酶酶活测定方法，如图1所示，分离筛选到一株能分解纤维物质并具有漆酶活性的腐解真菌菌株，编号为白地霉(geotrichumcandidum)ggc105，其漆酶活性达到16-35μ/ml。

实施例2

微生物土壤活化菌剂的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)将分离获得的白地霉ggc105(geotrichumcandidum)接种于pda培养基上，28℃制备斜面菌种后，接种于液体种子培养基进行二级种子培养，液体种子培养基由2％葡萄糖，0.2％蛋白胨，0.3％酵母膏，0.5％硫酸铵、余量为水组成；于28℃培养48h，活菌数达到(1.0～1.5)×10⁷cfu/ml；

(2)将枯草芽孢杆菌gbs118(bacillussubtilis)接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，30℃培养制作斜面菌种，接种lb液体培养基进行二级种子培养，lb液体培养基组成为酵母膏0.5％，蛋白胨1.0％，nacl1.0％、余量为水，与30℃液体培养24h，活菌数达到(1.0～2.0)×10⁸cfu/ml；

(3)将上述白地霉ggc105(geotrichumcandidum)培养物和枯草芽孢杆菌gbs118(bacillussubtilis)培养物按体积比为20:80进行混合，制得微生物土壤活化菌剂。

实施例3

微生物土壤活化菌剂的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)将分离获得的白地霉ggc105(geotrichumcandidum)接种于pda培养基上，30℃制备斜面菌种后，接种于液体种子培养基进行二级种子培养，液体种子培养基由2％葡萄糖，0.2％蛋白胨，0.3％酵母膏，0.5％硫酸铵、余量为水组成；于30℃培养96h，活菌数达到(1.0～2.2)×10⁷cfu/ml；

(2)将枯草芽孢杆菌gbs118(bacillussubtilis)接种于牛肉膏蛋白胨培养基上，30℃培养制作斜面菌种，接种lb液体培养基进行二级种子培养，lb液体培养基组成为酵母膏0.5％，蛋白胨1.0％，nacl1.0％、余量为水，与33℃液体培养48h，活菌数达到(1.0～2.8)×10⁸cfu/ml；

(3)将上述白地霉ggc105(geotrichumcandidum)培养物和枯草芽孢杆菌gbs118(bacillussubtilis)培养物按体积比为30:70进行混合，制得微生物土壤活化菌剂。

实施例4

微生物土壤活化菌剂在实验室条件下对秸秆的腐解作用：

取小麦秸秆1kg(干重)，杆长10cm左右，置于带盖塑料盒中，调整含水率为40-50％，添加微生物土壤活化菌剂50ml后搅拌均匀；对照添加50ml水，不添加菌剂，带盖于28-30℃腐解培养，每天定时翻堆一次，根据颜色、气味、粗纤维含量判断腐解效果。

实验结果：培养一个月后，添加菌剂的秸秆呈深褐色，不成型，有腐泥，无异味，有少许醇香味，粗纤维含量8.5％；对照为灰褐色，部分不成型，霉腥味，粗纤维含量15.1％。添加活化菌剂的秸秆腐化度明显高于对照，说明所述的微生物土壤活化剂具有明显的秸秆促腐作用。

实施例5

微生物土壤活化菌剂在试验田间玉米秸秆上的应用：

还田时间选择在9月底10月初玉米收获时候，后茬作物为小麦；玉米秸秆以收获机和粉碎机粉碎至5-15cm长度；每块试验田地面积66m²，常规施肥；将微生物土壤活化菌剂均匀喷洒在田间新鲜秸秆表面，用量为新鲜秸秆重量的1-3％；随之翻耕，耕深大于23cm，碎秸秆翻埋在10cm土层以下，旋耕耙压2遍。

实验结果：如图2所示，小麦实收显示玉米秸秆全量还田情况下，喷施微生物土壤活化菌剂的小麦产量比不喷菌剂的产量提高约77％，有效缓解了秸秆原位全量还田条件下对后茬作物的减产不利影响。

实施例6

微生物土壤活化菌剂在试验田间小麦秸秆上的应用：

还田时间选择在6月初小麦收获时候，后茬作物为玉米；小麦秸秆以收获机和粉碎机粉碎至5-15cm长度；每块试验田地面积66m²，常规施肥；将复合微生物土壤活化菌剂均匀喷洒在田间新鲜秸秆表面，用量为新鲜秸秆重量的1-3％；随之翻耕，耕深大于23cm，碎秸秆翻埋在10cm土层以下，旋耕耙压2遍。

实验结果：如表1所示，玉米实收显示小麦秸秆全量还田情况下，喷施微生物土壤活化菌剂的玉米产量比不喷菌剂的产量提高约20％，有效缓解了秸秆原位全量还田条件下对后茬作物的减产不利影响。

表1小麦秸秆喷施菌剂原位全量还田后对后茬玉米产量的影响

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限于上述实施例，与本发明构思无差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。