不同浓度二妙散对CIA大鼠关节中Tp53mRNA水平表达的试验方法与流程

本发明涉及医疗技术领域，特别涉及不同浓度二妙散对cia大鼠关节中tp53mrna水平表达的试验方法。

背景技术：

类风湿关节炎(ra)是以侵蚀性、对称性多关节炎为主要临床表现的慢性、系统性自身免疫性疾病。基本病理改变为滑膜炎、血管翳形成，并逐渐出现关节软骨和骨破坏，最终导致关节畸形和功能丧失。我国ra患病率为0.32％-0.36％，其中女性发病率是男性的1-3倍，是威胁人类健康的重大疾病之一，属who规定的现代难治病范畴。胶原诱导关节炎模型(collageninducedarthritiscia)是一种经典的类风湿关节炎动物模型，被广泛应用于评估可能的病因病理，也被用于评估新的治疗方法。目前对动物模型的研究以对关节滑膜炎症、骨及软骨破坏为主，对其他脏器的研究较少。

二妙散作为中医治疗类风湿关节炎的经典方剂，出自《丹溪心法》由苍术和黄柏等比配伍而成，黄柏苦寒清热，苍术苦温燥湿，为祛湿剂，具有清热燥湿之功效，为治阴分之湿热痿证的妙药。tp53肿瘤抑制基因调节机体生物过程的发生，如应激反应、细胞周期、增殖、侵袭、衰老、细胞凋亡和自噬，其编码蛋白(p53)主要通过诱导生长停滞、细胞凋亡、衰老和抑制血管生成，从而引起关节滑膜纤维化，导致炎症的发生。目前，二妙散治疗类风湿关节炎的药理机制还缺乏理论依据。

技术实现要素：

发明的目的在于提供不同浓度二妙散对cia大鼠关节中tp53mrna水平表达的试验方法，本发明建立cia大鼠模型，通过pcr检测引物特异性，建立标准曲线，qrt-pcr检测不同浓度二妙散灌胃大鼠后tp53mrna的表达水平，相比现有技术，本发明可以为研究cia大鼠tp53的作用机制提供试验基础，同时也为研究二妙散治疗类风湿关节炎的药理机制提供理论依据，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

不同浓度二妙散对cia大鼠关节中tp53mrna水平表达的试验方法，包括如下材料：wistar雌性大鼠、饲喂基础日粮+水、牛ii型胶原、甲氨蝶呤、二妙散用药组，试验步骤如下：

步骤一：试验动物及其组织的处理

选取72只42±2日龄健康状况良好、体重相近(170±10g)wistar雌性大鼠，根据每组间平均体重相近原则，随机分为6个试验组：i组，空白对照组(n＝12)：饲喂基础日粮+水；ii组，模型cia组(n＝12)：多点皮下注射牛ii型胶原；iii组，阳性对照组(n＝12)：造模成功后，甲氨蝶呤(mtx)按0.9mg/kg腹腔注射，1周1次；iv组，高浓度二妙散用药组(n＝12)：每天早上9：00，按4.5g/kg灌胃，持续3周；v组，中浓度二妙散用药组(n＝12)：每天早上9：00，按3.0g/kg灌胃，持续3周；vi组，低浓度二妙散用药组(n＝12)：每天早上9：00，按1.5g/kg灌胃，持续3周；

步骤二：总rna提取及cdna合成

取出-80℃保存的cia大鼠关节组织，按照rnaisoplus操作说明提取总rna，核酸蛋白测定仪nd-2000测定总rna浓度和纯度，rna浓度调至1.0μg·l^-1，-80℃保存，根据primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒操作说明，反转录；

步骤三：引物设计、合成和pcr检测

根据ncbigenbank公布的大鼠tp53cdna参考序列，使用primer5.0设计1对tp53特异性引物，送公司合成，使用前用灭菌超纯水溶解稀释至100pmol/μl，-20℃保存备用，使用15μlpcr反应体系：正反向引物(10μmol·l^-1)各0.6μl，cdna模板0.8μl，ddh2o5.5μl，2×m5hipertaqpcrmix(withgreendye)7.5μl；

步骤四：序列测定

按照peasy-t3cloningkit说明，将回收的tp53cdna片段连接至t3cloingvector，pcr仪中25℃恒温10min，使回收产物与t3cloingvector充分连接，连接产物导入感受态细胞，涂布到lb固体培养基，37℃过夜培养，蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，lb液体培养基培养12-16h，菌液交由公司测序；

步骤五：相对定量标准曲线的建立

将含tp53cdna模板按照2×稀释8个梯度，制备标准品，分别为：1.0×2⁰，1.0×2^-1，1.0×2^-2，1.0×2^-3，1.0×2^-4，1.0×2^-5，1.0×2^-6，1.0×2^-7，使用cfx96^tm实时pcr检测系统检测，ddh2o代替模板作为阴性对照，qrt-pcr反应体系为：tbgreenadvantageqpcrpremix10μl，正反向引物各0.5μl，cdna模板2.0μl，ddh2o7.0μl，总体积20μl，反应程序：95℃变性10sec，95℃5sec，60℃25sec，共45个循环；

步骤六：tp53mrna水平检测

qrt-pcr检测试验大鼠关节中tp53mrna相对表达量，根据tbgreenqpcrmastermix-tbgreenadvantage试剂盒建议的反应条件，构建反应体系同步骤五，每个样本重复3次，根据ct值，利用2^-δδct法计算试验大鼠关节中tp53mrna相对表达量；

步骤七：数据处理

使用spss24.0软件分析所有数据，统计分析基于anova，duncan法进行多重比较，图使用origin2017生成。

进一步地，步骤1的二妙散药物制备步骤包括：将苍术和黄柏按1∶1煎煮，生药量不低于0.5g/ml；并依据标准品苍术素，测定二妙散水煎剂的成分含量，稳定质控。

进一步地，步骤一中所有wistar大鼠日粮均为大小鼠商品饲料，自由采食、自由饮水，试验时间为28d，所有试验wistar雌性大鼠在预饲7d后进入正式试验期，正式试验为期21d。

进一步地，步骤一的试验结束后，麻醉、杀检、腹主动脉取血备用；采集6个不同试验组wistar雌性大鼠关节的相同部位，放入depc水处理过的离心管，迅速置于液氮中保存。

进一步地，步骤二的20μl反转录体系为：

步骤1：5×gdnaeraserbuffer2.0μl，gdnaeraser1.0μl，totalrna1.0μl，rnasefreeddh2o6.0μl，42℃2min；

步骤2：步骤1液体10μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer2(forrealtime)4.0μl，rnasefreeddh2o4.0μl，37℃15min，85℃5sec，反转录产物-20℃保存。

进一步地，步骤三的反应条件：94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，30个循环；72℃5min，产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

进一步地，步骤四的lb固体培养基含有amp，过夜12-16h。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提出的不同浓度二妙散对cia大鼠关节中tp53mrna水平表达的试验方法，建立cia大鼠模型，通过设计合成tp53特异性引物，pcr检测tp53引物特异性，qrt-pcr检测不同浓度二妙散灌胃大鼠后tp53mrna的表达水平，不同浓度二妙散对cia大鼠均有不同程度的抑制作用，最佳作用浓度为3.0g/kg，tp53在cia大鼠发病机制中起着重要的作用，相比现有技术，本发明可以为研究cia大鼠tp53的作用机制提供试验基础，同时也为研究二妙散治疗类风湿关节炎的药理机制提供理论依据。

附图说明

图1为本发明的cia大鼠tp53琼脂糖电泳检测结果图；

图2为本发明的tp53cdna序列blast比对结果图；

图3为本发明的tp53andβ-actin基因标准曲线、扩增动力学曲线及熔解曲线图；

图4为本发明的试验大鼠tp53mrna水平相对表达量、扩增动力学曲线和熔解曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

不同浓度二妙散对cia大鼠关节中tp53mrna水平表达的试验方法，包括如下材料：wistar雌性大鼠、饲喂基础日粮+水、牛ii型胶原、甲氨蝶呤、二妙散用药组。

一、二妙散药物制备

鉴定苍术和黄柏药材饮片：将苍术和黄柏按1∶1煎煮，生药量不低于0.5g/ml；并依据标准品苍术素，测定二妙散水煎剂的成分含量，稳定质控。

二、试验步骤如下：

步骤一：试验动物及其组织的处理

选取72只42±2日龄健康状况良好、体重相近(170±10g)wistar雌性大鼠，根据每组间平均体重相近原则，随机分为6个试验组：i组，空白对照组(n＝12)：饲喂基础日粮+水；ii组，模型cia组(n＝12)：多点皮下注射牛ii型胶原；iii组，阳性对照组(n＝12)：造模成功后，甲氨蝶呤(mtx)按0.9mg/kg腹腔注射，1周1次；iv组，高浓度二妙散用药组(n＝12)：每天早上9：00，按4.5g/kg灌胃，持续3周；v组，中浓度二妙散用药组(n＝12)：每天早上9：00，按3.0g/kg灌胃，持续3周；vi组，低浓度二妙散用药组(n＝12)：每天早上9：00，按1.5g/kg灌胃，持续3周；所有wistar大鼠日粮均为大小鼠商品饲料，自由采食、自由饮水。本试验时间为28d。所有试验wistar雌性大鼠在预饲7d后进入正式试验期，正式试验为期21d。试验结束后，麻醉、杀检、腹主动脉取血备用；采集6个不同试验组wistar雌性大鼠关节的相同部位，放入depc水处理过的离心管，迅速置于液氮中保存；

步骤二：总rna提取及cdna合成

取出-80℃保存的cia大鼠关节组织，按照rnaisoplus操作说明提取总rna，核酸蛋白测定仪nd-2000测定总rna浓度和纯度，rna浓度调至1.0μg·l^-1，-80℃保存，根据primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒操作说明，反转录；20μl反转录体系为：步骤1：5×gdnaeraserbuffer2.0μl，gdnaeraser1.0μl，totalrna1.0μl，rnasefreeddh2o6.0μl，42℃2min；步骤2：步骤1液体10μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer2(forrealtime)4.0μl，rnasefreeddh2o4.0μl，37℃15min，85℃5sec，反转录产物-20℃保存；

步骤三：引物设计、合成和pcr检测

根据ncbigenbank公布的大鼠tp53cdna参考序列，使用primer5.0设计1对tp53特异性引物，送公司合成，使用前用灭菌超纯水溶解稀释至100pmol/μl，-20℃保存备用，引物信息见表1。使用15μlpcr反应体系：正反向引物(10μmol·l^-1)各0.6μl，cdna模板0.8μl，ddh2o5.5μl，2×m5hipertaqpcrmix(withgreendye)7.5μl；反应条件：94℃3min，94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，30个循环；72℃5min，产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳检测；

表1本试验中所用引物序列

步骤四：序列测定

按照peasy-t3cloningkit说明，将回收的tp53cdna片段连接至t3cloingvector，pcr仪中25℃恒温10min，使回收产物与t3cloingvector充分连接，连接产物导入感受态细胞，涂布到lb固体培养基(含amp)，37℃过夜(12-16h)培养，蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，lb液体培养基(含amp)培养(12-16h)，菌液交由公司测序；

步骤五：相对定量标准曲线的建立

将含tp53cdna模板按照2×稀释8个梯度，制备标准品，分别为：1.0×2⁰，1.0×2^-1，1.0×2^-2，1.0×2^-3，1.0×2^-4，1.0×2^-5，1.0×2^-6，1.0×2^-7，使用cfx96^tm实时pcr检测系统检测，ddh2o代替模板作为阴性对照，qrt-pcr反应体系为：tbgreenadvantageqpcrpremix10μl，正反向引物各0.5μl，cdna模板2.0μl，ddh2o7.0μl，总体积20μl，反应程序：95℃变性10sec，95℃5sec，60℃25sec，共45个循环；

步骤六：tp53mrna水平检测

qrt-pcr检测试验大鼠关节中tp53mrna相对表达量，根据tbgreenqpcrmastermix-tbgreenadvantage试剂盒建议的反应条件，构建反应体系同步骤五，每个样本重复3次，根据ct值，利用2^-δδct法计算试验大鼠关节中tp53mrna相对表达量；

步骤七：数据处理

使用spss24.0软件分析所有数据，统计分析基于anova，duncan法进行多重比较，图使用origin2017生成。结果表示为平均值±标准误(s.e.)。p＜0.05具有统计学意义。

三、结果与分析

(1)cia大鼠tp53引物pcr电泳结果

提取cia大鼠关节组织总rna，电泳检测结果显示cia大鼠关节总rna质量较好，无降解。以cia大鼠cdna为模板进行tp53pcr温度梯度反应，温度分别为：60℃、58.3℃、56.3℃、53.9℃、50.7℃，经琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，不同温度梯度下，均检测到扩增产物，条带单一，60℃为最佳扩增温度。表明tp53引物特异性较强、无引物二聚体出现，可用于序列测定；

(2)cia大鼠tp53cdna测序结果

测序结果表明(图2)，tp53cdnapcr产物大小为232bp，blast比对tp53cdna序列，同源性为100％，说明本发明所用引物特异性较强，序列准确，可用于相对定量标准曲线的检测；

(3)相对定量标准曲线的建立

本发明的试验建立了tp53mrna相对定量标准曲线。结果显示，tp53和β-actinmrna标准曲线呈良好的线性关系(图3-a)，扩增效率为：100.4％和97.3％，线性拟合度为：0.989和0.999。说明本试验建立的tp53mrna水平检测方法真实可靠，可利用2^-δδct法计算不同组织中tp53mrna相对表达量。图3-b、c为tp53和β-actinmrna的扩增动力学曲线、熔解曲线图。通过扩增曲线，可以看出基线比较平稳，拐点清楚，tp53和β-actinmrna标准曲线平行性较好，符合试验要求；tp53和β-actinmrna扩增产物熔解曲线峰单一，无非特异性产物和引物二聚体，符合试验要求。

(4)试验大鼠关节中tp53mrna水平表达

试验大鼠关节中tp53mrnaqrt-pcr结果显示(图4)，cia大鼠关节中tp53mrna相对表达量极显著高于其他组(p＜0.01)；高剂量和中剂量二妙散药物组tp53mrna相对表达量较mtx组和正常对照组差异不显著(p＞0.05)，低剂量二妙散药物组tp53mrna相对表达量较高剂量和中剂量二妙散药物组差异显著(p＜0.05)。说明不同浓度二妙散对cia大鼠均有不同程度的抑制作用，最佳作用浓度为3.0g/kg。进一步说明，tp53在cia大鼠发病机制中起着重要的作用。

四、本发明的试验结论

通过以上试验的分析，可以得知，不同浓度二妙散治疗cia大鼠均有不同程度的抑制作用，最佳作用浓度为3.0g/kg，tp53在cia大鼠发病机制中起着重要的作用。

综上所述，本发明提出的不同浓度二妙散对cia大鼠关节中tp53mrna水平表达的试验方法，本发明的试验建立cia大鼠模型，通过设计合成tp53特异性引物，pcr检测tp53引物特异性，qrt-pcr检测不同浓度二妙散灌胃大鼠后tp53mrna的表达水平。结果表明：tp53引物特性较强，blast比对其同源性为100％；tp53和β-actin扩增效率分别为：100.4％和97.3％，线性拟合度分别为：0.989和0.999；cia大鼠关节中极显著高于其他组(p＜0.01)；高剂量和中剂量二妙散药物组tp53mrna表达量较mtx组和正常对照组差异不显著(p＞0.05)，低剂量二妙散药物组tp53mrna表达量较高剂量和中剂量二妙散药物组差异显著(p＜0.05)。说明不同浓度二妙散对cia大鼠均有不同程度的抑制作用，最佳作用浓度为3.0g/kg，tp53在cia大鼠发病机制中起着重要的作用，相比现有技术，本发明可以为研究cia大鼠tp53的作用机制提供试验基础，同时也为研究二妙散治疗类风湿关节炎的药理机制提供理论依据。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。