一株分离的细菌菌株及其应用的制作方法

本发明涉及环境生物技术领域，尤其涉及一株n,n-二甲基甲酰胺降解菌株及其应用。

背景技术：

n,n-二甲基甲酰胺(dmf)是一种性能优良的“万能溶剂”，被广泛应用于工业、农业、医药等领域。dmf能够与水和多种有机溶剂混溶，具有良好的热稳定性，同时还是一种有害的挥发性有机化合物，可生化性较差，难于从环境中有效去除。

dmf一旦进入环境，将对水生生物和人类的健康具有重大威胁。研究表明，dmf和其降解产物对斑马鱼胚胎具有明显的致畸和致死作用。dmf可通过呼吸道、消化道和皮肤进入人体，影响细胞分化，造成染色体畸变，引起肝毒性、胃刺激和肾损伤，甚至具有一定的致癌性。在我国职业性接触毒物危害程度分级中将dmf列为二级中毒危害。

dmf的全球年产量在2001年就已经达到了285000公吨。近年来随着各项产业的蓬勃发展，其生产和使用量也随之迅速增长。我国是重要的制造和农业大国，在化工生产过程中会排放大量含有dmf的工业废水，若处理不及时或不彻底，将对环境和人类健康造成巨大危害。

生物降解法适用于大规模处理含dmf的废水，但有目前关降解菌株的报道尚不充分，仍有诸多问题亟待解决。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种能够实现高效降解的环境益生菌。

技术实现要素：

有鉴于现有技术中dmf降解菌株的菌属较为单一，菌株的降解速率较慢，在环境中施用的安全性尚不明确等缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种能够实现高效降解的环境益生菌。

为实现上述目的，本发明第一个方面是提供了一株分离的细菌菌株。

在一个较佳实施方式中，该菌株为甲基杆菌dm1(methylobacteriumsp.dm1)，于2018年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2018663。

进一步地，甲基杆菌dm1能分解n,n-二甲基甲酰胺。

进一步地，甲基杆菌dm1菌体呈短杆状，能运动，无芽孢；菌落呈粉色、圆形、边缘齿状、表面光滑、易挑起；在液体培养基中培养时易形成生物膜。

本发明的第二方面提供了一种上述分离的细菌菌株的培养方法。

在一个较佳的实施方式中，培养基为添加有n,n-二甲基甲酰胺的msm培养基，培养基的ph值为4.0-7.0，培养温度为25-42℃。

可选地，n,n-二甲基甲酰胺的浓度等于或低于6800mg/l。

可选地，n,n-二甲基甲酰胺的浓度为2000mg/l，培养基ph为7.0，培养温度为30℃。可选地，培养时间为24～36小时。

本发明的第三方面提供了上述分离的细菌菌株在废水处理中的应用。

在一个较佳的实施方式中，废水含有n,n-二甲基甲酰胺。可选地，废水中n,n-二甲基甲酰胺的含量等于或低于6800mg/l。

本发明的第四方面提供了上述分离的细菌菌株在环境修复中的应用。

在一个较佳的实施方式中，环境中含有n,n-二甲基甲酰胺。

本发明的第五个方面提供了生物催化剂。在一个较佳的实施方式中，其包括如上所述的分离的细菌菌株甲基杆菌dm1。

本发明的第六个方面提供了验证上述分离的细菌菌株对含n,n-二甲基甲酰胺废水的处理效果的方法。

在一个较佳的实施方式中，包括如下步骤：

1)斜面培养：将所述甲基杆菌dm1接种到含有dmf400～2000mg/l的固体斜面msm培养基上，25～37℃培养24～36小时；

2)种子培养：将步骤1)中斜面上长势良好的菌体，在无菌的环境中转接到msm液体培养基，所述msm液体培养基中含有400～2000mg/l的dmf，在25～37℃培养8～24小时，获得种子液；

3)模拟水体中dmf的去除：将步骤(2)中获得的种子液接种到msm液体培养基中，dmf初始浓度调为2000mg/l，ph为7，在30℃条件下振荡培养，反应时间为20～48小时，直至dmf被完全降解后终止反应；反应期间每2～8小时取样，用hplc检测dmf的降解情况。

进一步地，步骤3)中hplc检测的条件是：agilent1100高效液相色谱仪配备xdb-c18色谱柱，流动相为50mmnah2po4水溶液和0.5％乙腈(v/v)，流速为0.5ml/min，检测波长为210nm，柱温为30℃。

甲基杆菌dm1能利用dmf为唯一碳氮源进行生长，将其彻底矿化并释放出氨氮。其能耐受并完全降解水体中6800mg/l的dmf。在30℃，ph7.0的条件下可在28小时内实现2000mg/ldmf的彻底降解，降解速度达到71.4mg/l/h，是目前已报道菌株中最快的之一。

因此，该菌株具有很强的dmf代谢能力和dmf高浓度耐受能力，更容易定殖于土壤或水体，有利于将作物栽培和原位环境修复相结合，可解决在工业生产中dmf的残留超标及环境污染问题，在生物法处理含dmf废水和环境修复中具有重要价值和良好的应用前景。

以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个实施例的甲基杆菌dm116srrna序列的进化树分析。

图2是本发明的一个实施例的dmf初始浓度对甲基杆菌dm1生长影响的结果图。

图3是本发明的一个实施例的dmf初始浓度对甲基杆菌dm1降解dmf影响的结果图。

图4是本发明的一个实施例的初始ph对甲基杆菌dm1生长影响的结果图。

图5是本发明的一个实施例的初始ph对甲基杆菌dm1降解dmf影响的结果图。

图6是本发明的一个实施例的不同培养温度对甲基杆菌dm1生长影响的结果图。

图7是本发明的一个实施例的不同培养温度对甲基杆菌dm1降解dmf影响的结果图。

图8是本发明的一个实施例中最适培养条件下甲基杆菌dm1的生长和对dmf的降解情况的结果图。

微生物保藏：

保藏日期：2018年10月10日；

保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；

保藏单位地址：中国武汉武汉大学，430072

保藏编号：cctccno:m2018663；

分类命名：甲基杆菌dm1(methylobacteriumsp.dm1)。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下列实施例中所用无机盐培养基(msm)配方为k2hpo45.2g/l，kh2po43.7g/l，mgso40.1g/l，na2so41.0g/l和0.05％(v/v)金属离子缓冲液；金属离子缓冲液配方为fecl2·4h2o0.3g/l,mncl2·4h2o0.02g/l,h3bo30.0124g/l,cucl2·2h2o0.0034g/l,cocl2·6h2o0.038g/l,zncl20.014g/l和na2moo4·2h2o0.04g/l，溶于0.1m的盐酸溶液中。平板分离时在上述msm培养基中加入1.5～2.0％(w/v)琼脂粉，优选加入1.5％琼脂粉。msm培养基在121℃条件下灭菌20分钟备用。

下列实施例中种子液的制备方法为：1)斜面培养：甲基杆菌dm1菌株接种到含有dmf400～2000mg/l的固体斜面无机盐(msm)培养基上，25～37℃培养24～36小时；2)种子培养：将步骤(2)中斜面上长势良好的菌体，在无菌的环境中转接到msm液体培养基，所述的液体培养基中含有400～2000mg/l的dmf，在25～37℃培养8～24小时，获得种子液。种子液od600为0.6～0.8。

下列实施例中，采用hplc法检测dmf的含量：hplc检测条件是：agilent1100高效液相色谱仪配备xdb-c18色谱柱，流动相为50mmnah2po4水溶液和0.5％乙腈(v/v)，流速为0.5ml/min，检测波长为210nm，柱温为30℃。用hplc定量检测dmf浓度，需要先配制不同浓度梯度的dmf标准品，测定相应浓度下的峰面积，绘制标准曲线。将所取样品稀释到合适浓度后，用hplc检测获得在210nm下的峰面积，再由标准曲线换算出其dmf浓度。

实施例1：甲基杆菌dm1的分离、鉴定及其dmf降解特性

1、菌株筛选和分离

(1)采集样品

土样采集地点：上海市老港垃圾填埋场。

(2)菌株分离

筛选模型为以dmf为唯一碳氮源和能源的选择性培养基进行连续传代培养和分离。

在50ml蒸馏水中溶解从不同深度采集的土样共10g，在涡旋振荡器上震荡5min，取5ml土壤溶液，添加到50ml无机盐(msm)培养基中，在30℃，200rpm培养2～3天。传代3～4次后将培养液稀释涂布在加入2000mg/ldmf的无机盐固体培养基上，30℃培养48h到72h。挑取单菌落到新鲜的msm液体培养基中，选取生长最快的菌株进行划线分离，重复多次直到获得纯化的单菌。

2、菌株鉴定

(1)dmf降解菌甲基杆菌dm1的菌体及菌落形态特征

甲基杆菌dm1菌体呈短杆状，能运动，无芽孢；菌落呈粉色，圆形，边缘齿状，表面光滑，易挑起；在液体培养基中培养时易形成生物膜。

(2)甲基杆菌dm1的生理生化特征

生理生化特征为：好氧，能够以dmf为唯一碳氮源进行生长，革兰氏染色阴性。

上述菌学特征与文献(常见细菌鉴定手册)编录的甲基杆菌的生理生化性状相吻合。该菌株经16srrna序列(seqidno.1)的系统发育研究，结果如图1，该菌株和甲基杆菌属亲缘关系最近。结合以上的生理生化的菌学特征和进化树分析，将其鉴定为甲基杆菌属，该菌株命名为甲基杆菌dm1。

另外，甲基杆菌dm1还具备利用甲醇、乙醇、有机胺类物质为能源进行生长的能力。

3、培养条件对甲基杆菌dm1生长和降解能力的影响

(1)dmf初始浓度的影响

将2.5ml种子液接种到50ml不同dmf初始浓度(400mg/l，2000mg/l，4000mg/l，6800mg/l)的msm培养基中，在30℃，200rpm培养。连续测定细胞的生长和dmf降解情况。

结果如图2和图3所示，菌株dm1在dmf浓度为400mg/l，2000mg/l，4000mg/l，6800mg/l时均能完全降解dmf，随着dmf浓度的升高，dmf对菌株dm1生长和降解的抑制作用越明显。虽然菌株dm1的生在在6800mg/l的dmf下被抑制，但是该菌还是能耐受并完全降解水体中6800mg/l的dmf。在dmf浓度为2000mg/l时生长最快。

(2)初始ph的影响

将2.5ml种子液接种到50ml含dmf(2000mg/l)初始浓度的msm培养基中，不同初始ph(4.0，6.0,7.0,8.0,10.0)用盐酸和氢氧化钠分别进行调整，在30℃，200rpm培养。连续测定细胞的生长和dmf降解情况。

结果如图4和图5所示，菌株在ph4.0～7.0时均能较快地降解dmf，当ph为8.0时菌株的降解受到一定的抑制，当ph为10.0时对dmf有十分微弱的降解。最佳的生长和降解ph为7.0。

(3)培养温度的影响

将2.5ml种子液接种到50ml含dmf(2000mg/l)初始浓度的msm培养基中，在200rpm，不同温度(25℃，30℃，37℃和42℃)进行培养。连续测定细胞的生长和dmf降解情况。

结果如图6和图7所示，菌株在42℃以下均能生长，并能较快地降解dmf。在42℃时菌株虽不能生长，但接种5％种子液，在200rpm，30℃振荡培养，也能在较短时间内完全降解dmf。最适生长和降解温度为30℃。

实施例2：甲基杆菌dm1降解dmf的中间代谢产物分析

将15ml种子液接种到1l(含dmf2000mg/l)的msm培养基中，在30℃，200rpm培养。待菌株生长进入平台期后期时，收集菌体，用pbs缓冲液重悬，将细胞的od600调整为5.0，进行休止细胞反应。加入dmf(500mg/l)作为底物进行休止细胞反应，在反应进行0h～7.5h分别取培养物10ml，收集离心(8000rpm，10min，4℃)后的上清液，进行衍生化反应，而后进行gc-ms分析。gc-ms可检测到中间代谢产物二甲胺、甲胺和氨。

整个生物催化过程的化学反应式如下所述：

样品衍生化方法：在10ml上清中加入0.5μl正己胺作为内标，加入400μl10mmnaoh，100μl苯磺酰氯(衍生剂)，密闭反应装置，用涡旋振荡仪振荡1分钟，在80℃烘箱中放置30min，再加入500μlnaoh，振荡1分钟，再次放入80℃反应30分钟。取出样品在冰上冷却15min，用hcl将溶液ph调为5.5，加入2.5ml二氯甲烷进行萃取。将有机相取出，用750μlnahco3溶液进行反萃。去除水相，在所得有机相中加入无水硫酸钠干燥。干燥后的样品作为待分析样品准备gc-ms进样。

gc-ms检测条件：气相色谱(agilent6850/5975c)进样口和检测器温度均为290℃，氦气流量1ml/min，柱前压力50kpa，升温过程为：初始温度120℃(保持3min)，以5℃/min的速率从120℃升温至220℃，再以10℃/min的速率从220℃升温至290℃(保持5min)。

实施例3：甲基杆菌dm1在环境修复中的模拟应用

工业废水环境通常较为恶劣，因此，为了模拟菌株在废水中dmf去除的应用，测试了该菌株的ph和温度适应范围(初始dmf浓度2000mg/l，200rpm振荡培养，实施例1)，结果如图2和3所示。菌株在ph4.0～7.0时均能较快地降解dmf，当ph为8.0时菌株的降解受到一定的抑制，当ph为10.0时对dmf有十分微弱的降解。菌株在温度25℃～42℃时，均能较快地降解dmf。在42℃时菌株虽不能生长，但接种5％种子液，在200rpm，30℃振荡培养，均能在较短时间内完全降解dmf。

为了模拟在环境修复中的应用，进行了如下实验：

1)斜面培养：将甲基杆菌dm1接种到含有dmf400～2000mg/l的固体斜面无机盐(msm)培养基上，25～37℃培养24～36小时；

2)种子培养：将步骤(1)中斜面上长势良好的菌体，在无菌的环境中转接到msm液体培养基，所述的液体培养基中含有400～2000mg/l的dmf，在25～37℃培养8～24小时，获得种子液；

3)模拟水体中dmf的去除：将步骤(2)中菌体细胞(od600为0.6～0.8)的2.5ml种子液接种到50mlmsm液体培养基中，对照组加无菌水2.5ml。dmf初始浓度调为约2000mg/l，ph调节在7.0左右，在30℃条件下，200rpm振荡培养，反应时间为20～48小时，当培养体系中dmf完全检测不到后，终止反应；反应期间每2～8小时取样，用hplc检测dmf的降解情况。

结果如图8所示，菌株dm1可在28小时内实现对2000mg/ldmf的完全降解，具有很好的降解率和降解速度，降解速度为71.4mg/l/h。

因此，作为一个优选的实施例，甲基杆菌dm1通过msm无机盐培养基，以2000mg/ldmf作为唯一碳氮源进行液体培养并实现对dmf的完全降解，优化的培养条件为：培养温度30℃，培养28h，初始ph为7。此时，对dmf的降解速度为71.4mg/l/h，是目前已报道菌株中最快的之一。并且，菌株dm1在此期间长势良好。以上结果说明该菌株具有较强的全细胞催化能力，可用于进行有效的环境修复。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110>上海交通大学

<120>一株分离的细菌菌株及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1448

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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gtagccgt1448