抑制、敲除和/或表达基因在提高丙酮酸代谢路径产物及提高单克隆抗体表达量中的应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及抑制、敲除和/或表达基因在提高丙酮酸代谢路径产物及提高单克隆抗体表达量中的应用。
背景技术：
：过去三十年中，生物制药市场已经成为全球医药市场的重要组成部分，其占全球医药销售额的40％左右，2012年，生物制药市场的营业额约为100-120亿美元/年，其主要来自于单克隆抗体和抗体片段的市场。特别是，单克隆抗体是生物医药企业最重要的产品之一，其中几种治疗性产品成为了重磅炸弹，例如，avastin(阿瓦斯汀，化学名为贝伐单抗(bevacizumab))、herceptin(赫赛汀，化学名为曲妥珠单抗(trastuzumab))、remicade(类克，化学名为英夫利昔单抗(infliximab))、rituxan(美罗华，化学名为利妥昔单抗(rituximab))、humira(修美乐，化学名为阿达木单抗(adalimumab))和erbitux(爱必妥，化学名为西妥昔单抗(cetuximab))。单克隆抗体，主要是免疫球蛋白g(igg)，截止到2012年，美国食品药品监督管理局(fda)批准了32种iggs上市。按照结构的不同，单克隆抗体可以分为5种免疫球蛋白：igg、igm、iga、ige和igd。如图1所示，免疫球蛋白g(igg)是由两个相同的分子量较小的轻链(lc)和两个相同的分子量较大的重链(hc)组成的对称单体，并通过二硫键组装完成。根据氨基酸序列变化大小，可以将igg分为可变区(variableregion,v区)和恒定区(constantregion，c区)，其中，可变区序列变化很大，而恒定区序列相对稳定。轻链(lightchain，lc)是由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成，约250个氨基酸残基，分子量大小约为25kd，可以分为kappa和lambda两个亚型。重链(heavychain，hc)是由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成，约500个氨基酸残基，分子量大小约为50kd，重链恒定区由ch1、ch2和ch3组成。fv片段由轻链可变区和重链可变区组成，是抗原结合的部位。fab片段由轻链和重链可变区以及重链恒定区的ch1组成。fc片段由重链恒定区的ch2和ch3组成，是与效应分子或者细胞相互作用的部位。人工合成srna(syntheticsmallregulatoryrna)是一段短小且非编码rna。它与核糖体竞争性结合靶mrna(靶信使rna)，从而阻止靶mrna进行后续翻译，进而达到抑制目标基因表达的目的。与传统的基因敲除技术相比，srna技术操作简单，便于实施，并且它允许同时筛选菌株中不同的靶基因，实现高通量研究，可以广泛应用于代谢工程和合成生物学。与哺乳细胞系统相比，大肠杆菌系统具有细胞生长快速、高抗剪切力、成本低廉等优点，成为生产igg抗体的潜在热门宿主，被广泛研究。基因表达系统直接影响大肠杆菌中外源基因的表达水平，因此增加大肠杆菌中全长igg抗体表达的研究主要集中在基因的转录和翻译水平上，如启动子的筛选、温度和诱导剂浓度的优化、共表达分子伴侣等，未见大肠杆菌自身碳源代谢对igg抗体表达影响的研究。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种抑制、敲除和/或表达基因在提高丙酮酸代谢路径产物及提高单克隆抗体表达量中的应用。本发明以e.colimg1655为出发菌株，首次提出大肠杆菌自身代谢途径可能影响全长igg抗体表达的新策略，阐明了大肠杆菌中丙酮酸代谢路径对igg表达的影响，同时引入了srna技术调控基因的表达，进而间接提高了igg抗体的产量，为将来的工业化生产提供理论依据。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了抑制基因、敲除基因和/或表达基因在提高丙酮酸代谢路径产物中的应用；所述抑制基因、敲除基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：i、具有基因ppsa和/或pta的核苷酸序列；ii、具有如i所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；iii、与如i所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与基因ppsa和/或pta表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；iv、如i、ii或iii所示序列的互补序列；所述表达基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：ⅴ、具有基因acs的核苷酸序列；ⅵ、具有如ⅴ所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；ⅶ、与如ⅴ所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与基因acs表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；ⅷ、如ⅴ、ⅵ或ⅶ所示序列的互补序列。本发明还提供了抑制基因、敲除基因和/或表达基因在提高单克隆抗体的表达量中的应用；所述抑制基因、敲除基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：i、具有基因ppsa和/或pta的核苷酸序列；ii、具有如i所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；iii、与如i所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与基因ppsa和/或pta表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；iv、如i、ii或iii所示序列的互补序列；所述表达基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：ⅴ、具有基因acs的核苷酸序列；ⅵ、具有如ⅴ所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；ⅶ、与如ⅴ所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与基因acs表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；ⅷ、如ⅴ、ⅵ或ⅶ所示序列的互补序列；所述单克隆抗体为igg。在本发明的一些具体实施方案中，所述抑制采用srnas。在本发明的一些具体实施方案中，所述srnas包括pr启动子、与所述基因序列互补的核苷酸序列、srna支架序列和转录终止子。本发明还提供了srnas接收盒，包括pr启动子(如seqidno.21所示)或bad启动子、与目的序列互补的核苷酸序列(如seqidno.22所示)、srna支架序列(如seqidno.23所示)和转录终止子(如seqidno.24所示)。在本发明的一些具体实施方案中，所述与目的序列互补的核苷酸序列的合成方法为：在所述目的序列的正向引物5’端加上粘性末端ttgc，在所述目的序列的反向引物5’端加上粘性末端gaaa，扩增，获得所述与目的序列互补的核苷酸序列。本发明还提供了表达模块，包括本发明所述的srnas接收盒和基因；所述基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：i、具有基因ppsa和/或pta的核苷酸序列；ii、具有如i所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；iii、与如i所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与基因ppsa和/或pta表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；iv、如i、ii或iii所示序列的互补序列；和/或所述基因具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：ⅴ、具有基因acs的核苷酸序列；ⅵ、具有如ⅴ所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；ⅶ、与如ⅴ所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与基因acs表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；ⅷ、如ⅴ、ⅵ或ⅶ所示序列的互补序列。本发明还提供了表达载体，包括本发明所述的表达模块。本发明还提供了菌株，包括本发明还提供了所述的表达载体。本发明还提供了所述的srnas接收盒、所述的表达模块、所述的表达载体和/或所述的菌株在提高单克隆抗体的表达量中的应用。本发明以e.colimg1655为出发菌株，首次提出大肠杆菌自身代谢途径可能影响全长igg抗体表达的新策略，阐明了大肠杆菌中丙酮酸代谢路径对igg表达的影响，同时引入了srna技术调控基因的表达，可以高效快速批量筛选出对单抗表达有影响的基因，操作简便，耗时短，成本低。碳源代谢的研究为大肠杆菌中igg抗体的工业化生产提供了新的策略和思路，发现了抑制ppsa或pta基因或者共表达acs基因均对igg的表达有促进作用，进而间接提高了igg抗体的产量，为将来的工业化生产提供理论依据。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示免疫球蛋白g(igg)的结构；图2(a)示丙酮酸代谢路径示意图；图2(b)示丙酮酸代谢路径的质粒示意图；图2(c)示丙酮酸代谢路径对igg表达的影响；图3示图2(c)中pps相对于野生型的生物统计学结果，其中，1.00-为野生型数据，2.00-为改造后数据；p＝0.010<0.05；图4示图2(c)中pta相对于野生型的生物统计学结果，其中，1.00-为野生型数据，2.00-为改造后数据；p＝0.012<0.05；图5示图2(c)中acs相对于野生型的生物统计学结果，其中，1.00-为野生型数据，2.00-为改造后数据；p＝0.029<0.05。具体实施方式本发明公开了一种抑制、敲除和/或表达基因在提高丙酮酸代谢路径产物及提高单克隆抗体表达量中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。所用的大肠杆菌菌株和质粒在所有实验中，大肠杆菌transt1用于基因克隆，大肠杆菌mg1655用于单抗表达。单抗基因连接到包含pbr322复制子的p2a4载体中。acs基因连接到包含p15a复制子和bad启动子的p3c5bad载体。单抗基因：p2a4空质粒载体的蛋白表达区域是由lacuv5启动子引导的，后面连接乳糖操纵子，之后有一段核糖体结合位点，之后的序列中包含ecori、xbai、ndei、spei和psti酶切位点。通过用ndei和spei酶切空质粒载体后连接上述体外合成的单抗基因；acs基因：p3c5bad空质粒载体的蛋白表达区域是由bad启动子引导的，后面连接操纵子，之后有一段核糖体结合位点，之后的序列中包含ecori、xbai、ndei、spei和psti酶切位点。通过用ndei和spei酶切空质粒载体后连接上述体外合成的acs基因。名词及术语解释e.coli：大肠杆菌单克隆抗体：简称单抗srna(s)：是原核生物中短的非编码rna，其可以在转录后水平上精确控制靶基因的反式表达。美国fda：食品药品监督管理局igg：免疫球蛋白g轻链(lc)：单克隆抗体的轻链区域，由vl和cl构成重链(hc)：单克隆抗体的重链区域，由vh，ch1,ch2和ch3区域构成pcr：聚合酶链式反应pbs：磷酸缓冲盐溶液hepes：4-羟乙基哌嗪乙磺酸lb培养基：5g/l酵母提取物；10g/l蛋白胨；10g/l氯化钠mrna：信使rna，是由dna的模板链转录而来，携带遗传信息并能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸tir：translationinitiationregion，翻译起始区域转录：指遗传信息从基因(dna)转移到rna，在rna聚合酶的作用下形成一条与dna模板链序列互补的mrna的过程翻译：指根据遗传密码的中心法则，将成熟的mrna中核苷酸序列解码，并生产对应的特定氨基酸序列的过程本发明提供的抑制、敲除和/或表达基因在提高丙酮酸代谢路径产物及提高单克隆抗体表达量中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1基因的体外合成和扩增单抗的轻链和重链氨基酸序列(来源于人源)从ncbi数据库获得，在jcat网站中对序列进行了优化，并在优化的序列中避免了xbai，ndei，spei和hindiii限制性酶切位点。轻链(如seqidno.18所示)和重链(如seqidno.19所示)基因均在体外合成。acs基因(如seqidno.20所示)使用引物acs-f和acs-r通过pcr从大肠杆菌mg1655基因组dna中扩增获得。所用的大肠杆菌菌株和质粒在所有实验中，大肠杆菌transt1用于基因克隆，大肠杆菌mg1655用于单抗表达。单抗基因连接到包含pbr322复制子的p2a4载体中。acs基因连接到包含p15a复制子和bad启动子的p3c5bad载体。单抗基因：p2a4空质粒载体的蛋白表达区域是由lacuv5启动子引导的，后面连接乳糖操纵子，之后有一段核糖体结合位点，序列中包含ecori、xbai、ndei、spei和psti等一系列酶切位点；其中，启动子和操纵子位于ecori和xbai酶切位点之间，核糖体结合位点位于xbai和ndei酶切位点之间。首先通过用ndei和spei酶切将轻链(lc)和重链(hc)的基因分别连接入p2a4质粒空载体上；然后将含有重链(hc)的p2a4，通过xbai和psti酶切，连接到含有轻链(lc)的p2a4质粒载体上，从而将轻链(lc)和重链(hc)基因连接到同一个p2a4质粒上。在这个质粒上，轻链和重链前面均有一段核糖体结合位点，轻链在前，重链在后，并且通用一个lacuv5启动子进行诱导表达。acs基因：p3c5bad空质粒载体的蛋白表达区域是由bad启动子引导的，后面连接操纵子，之后有一段核糖体结合位点，序列中包含ecori、xbai、ndei、spei和psti等一系列酶切位点；其中，启动子和操纵子位于ecori和xbai酶切位点之间，核糖体结合位点位于xbai和ndei酶切位点之间。通过用ndei和spei酶切将acs基因分别连接入p3c5bad质粒空载体上，形成p3c5bad-acs，如图2(b)所示。srna的设计和组装设计一对20-30nt寡核苷酸，在正向引物5’端加上粘性末端ttgc，在反向引物5’端加上粘性末端gaaa。例如，如果序列是accgactaatgcatactttgtcat(如seqidno.1所示)，那么这两个引物是：a.正向引物(如seqidno.2所示):5’-ttgcaccgactaatgcatactttgtcat-3’b.反向引物(如seqidno.3所示):5’-gaaaatgacaaagtatgcattagtcggt-3’pcr反应如下：a.将一对寡核苷酸重悬于水中，使其浓度为100μmb.将5μl正向引物、5μl反向引物和90μl30mmhepes(ph＝7.8)混合c.放入pcr仪中，95℃5min，然后以0.1℃/秒的速度降至4℃即可获得srna序列。srna接收体连接到含有p15a复制子的p3c5载体中。srna接收体含有pr启动子、srna支架序列和转录终止子。使用goldengate方法将srna序列连接到srna接收体上。p3c5空质粒载体序列中包含ecori、xbai、ndei、spei和psti等一系列酶切位点。通过用xbai和spei酶切将srna接收体连接到p3c5质粒空载体上。注：goldengate方法中srna接收体质粒指含有srna接收体的p3c5质粒。goldengate反应混合液：srna接收体质粒——1μl(100ng)srna序列——0.5μl(上述pcr的产物稀释十倍)t4ligasebuffer——2μlt4ligase——1μlbsai——1μl水——14.5μlgoldengatepcr程序：1.37℃10min，然后16℃10min，步骤1循环10次；2.50℃5min；3.65℃20min；4.降温至4℃。本实验所用引物见表1。表1实施例2摇瓶发酵将单个大肠杆菌细胞在lb液体培养基和适当的抗生素(100μg/ml氨苄青霉素和/或34μg/ml氯霉素)中培养，37℃和220rpm下过夜培养；将培养物以1:100比例转接入50ml新鲜lb培养基(250ml摇瓶)中，并在37℃下生长。当600nm处的光密度(od600)达到约0.6时，培养箱温度降至25℃，平衡温度20分钟。加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)，使其终浓度为1mm。当共表达acs时，在加入iptg诱导的同时加入终浓度为1mm的l-阿拉伯糖，细胞在25℃下生长16小时。实施例3单克隆抗体的纯化将发酵后的培养物，6500rpm和4℃收集并离心。细胞用0.01mpbs(ph＝7.2-7.4)洗涤。用pbs重悬细胞并进行超声破碎处理，5s脉冲，10s间歇，总工作时间为20分钟。然后，将细胞裂解物在10,000rpm和4℃下离心30分钟，收集上清液。然后使用0.45μm滤膜进行过滤。在本实验中，抗体纯化磁珠试剂盒用于纯化单克隆抗体。1.样品处理：取抗体含量约0.1-0.15mg的样品置于新的1.5mlep管中，加入抗体结合缓冲液至总体积为500μl(如样品体积大于500μl，则无需加入)，混合均匀。2.磁珠预处理：将抗体纯化磁珠涡旋震荡30s，使磁珠充分重悬；取100μl磁珠悬液置于另一新的1.5mlep管中.对磁珠悬液进行磁性分离(使磁珠被吸附在管壁至溶液澄清；该操作描述以下省略，弃上清液。从磁性分离器上取下ep管，管中磁珠可直接用于抗体分离)。3.抗体吸附：在步骤2预处理的磁珠管中加入步骤1处理的样品溶液，涡旋震荡均匀，在室温下(约25℃)置于翻转混合仪上，促使样品和磁珠充分接触并吸附，翻转约15min后进行磁性分离，移弃上清液。4.磁珠洗涤：向ep管中加入1ml抗体结合缓冲液，振荡重悬磁珠后进行磁性分离，移弃上清液；该操作重复两次。5.抗体洗脱：在上述完成磁珠洗涤的ep管中加入1ml抗体结合缓冲液，涡旋震荡迅速重悬，然后在室温下置于翻转混合仪上，翻转10min后进行磁性分离，收集上清液至新的ep管。6.抗体透析：因抗体洗脱缓冲液含有较高浓度的盐分，收集的抗体溶液不能直接用于sds-page检测，但可以用抗体洗脱缓冲液调零进行抗体浓度测定。抗体洗脱缓冲液呈偏酸性，用自行配制的中性低盐溶液立即对收集的抗体溶液进行透析处理，以降低抗体失活率，获得较高活性和稳定性的抗体溶液。所述自行配制的中性低盐溶液为0.01mpbs溶液：氯化钠137mmol/l；氯化钾2.7mmol/l；磷酸氢二钠10mmol/l；磷酸二氢钾2mmol/l。实施例4elsia(酶联免疫吸附剂测定)1.稀释样品(此步骤选做)。2.每孔加入100μlassaybuffer，分别将10μl样品或不同浓度标准品加入相应孔中，轻轻摇板进行简单混合，用封板膜封住反应孔，室温下(18-25度)孵化30min。3.揭掉封板膜，吸弃孔内液体。用300μl稀释的washbuffer洗涤3次，在干净的纸上拍干。4.每孔加入100μl准备好的hrpconjugate。5..用新的封板膜密封。室温孵化30min。6..重复步骤3。7.每孔加入100μltmbsubstratesolution。8.黑暗条件下室温孵化10分钟(不封膜)。9.加入100μlstopsolution停止反应。轻轻摇板进行简单混合，孔内颜色由蓝变黄。10.以空白孔调零，30min内使用酶标仪在450nm测定每孔的吸光度。效果例丙酮酸代谢路径对大肠杆菌中igg抗体表达的影响基因表达系统直接影响大肠杆菌外源基因的表达水平。因此，增加大肠杆菌中igg表达的研究集中于修饰igg表达的直接相关部分以获得更高水平的转录或翻译。然而，缺乏对碳源代谢途径对大肠杆菌中igg表达的影响的研究。在本文中，我们研究了丙酮酸代谢途径对igg抗体表达的影响。如图2a所示为大肠杆菌的丙酮酸代谢路径示意图。其中，pyka为丙酮酸激酶(pyruvatekinaseii)；ppsa为磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(phosphoenolpyruvatesynthase)；ldha为nad依赖的发酵性d-乳酸脱氢酶(fermentatived-lactatedehydrogenase,nad-dependent)；pflb为甲酸c-乙酰转移酶(formatec-acetyltransferase1)；poxb为丙酮酸脱氢酶(pyruvatedehydrogenase)；acka为乙酸激酶a和丙酸激酶2(acetatekinaseaandpropionatekinate)；pta为磷酸乙酰转移酶(phosphateacetyltransferase)；acs为乙酰辅酶a合成酶(acetyl-coasynthetase)。ppsa、ldha、pta、pflb、acka和poxb基因表示使用合成srna技术抑制该基因；acs基因表示过表达该基因。本实验采用srnas来抑制丙酮酸代谢相关基因的表达，以ppsa和pta基因为例，如图2b质粒示意图所示。srna包括一个启动子，与靶基因mrna的翻译起始区域(从atg开始的20-30个核苷酸)互补的核苷酸序列，srna支架结构核苷酸序列和转录终止子。其中，spps和spta均采用pr启动子表达；spps和spta分别指抑制ppsa和pta基因表达的srna，它们分别含有ppsa和pta基因mrna翻译起始区域互补的核苷酸序列。同时，acs基因用bad启动子表达。如图2c、表2所示是在大肠杆菌中共表达6种不同的srnas或acs所产生igg的elisa结果。实验结果证实丙酮酸代谢路径对igg抗体的表达有影响。当srna抑制ppsa基因或pta基因，或共表达acs基因时，igg产量可以提高。然而，当srna抑制其他副产物相关基因时，对igg的表达没有积极作用。大肠杆菌生产乙酸和将丙酮酸合成为pep均会导致碳源的浪费。当抑制ppsa或抑制pta或过表达acs时，可以使更多的碳源转化为乙酰-coa。它们的最终目标是让更多的乙酰-coa进入tca循环，从而为igg表达提供更多的能量(蛋白质表达是一种耗能过程)。ppsa和pta也有可能在大肠杆菌中存在冗余。通过抑制它们，可以将更多物质转移到单克隆抗体表达，从而增加igg的产量。表2od450均值标准偏差wt0.2430.012pps0.3030.019ldha0.210.021pta0.320.028pflb0.2040.014acka0.1230.022poxb0.1480.015acs0.2930.023图3～图5示生物统计学结果，pps相对于野生型，p＝0.010<0.05；pta相对于野生型，p＝0.012<0.05；acs相对于野生型，p＝0.029<0.05。当srna抑制ppsa基因或pta基因，或共表达acs基因时，igg产量显著(p＜0.05)提高。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>天津大学；扬州奥锐特药业有限公司；扬州联澳生物医药有限公司<120>抑制、敲除和/或表达基因在提高丙酮酸代谢路径产物及提高单克隆抗体表达量中的应用<130>mp1819695<160>24<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1accgactaatgcatactttgtcat24<210>2<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ttgcaccgactaatgcatactttgtcat28<210>3<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3gaaaatgacaaagtatgcattagtcggt28<210>4<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ggaattccatatgagccaaattcacaaaca30<210>5<211>29<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ggactagtttacgatggcatcgcgatagc29<210>6<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ttgctgtgctataaacggcgagtttcat28<210>7<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gaaaatgaaactcgccgtttatagcaca28<210>8<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ttgctaacttttcattaagctcggacat28<210>9<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gaaaatgtccgagcttaatgaaaagtta28<210>10<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10ttgctgacgagccattgttggacat25<210>11<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11gaaaatgtccaacaatggctcgtca25<210>12<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12ttgcataagctgcaaccgtttgtttcat28<210>13<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13gaaaatgaaacaaacggttgcagcttat28<210>14<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14ttgcaaccagtactaacttactcgacat28<210>15<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15gaaaatgtcgagtaagttagtactggtt28<210>16<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16ttgcgatcagcataataatacgggacac28<210>17<211>28<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17gaaagtgtcccgtattattatgctgatc28<210>18<211>714<212>dna<213>轻链(lc)<400>18atgaaaaagaacatagcgtttcttcttgcatctatgttcgttttttctattgctacaaac60gcgtatgcagacatcctgctgacccagtctccggttatcctgtctgtttctccgggtgaa120cgtgtttctttctcttgccgtgcttctcagtctatcggtaccaacatccactggtaccag180cagcgtaccaacggttctccgcgtctgctgatcaaatacgcttctgaatctatctctggt240atcccgtctcgtttctctggttctggttctggtaccgacttcaccctgtctatcaactct300gttgaatctgaagacatcgctgactactactgccagcagaacaacaactggccgaccacc360ttcggtgctggtaccaaactggaactgaaacgtaccgttgctgctccgtctgttttcatc420ttcccgccgtctgacgaacagctgaaatctggtaccgcttctgttgtttgcctgctgaac480aacttctacccgcgtgaagctaaagttcagtggaaagttgacaacgctctgcagtctggt540aactctcaggaatctgttaccgaacaggactctaaagactctacctactctctgtcttct600accctgaccctgtctaaagctgactacgaaaaacacaaagtttacgcttgcgaagttacc660caccagggtctgtcttctccggttaccaaatctttcaaccgtggtgaatgctaa714<210>19<211>1412<212>dna<213>重链(hc)<400>19atgaaaaagaacatagcgtttcttcttgcatctatgttcgttttttctattgctacaaac60gcgtatgcacaggttcagctgaaacagtctggtccgggtctggttcagccgtctcagtct120ctgtctatcacctgcaccgtttctggtttctctctgaccaactacggtgttcactgggtt180cgtcagtctccgggtaaaggtctggaatggctgggtgttatctggtctggtggtaacacc240gactacaacaccccgttcacctctcgtctgtctatcaacaaagacaactctaaatctcag300gttttcttcaaaatgaactctctgcagtctaacgacaccgctatctactactgcgctcgt360gctctgacctactacgactacgaatttgcttactggggtcagggtactctcgttaccgta420agcgctgcttctaccaaaggtccgtctgttttcccgctggctccgtcttctaaatctacc480tctggtggtaccgctgctctgggttgcctggttaaagactacttcccggaaccggttacc540gtttcttggaactctggtgctctgacctctggtgttcacaccttcccggctgttctgcag600tcttctggtctgtactctctgtcttctgttgttaccgttccgtcttcttctctgggtacc660cagacctacatctgcaacgttaaccacaaaccgtctaacaccaaagttgacaaacgtgtt720gaaccgaaatctgacaaaacccacacctgcccgccgtgcccggctccggaactgctgggt780ggtccgtctgttttcctgttcccgccgaaaccgaaagacaccctgatgatctctcgtacc840ccggaagttacctgcgttgttgttgacgtttctcacgaagacccggaagttaaattcaac900tggtacgttgacggtgttgaagttcacaacgctaaaaccaaaccgcgtgaagaacagtac960aactctacctaccgtgttgtttctgttctgaccgttctgcaccaggactggctgaacggt1020aaagaatacaaatgcaaagtttctaacaaagctctgccggctccgatcgaaaaaaccatc1080tctaaagctaaaggtcagccgagggagccgcaggtatacaccctcccgccgtctcgtgac1140gaactgaccaaaaaccaggtttctctgacctgcctggttaaaggtttctacccgtctgac1200atcgctgttgaatgggaatctaacggtcagccggaaaacaactacaaaaccaccccgccg1260gttctggactctgacggttctttcttcctgtactctaaactgaccgttgacaaatctcgt1320tggcagcagggtaacgttttctcttgctctgttatgcacgaagctctgcacaaccactac1380acccagaaatctctgtctctgtctccgggtaa1412<210>20<211>1959<212>dna<213>acs<400>20atgagccaaattcacaaacacaccattcctgccaacatcgcagaccgttgcctgataaac60cctcagcagtacgaggcgatgtatcaacaatctattaacgtacctgataccttctggggc120gaacagggaaaaattcttgactggatcaaaccttaccagaaggtgaaaaacacctccttt180gcccccggtaatgtgtccattaaatggtacgaggacggcacgctgaatctggcggcaaac240tgccttgaccgccatctgcaagaaaacggcgatcgtaccgccatcatctgggaaggcgac300gacgccagccagagcaaacatatcagctataaagagctgcaccgcgacgtctgccgcttc360gccaataccctgctcgagctgggcattaaaaaaggtgatgtggtggcgatttatatgccg420atggtgccggaagccgcggttgcgatgctggcctgcgcccgcattggcgcggtgcattcg480gtgattttcggcggcttctcgccggaagccgttgccgggcgcattattgattccaactca540cgactggtgatcacttccgacgaaggtgtgcgtgccgggcgcagtattccgctgaagaaa600aacgttgatgacgcgctgaaaaacccgaacgtcaccagcgtagagcatgtggtggtactg660aagcgtactggcgggaaaattgactggcaggaagggcgcgacctgtggtggcacgacctg720gttgagcaagcgagcgatcagcaccaggcggaagagatgaacgccgaagatccgctgttt780attctctacacctccggttctaccggtaagccaaaaggtgtgctgcatactaccggcggt840tatctggtgtacgcggcgctgacctttaaatatgtctttgattatcatccgggtgatatc900tactggtgcaccgccgatgtgggctgggtgaccggac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