一种快速检测皮肤保湿能力基因的方法与流程

本发明为一种快速检测皮肤保湿能力基因的方法，涉及分子生物学领域，尤其针对美肤行业肤质评测。
背景技术：
：目前，常用的基因检测方法为测序法、基因芯片法、飞行质谱法，这些方法都需要在完成pcr扩增后进行后续实验分析，实验周期相对较长，适用于中、高通量的snp检测。使用支持高分辨率熔解曲线分析技术(highresolutionmelting，hrm)的仪器仅需要一次pcr扩增后即可根据扩增产物直接进行分析报告得出样品的基因型，极大的缩短了实验时长。hrm是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，实现了真正的闭管操作。hrm无需使用序列特异性探针，而是利用一种饱和染料对pcr反应产物进行分析。基本原理：双链核苷酸(doublestranddna，dsdna)的热稳定性受其长度和碱基组成的影响，序列变化会导致升温过程中dsdna解链行为的改变。因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到dsdna上，因此利用实时pcr技术，通过实时检测dsdna熔解过程中荧光信号值的变化，就能以生成不同形状熔解曲线的方式将pcr产物中存在的差异直观地展示出来。同时，借助于专业性的分析软件就可以对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类。皮肤是人体的保护组织，皮肤表皮的角质层是肌肤防止水分蒸发流失的限制性屏障，正常角质层含水量保持在10％-20％之间，使皮肤柔软，不发生干燥、皲裂现象，皮肤组织细胞的水分减少，会导致细胞皱缩、老化、出现细小皱纹等。水通道蛋白(aquaporin，aqps)又名水孔蛋白，是一种位于细胞膜上的蛋白质(内在膜蛋白)，在细胞膜上组成“孔道”，可控制水在细胞的进出，就像是“细胞的水泵”一样。在上世纪90年代被发现的一类能快速转运水的膜整合蛋白，这是一个特异性跨膜转运水的蛋白家族，能显著增加细胞膜水通透性，参与水的分泌、吸收及细胞内外水的平衡，在机体水平衡和内稳态的维持中发挥重要作用。中间丝相关蛋白(filaggrin，flg)基因编码中间丝相关蛋白，主要的蛋白成分为角蛋白和中间丝相关蛋白，大约占到80％-90％。中间丝相关蛋白在皮肤屏障功能中起重要作用，它将最外层皮肤细胞中的结构蛋白结合在一起，形成紧密的束状物，使细胞平坦化和强化，形成强大的屏障，在维持表皮屏障的通透性，调节皮肤正常ph值，防御微生物对皮肤的侵犯等都起重要作用。技术实现要素：为了加快检测速度、简化检测过程，本发明选用了高分辨率熔解曲线分析技术(highresolutionmelting，hrm)对与皮肤抗痘能力相关的基因突变位点进行基因型分析。为实现这一检测我们提供了一系列用于hrm试验的特异性扩增引物及对应的标准对照品。本发明涉及检测两个基因中的两个snp位点，提供待检测位点的检测用特异性引物及其使用lightcycler480highresolutionmeltingmaster试剂盒特异性扩增dna片段的反应体系和条件(详见表1)。本发明采用hrm技术分析待检测样本的各snp位点基因型。为辅助分析待检测样品的基因型，本发明还将提供各snp位点对应标准基因型模板(含野生型、突变杂合型及突变型)。表1.检测用引物及其条件本发明通过以下技术方案实现(以其中某一特定位点：rs17553719为例)：1)设计扩增含rs17553719在内的特定基因片段的1组引物；2)将样品总dna的浓度调至20ng/μl、制备一组含三种不同基因型的标准品；3)使用1)的引物和2)的模板及标准品，使用hrm试剂盒并根据试剂盒说明对目的基因片段的扩增；4)使用lightcycler480software软件对试验数据进行基因分型分析，确定样品的基因型。所述标准品的制备：a.通过pcr扩增筛选得到野生型及突变型基因(若突变型基因不易筛选可进行化学合成法)；b.将筛选所得的基因(野生型及突变型)连接到克隆常用质粒中，将连接后质粒进行转化扩增，最后回收连接成功的质粒(并将相应菌落进行菌种保存)；c.将连接有两种基因型的质粒进行定量稀释处理，同时取两种不同质粒1∶1混合即可得到突变杂合型模板。将这三种质粒进行定量处理，并取其中一部分稀释为工作浓度在后续实验中作为标准品dna使用。所述试剂盒的反应体系及其反应条件：表2.pcr扩增反应体系序号试剂体积(μl)1①2×mastermix102②mgcl2(25mm)2.43primerp10.44primerp20.45③h2o4.8表3.pcr扩增反应条件所述检测结果解读：判断样品的基因型，其特质在于不同基因型的dsdna在解链时的温度有细微的差别，从而导致其熔解曲线在突变点位有不同的曲线形状。以添加的三种不同基因型标准品为参照即可得出样品的基因型。附图说明图1、2为三种不同基因型的标准品在突变位点的熔解曲线线型(被检测样品线型与其中某一条重合)。图3为实例中的检测结果。具体实施方式现结合实施例，进一步说明使用本发明的引物、标准品结合hrm试剂盒检测样品基因型的良好效果。本发明使用lightcycler480highresolutionmeltingmaster试剂盒及lightcycler480仪器进行试验，但并不限制使用其他公司的仪器及试剂盒。以下操作均已rs17553719位点的检测过程为例。某位客户在刮取口腔上皮细胞之后，实验员进行核酸提取，将提取出的基因组dna进行质量评估(检测其浓度及纯度)。根据所测得的浓度结果对样本进行稀释(稀释至工作浓度20ng/μl)。标准模板的制备(仅需在首次检测前制备，标准品可留样多次使用)：1)将筛选所得的基因(野生型及突变型)连接到克隆常用质粒中，将连接后质粒进行转化扩增，最后回收连接成功的质粒(并将相应菌落进行菌种保存)；2)将连接有两种基因型的质粒进行定量稀释处理，同时取两种不同质粒1∶1混合即可得到突变杂合型模板。将这三种质粒进行定量处理，并取其中一部分稀释为工作浓度在后续实验中作为标准品dna使用。1.反应溶液配制1)根据表2中提供的反应体系避光配制除模板dna外的公共体系(反应数量为样本数x+标准品数量3)，为避免多次移液操作造成损耗，应多配0.5个或数个反应的量；2)将公共体系按照每孔18μl分装置各孔；3)分装完毕，将板离心数秒钟；4)根据按规划每孔加入2μl对应编号的dna模板。2.上机检测1)根据表3提供的条件设定反应温度和时间；2)反应结束lightcycler480software软件参照标准品分析确定各样本的基因型，同时，扩增后的样本仍可进行测序分析以验证实验结果的真实性。当前第1页12