本发明涉及不育系的选育方法，具体涉及一种选育cry1c抗虫转基因水稻两系不育系的方法。
背景技术：
利用杂种优势是提高作物产量的一条重要途径，为了避免自交，选育不育系材料是生产杂交种最经济有效的一种途径。杂交种的成功与否很大因素在不育系的选育上，好的不育系可以使杂交种在产量和品质上有突出的表现。但普通光温敏核不育基因的水稻材料存在抗虫性能差等缺陷。
利用bt基因培育转基因抗虫水稻新品种是解决水稻螟虫危害的环保高效的重要方法。抗虫bt基因cry1c是显性基因，将cry1c基因导入到杂交水稻来抵抗螟虫危害能满足水稻高产、抗虫、无农药残留的生产要求。选育转基因的抗虫不育系，则既能达到提高杂交稻抗性目的，又可以减少未知的花粉扩散管理问题(不育系在制种阶段没有花粉产生)，尤其是选育转基因抗虫两系不育系是培育抗虫转基因的重要工作。
培育抗虫转基因两系不育系，与选育普通两系不育系有相似的环节，但也有特殊要求。转基因抗虫不育系一般来源于已有的非转基因不育系品种，选育的目标性状明确，选育的方向相对单一，所以要求选育周期短、效率高。而现有技术需要经历播种、育秧、插秧、挖兜、移兜的繁琐工序，对大田单株进行选择后，人工挖兜转移到冷水池低温处理系统，耗时长，一般需要5～8年才能达到原种繁殖，且人工用量大。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种选育cry1c抗虫转基因水稻两系不育系的方法，该方法解决了现有技术耗时长的问题，能够简化工序，使抗除草剂基因、抗虫基因和不育基因可以纯合稳定，完成两系新不育系的选育，达到提供生产用种的标准，提高了工作效率。
为了达到上述目的，本发明提供了一种选育cry1c抗虫转基因水稻两系不育系的方法，该方法包含：
(1)以携带光温敏核不育基因的非转bt基因(bacillusthuringiensis，苏云金芽胞杆菌)水稻材料为受体材料，以含有cry1c基因和抗除草剂bar基因的可育水稻材料为供体材料，将两者杂交得到f1代种子，种植f1代种子，以f1代为父本与亲本中的携带光温敏核不育基因的水稻材料回交，收获bc1f1回交世代杂交种子；
(2)将受体材料和bc1f1回交世代种植，通过对回交世代材料喷施草甘膦铵盐筛选携带cry1c基因的植株，阳性单株为携带cry1c基因的植株；
(3)取所述阳性单株的叶片，提取基因组dna，使用光温敏核不育基因的ssr分子标记引物进行育性基因的pcr检测，选择引物标记为杂合信号，且株叶形态接近受体材料的单株，至抽穗时，对比受体材料的生长情况，选取bc1f1中最接近受体材料的单株，与受体材料单株继续回交，收获bc2f1种子；
(4)重复步骤(2)～(3)，至获得bc3f1回交世代杂交种子，种植bc3f1回交世代，苗期同步骤(2)的草甘膦铵盐筛选和pcr检测，选择育性基因纯合的单株自交，收获农艺性状接近轮回亲本的自交种子，得到bc3f2种子；
(5)将bc3f2种子浸种、催芽、播种，苗期同步骤(2)的草甘膦铵盐筛选获得阳性单株，置于适温28～32℃条件下，进行水肥管理，群体单株农艺性状接近受体材料的农艺性状，当群体植株开始进入育性敏感期时，采用冷水鉴定温度为22.5～23.5℃的冷水进行低温处理，待冷水低温处理结束，在适温生长；
(6)抽穗时开始观察筛选：保留没有明显花粉产生的单株，并取其穗支梗进行花粉育性检测，并割兜留桩，适温环境待再生穗抽穗；
(7)在再生幼穗将进入育性敏感期时，采用繁殖温度为19～21℃的冷水进行低温处理，待冷水低温处理结束，再转移到适温无风环境生长，防止花粉飘散，待抽穗自交结实，收获bc3f3种子；
(8)将bc3f3种子，重复步骤(5)～(7)，收获bc3f4种子，作为原种保存，bc3f4种子的光温敏核不育基因已经纯合，育性起点温度稳定；
(9)种植bc3f4种子，进行原种繁殖，育成新的抗虫两系不育系水稻，该抗虫两系不育系水稻还具有抗除草剂性能。
优选地，在步骤(2)中，所述草甘膦铵盐为0.1％的草甘膦水剂。
优选地，在步骤(3)中，所述ssr分子标记引物，上游引物为：5-atggcctcgtcgagttctaa-3，下游引物为：5-cggtcagctgaatttctctgt-3。
优选地，在步骤(4)中，所述农艺性状包含：株高、生育期和分蘖数。
优选地，在步骤(5)中，所述bc3f2种子种植于128目穴盘中。
优选地，在步骤(5)中，所述育性敏感期指幼穗分化3～6期。
优选地，在步骤(5)中，所述冷水低温处理5～6天；所述适温为28～32℃。
优选地，在步骤(6)中，所述留桩为15cm。
优选地，在步骤(6)中，对于花药有花粉散出的单株直接拔除，对于没有花粉产生的单株，取其穗支梗进行花粉育性碘化钾染色镜检观察。
优选地，在步骤(7)中，所述冷水低温处理10天；待冷水低温处理结束，在28～32℃，无风条件下生长。
本发明的选育cry1c抗虫转基因水稻两系不育系的方法，解决了现有技术耗时长的问题，具有以下优点：
(1)本发明的方法在选育的早期世代利用草甘膦筛选和对光温敏核不育基因标记进行单株选择，进行连续回交，加速了遗传背景的稳定，避免了现有选育技术中的大田选择，节省了劳务和大田用地，将最耗时费力的育性筛选环节，进行了高通量化操作；
(2)本发明的方法利用直播、密植技术，采用穴盘进行单株播种、定植，免去了传统的播种、育秧、插秧、挖兜、移兜的繁琐工序，将现有技术体系的5～6个工序环节缩短为1～2个环节；
(3)本发明的方法在选育后期，待群体遗传背景一致，且光温敏核不育基因纯合后，采用穴盘直播技术，进行低温育性筛选、鉴定，控制了单株穗数，减少了镜检工作量，加快了不育基因的稳定；
(4)本发明的方法前期重点是进行遗传背景的快速稳定和纯合，为了提高效率，采用携带不育基因的杂合单株作为父本连续回交，现有技术一般从低世代开始选育不育株，不育系夏季本身不会产生花粉，需要额外进行低温处理，给回交工作带来了难度；
(5)本发明的方法可以在4年内完成两系新不育系的选育，使抗除草剂基因、抗虫基因和不育基因在4年内纯合稳定，达到提供生产用种的标准，现有育种技术一般需要5～8年才能达到原种繁殖，本发明的方法提高了工作效率。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
一种选育cry1c抗虫转基因水稻两系不育系的方法，该方法包含：
(1)以携带光温敏核不育基因的非转bt基因水稻材料为受体材料，以含有cry1c基因和抗除草剂bar基因的可育水稻材料为供体材料，将两者杂交得到f1代种子，种植f1代种子，以f1代为父本与亲本中的携带光温敏核不育基因的水稻材料回交，收获bc1f1回交世代杂交种子；
(2)将受体材料和bc1f1回交世代种植(在田间种植)，通过对回交世代材料喷施草甘膦铵盐筛选携带cry1c基因的植株，阳性单株为携带cry1c基因的植株(cry1c基因与抗除草剂bar基因紧密连锁)；
(3)取阳性单株的叶片，提取基因组dna，使用光温敏核不育基因的ssr分子标记引物进行育性基因的pcr检测，选择引物标记为杂合信号(即包含受体材料和供体材料的标记带型；杂合基因型的单株才有花粉，适于进行后续杂交)，且株叶形态接近受体材料的单株，至抽穗时，对比受体材料的生长情况，选取bc1f1中最接近受体材料的单株，与受体材料单株继续回交，收获bc2f1种子；
(4)重复步骤(2)～(3)，至获得bc3f1回交世代杂交种子，种植bc3f1回交世代，苗期同步骤(2)的草甘膦铵盐筛选和pcr检测，选择育性基因纯合的单株自交，收获农艺性状接近轮回亲本(受体材料)的自交种子，得到bc3f2种子；
(5)将bc3f2种子浸种、催芽、播种，苗期同步骤(2)的草甘膦铵盐筛选获得阳性单株，置于适温28～32℃条件下，进行水肥管理，群体单株农艺性状接近受体材料的农艺性状，当群体植株开始进入育性敏感期时，采用冷水鉴定温度为22.5～23.5℃的冷水进行低温处理，待冷水低温处理结束，在适温生长；
(6)抽穗时开始观察筛选：保留没有明显花粉产生的单株，并取其穗支梗进行花粉育性检测，并割兜留桩，适温环境待再生穗抽穗；
(7)在再生幼穗将进入育性敏感期时，采用繁殖温度为19～21℃(促进花粉产生，利于自交结实)的冷水进行低温处理，待冷水低温处理结束，再转移到适温无风环境生长，防止花粉飘散，待抽穗自交结实，收获bc3f3种子；
(8)将bc3f3种子，重复步骤(5)～(7)，收获bc3f4种子，作为原种保存，bc3f4种子的光温敏核不育基因已经纯合，育性起点温度稳定；
(9)种植bc3f4种子，进行原种繁殖，育成新的抗虫两系不育系水稻，该抗虫两系不育系水稻还具有抗除草剂性能。
进一步地，在步骤(2)中，草甘膦铵盐为0.1％的草甘膦水剂。
进一步地，在步骤(3)中，ssr分子标记引物，上游引物为：5-atggcctcgtcgagttctaa-3，下游引物为：5-cggtcagctgaatttctctgt-3。
进一步地，在步骤(4)中，农艺性状包含：株高、生育期和分蘖数。
进一步地，在步骤(5)中，bc3f2种子种植于128目穴盘中。
进一步地，在步骤(5)中，育性敏感期指幼穗分化3～6期。
进一步地，在步骤(5)中，冷水低温处理5～6天；适温为28～32℃。
进一步地，在步骤(6)中，留桩为15cm。
进一步地，在步骤(6)中，对于花药有花粉散出的单株直接拔除，对于没有花粉产生的单株，取其穗支梗进行花粉育性碘化钾染色镜检观察。
进一步地，在步骤(7)中，冷水低温处理10天；待冷水低温处理结束，在28～32℃，无风条件下生长，以防止花粉飘到其他穗子。
实施例1
一种选育cry1c抗虫转基因水稻两系不育系的方法，该方法包含：
(1)先以携带光温敏核不育基因的非转bt基因水稻材料为受体材料，以含有cry1c基因的可育水稻品种t1c-19为供体材料，将两者杂交得到f1代种子，大田种植f1代，以f1代为父本与亲本中的携带光温敏核不育基因的水稻材料回交，收获bc1f1回交世代杂交种子至少1000粒；
(2)将受体材料和bc1f1回交世代并排种植，由于t1c-19品种的cry1c基因是与抗除草剂bar基因紧密连锁的，可以通过对回交世代材料喷施草甘膦铵盐来鉴定是否携带了1c基因，用0.1％的草甘膦水剂喷施bc1f1单株，约3-7天后，阴性单株叶片开始黄化死亡，死亡单株约占群体总单株的50％；
(3)取bc1f1群体中抗除草剂的阳性单株叶片，提取基因组dna，使用光温敏核不育基因的ssr分子标记引物s2-24(上游引物核苷酸片段为：5-atggcctcgtcgagttctaa-3，下游引物核苷酸片段为：5-cggtcagctgaatttctctgt-3)进行育性基因的pcr检测，选择s2-24标记为杂合信号，且株叶形态接近受体材料的单株，至抽穗时，对比受体材料的生长情况，选取bc1f1中最接近受体材料的单株5-10株，与受体材料单株继续回交，收获bc2f1种子至少1000粒；
(4)重复步骤(2)～(3)，至获得bc3f1回交世代杂交种子，在海南冬季(11月初)播种bc3f1，苗期经过草甘膦筛选去除阴性单株后，得到约500个阳性单株栽插到大田，取叶片继续检测s2-24育性基因标记；选择育性基因纯合的单株(约占1/4，125株)，待第2年春季(3月)收获农艺性状接近轮回亲本的自交种子，得到bc3f2种子；
(5)3月底将bc3f2种子浸种、催芽后，播种在128目塑料穴盘中，待秧苗长到4叶期，再次进行草甘膦筛选，将存活单株置于适温28～32℃条件，进行水肥管理，此时群体单株农艺性状接近原始不育系材料；待生长至幼穗开始分化时，开启冷水池循环系统，将冷水温度设定在22.5～23.5℃的低温鉴定档，当群体植株开始进入育性敏感期(幼穗分化3-6期)时，将穴盘放入冷水池循环系统，并保证水面淹没幼穗生长点处。冷水低温连续处理5-6天后，将穴盘移出冷水池，重新放回适温生长，待抽穗；
(6)移出冷水池后，约3～5天，水稻植株开始抽穗，此时，开始观察筛选：对于花药有花粉散出的单株，直接拔除；对于没有花粉产生的单株，则取穗支梗进行花粉育性碘化钾染色镜检观察，有可染花粉的单株，直接拔除，无可染花粉的单株保留，并割兜留桩15厘米，适温环境待再生穗抽穗；
(7)割兜后约15～20天，在适温环境下，再生幼穗将进入育性敏感期，将留有割兜水稻植株的穴盘移入温度设定为19～21℃的低温繁殖冷水池系统，低温处理10天，再转移到适温无风环境，待抽穗自交结实，收获bc3f2单株上的种子，并混合，得到bc3f3；
(8)将bc3f3世代的种子，重复步骤(5)～(7)，收获bc3f4世代单株的种子，不再混合，作为原种保存，此时，经过2轮连续的低温筛选，大部分的f4世代单株的光温敏核不育基因已经纯合，育性起点温度不会发生大的变化；
(9)冬季在海南播种bc3f4的种子，选择无风的大田栽插成株行，进行原种繁殖，育成新的抗除草剂和螟虫的转基因两系不育系。
综上所述，本发明的选育cry1c抗虫转基因水稻两系不育系的方法能够简化工序，可以在4年内完成两系新不育系的选育，达到提供生产用种的标准，提高了工作效率。尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。