一种野生猕猴桃酒乳酸菌的分离系统的制作方法

本发明属于水处理设备领域，尤其涉及一种野生猕猴桃酒乳酸菌的分离系统。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：

猕猴桃是猕猴桃科植物猕猴桃的果实。猕猴桃富含维生素、氨基酸、类胡萝卜素及镁、铁、钾、钠等多种营养成分，其营养丰富，味道鲜美，特别是含有丰富的维生素c，被称为“果中珍品”、“维c之王”等美称。味酸、甘，性寒，具有调中理气，生津润燥，解热除烦等作用，对高血压、心绞痛、高血脂等症状有一定的疗效。

猕猴桃是一种深受消费者喜爱的水果，其果实细嫩多汁，清香鲜美，酸甜宜人，营养极为丰富。它的维生素c含量高达100-420g/100mg，比柑桔、苹果等水果高几倍甚至几十倍，同时还含大量的糖、蛋白质、氨基酸等多种有机物和人体必需的多种矿物质。据美国rutgers大学食品研究中心测试，猕猴桃是各种水果中营养成份最丰富、最全面的水果。

猕猴桃含有优良的膳食纤维和丰富的抗氧化物质，能够起到清热降火、润燥通便的作用，可以有效地预防和治疗便秘和痔疮。猕猴桃含有抗突变成分谷胱甘肽，有利于抑制诱发癌症基因的突变，对肝癌、肺癌、皮肤癌、前列腺癌等多种癌细胞病变有一定的抑制作用。猕猴桃富含精氨酸，能有效地改善血液流动，阻止血栓的形成，对降低冠心病、高血压、心肌梗塞、动脉硬化等心血管疾病的发病率和治疗阳萎有特别功效。猕猴桃含有大量的天然糖醇类物质肌醇，能有效地调节糖代谢，调节细胞内的激素和神经的传导效应，对防止糖尿病和抑郁症有独特功效。

乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称，生长于厌氧或者兼性厌氧环境中。乳酸菌只是一种习惯叫法，并不是微生物分类学上的名称。这是一群相当庞杂的细菌，分类有数百个属，很难把是否产生乳酸作为细菌的分类标准。乳酸菌细胞形态有球状、类球状、杆状或短杆状等。目前研究表明，乳酸菌除个别属对人、畜致病，绝大多数对人畜无害，而革兰氏阳性乳酸菌占据了绝大多数，如目前大量应用的乳杆菌属、片球菌属、明串珠菌属、乳球菌属、双歧杆菌属、肠球菌属等都为革兰氏阳性。大量的研究表明，这类乳酸菌在动物体内可以降低ph值，降解氨、吲哚、粪臭素等有害物质，增强机体的免疫功能，产生抑菌代谢产物，如乳酸菌肽、细菌素、乳酸、过氧化氢、乙酸等，从而阻止和抑制致病菌的侵入和定植，维持肠道中正常的微生态平衡，提高机体的抗病能力，对许多革兰氏阳性菌(g+)及革兰氏阴性菌(g-)有强烈的抑制作用，可抑制肠道内腐败菌的生长繁殖和腐败产物的产生。

有机酸是猕猴桃酒的风味物质之一,猕猴桃酒中的主体酸主要包括奎尼酸(10236.67mg/l)、柠檬酸(8993.04mg/l)、苹果酸(2512.70mg/l),而苹果酸是一种具有强烈辛酸味的双羧基酸,利用苹果酸-乳酸发酵菌(mlf)可降解苹果酸,使之转化为单羧基的、口感酸味柔和的乳酸,使猕猴桃酒的有机酸含量降低,酒体协调性增加,并可提高其生物稳定性和风味复杂性。这就需要一种能够提取分离野生猕猴桃酒中的乳酸菌的设备。

目前乳酸菌主要的分离分析方法有：hplc法，电泳法、毛细管电泳法等。

综上所述，现有技术存在的问题是：

提取分离野生猕猴桃酒中的乳酸菌设备提取效果差，

现有技术中，对野生猕猴桃酒中的乳酸菌分离的培养基，不利于区分目标菌，对加杂菌生长的抑制性差，不能提高苹果酸-乳酸发酵菌mlf的筛选效率。

琼脂糖凝胶电泳作为生物学程领域最常用的技术，兼具“分子筛”与“电泳”双重作用，主要用于核酸的分离、鉴定、提纯。琼脂糖凝胶电泳也能用于分离、鉴定多糖类化合物，有文献显示，通过调整琼脂糖凝胶浓度、缓冲液等参数，可以通过电泳分离鉴定多种多糖类化合物。重复性好，设备要求低，具有较好的应用价值。

现有琼脂糖凝胶电泳分离野生猕猴桃酒乳酸菌中存在的电泳时间长，条带弥散，需要两次电泳问题。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种野生猕猴桃酒乳酸菌的分离系统。

本发明是这样实现的，一种野生猕猴桃酒乳酸菌的分离系统，所述野生猕猴桃酒乳酸菌的分离系统设置有：

储酒室；

所述储酒室通过管路连接至旋涡均匀器；

所述旋涡均匀器通过管路连接至高压蒸汽灭菌室与培养基冷却室；

80℃室与121℃室通过管路连接至加琼脂室；

所述加琼脂室通过管路连接至1kg/cm²压力室；

所述1kg/cm²压力室通过管路连接至倒培养基平板室；

所述倒培养基平板室通过连接至培养基冷却室；

所述培养基冷却室通过管路连接至40℃恒温箱；

在培养基平板室内以浓度为0.05m的醋酸钡溶液为缓冲液，配制胶浓度0.5％-1.0％的琼脂糖凝胶，胶厚度在2-6mm，梳齿之间距离在4mm；每个点样孔上琼脂糖凝胶样量在6微克-12微克；将凝胶置于0.05m醋酸钡溶液缓冲液中，缓冲液顶部没过凝胶1-3mm，然后在缓冲液上层加入石油醚，封住气液界面；将整个电泳槽体系置于培养基冷却室中，电泳槽两端连接电泳仪电源，施以130v电压，电泳时间为1小时～2小时；

电泳完毕，将凝胶板取出，在cetavlon浸透大于4小时，取出后以干燥滤纸铺盖于凝胶上，轻压脱水；

将0.3％的甲苯胺蓝溶解在按体积比的乙醇：水：乙酸＝50:8:1形成的溶剂中，配制染色液，将凝胶悬浮在染色液中，放于摇床缓慢振荡染色40-80分钟,然后用乙醇：水：乙酸比例为60:48:1混合成的溶液洗涤。

进一步，所述高压蒸汽灭菌室中高压蒸汽环境为103kpa121℃。

进一步，所述培养基冷却室的环境温度为50℃。

进一步，培养基，以水1000ml作为相对量，按质量计其他组份由：蛋白胨5～10g、酵母膏3～5g、牛肉膏8～12g、葡萄糖15～21g、乙酸钠2～4g、柠檬酸二铵1.0～1.7g、吐温800.5～1.3ml、硫酸镁0.4～0.5g、琼脂12～25g、硝酸铵nh2no30.4～0.5g、硝酸钾kno30.4～0.5g、氯化钙cacl2·2h2o0.4～0.5g、硫酸镁mgso4·7h2o0.4～0.5g、磷酸二氢钾kh2po40.4～0.5g、碘化钾ki0.04～0.05g、硼酸h3bo30.04～0.05g、硫酸锰mnso4·4h2o0.04～0.05g、硫酸锌znso4·7h2o0.04～0.05g、钼酸钠na2moo4·2h2o0.04～0.05g、硫酸铜cuso4·5h2o0.04～0.05g和氯化钴cocl2·6h2o0.04～0.05g组成。

进一步，培养基的ph调节为6.0～6.8。

进一步，在121℃下对培养基灭菌10～30分钟。

进一步，培养基的制备方法包括步骤：

(1)称取各组分，将蛋白胨5～10g、酵母膏3～5g、牛肉膏8～12g、葡萄糖15～21g、乙酸钠2～4g、柠檬酸二铵1.0～1.7g、吐温800.5～1.3ml、硫酸镁0.4～0.5g、琼脂12～25g、硝酸铵nh2no30.4～0.5g、硝酸钾kno30.4～0.5g、氯化钙cacl2·2h2o0.4～0.5g、硫酸镁mgso4·7h2o0.4～0.5g、磷酸二氢钾kh2po40.4～0.5g、碘化钾ki0.04～0.05g、硼酸h3bo30.04～0.05g、硫酸锰mnso4·4h2o0.04～0.05g、硫酸锌znso4·7h2o0.04～0.05g、钼酸钠na2moo4·2h2o0.04～0.05g、硫酸铜cuso4·5h2o0.04～0.05g和氯化钴cocl2·6h2o0.04～0.05g放入容器中，加入酸溶液，调节ph至6.0～6.8，121℃灭菌10～30分钟；

(2)将步骤(1)灭菌后的混合物冷却至35～40℃。

进一步，

配制的胶浓度为0.5％；

配置的胶厚度为3mm。

进一步，每个点样孔上琼脂糖凝胶样量-12微克；

浓度为0.05m的醋酸钡溶液ph为5.5。

进一步，所用培养基冷却室温度为4℃，cetavlon为0.1％浓度溶液；染色时间为1小时。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明采用无菌生理盐水与工具，通过高压与高温环境的处理，能够在培养基上有效地分离出乳酸菌。

本发明的野生猕猴桃酒中的乳酸菌(包括苹果酸-乳酸发酵菌mlf(现有))相对于常规的分离乳酸菌的培养基，更有利于区分乳酸菌目标菌，加强了对杂菌生长的抑制，提高了苹果酸-乳酸发酵菌mlf的筛选效率。

本发明通过在醋酸钡缓冲液中进行一次琼脂糖凝胶电泳，通过对电泳液进行降温处理、降低电泳电压、延长电泳时间、石油醚封气液界面等方法，有效地将快速移动野生猕猴桃酒中的乳酸菌与猕猴桃其他酸的菌分离。

附图说明

图1是本发明实施例提供的野生猕猴桃酒乳酸菌的分离系统的野生猕猴桃酒乳酸菌分离生产模块结构示意图；

图中：1、储酒室；2、旋涡均匀器；3、高压蒸汽灭菌室；4、80℃室；5、121℃室；6、加琼脂室；7、1kg/cm²压力室；8、倒培养基平板室；9、培养基冷却室；10、40℃恒温箱。

图2是本发明实施例提供的苹果酸-乳酸发酵菌分离电泳图。

具体实施方式

为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。

如图1所示，本发明实施例提供的野生猕猴桃酒乳酸菌分离生产模块，包括：储酒室1、旋涡均匀器2、高压蒸汽灭菌室3、80℃室4、121℃室5、加琼脂室6、1kg/cm²压力室7、倒培养基平板室8、培养基冷却室9、40℃恒温箱10。

储酒室1；

所述储酒室1通过管路连接至旋涡均匀器2；

所述旋涡均匀器2通过管路连接至高压蒸汽灭菌室3与培养基冷却室9；

80℃4室与121℃室5通过管路连接至加琼脂室6；

所述加琼脂室6通过管路连接至1kg/cm2压力室7；

所述1kg/cm2压力室7通过管路连接至倒培养基平板室8；

所述倒培养基平板室8通过连接至培养基冷却室9；

所述培养基冷却室9通过管路连接至40℃恒温箱10。

本发明在使用时，将生理盐水在高压蒸汽灭菌室3中进行高压蒸汽灭菌20分钟，得到无菌生理盐水。与酒液体在旋涡均匀器2中充分振摇混合，得到稀释液。在80℃室中对脱脂奶粉、水、溴甲酚和绿乙醇溶液进行灭菌20分钟，在121℃室中对酵母膏、水和琼脂灭菌20.min。处理好的溶液在1kg/cm²压力室7中要维持30分钟。然后在倒培养基平板室8中，点燃酒精灯对周围的空气进行灭菌，并在酒精灯的附近用左手握着平板用拇指和小拇指打开一个小缝，趁热将培养液倒如平板内，倒入的量能使培养基刚要覆盖平板底部，倒好后把平板平放到实验台，轻轻晃动是培养基形成一个平面。把灭菌的生猕猴桃加入融化了的培养基中,于自来水中迅速冷却培养基至46℃左右(手感觉到有点烫,但能长时间握住),边冷却边摇晃使生猕猴桃混匀,但不得产生气泡，将经高温消毒的培养基置于培养基冷却室9中进行冷却。然后将稀释液接种于培养基平板上，并涂布均匀，置于40℃恒温箱中，培养48小时后，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。

下面结合具体分析对本发明作进一步描述。

在培养基平板室内以浓度为0.05m的醋酸钡溶液为缓冲液，配制胶浓度0.5％-1.0％的琼脂糖凝胶，胶厚度在2-6mm，梳齿之间距离在4mm；每个点样孔上琼脂糖凝胶样量在6微克-12微克；将凝胶置于0.05m醋酸钡溶液缓冲液中，缓冲液顶部没过凝胶1-3mm，然后在缓冲液上层加入石油醚，封住气液界面；将整个电泳槽体系置于培养基冷却室中，电泳槽两端连接电泳仪电源，施以130v电压，电泳时间为1小时～2小时；

电泳完毕，将凝胶板取出，在cetavlon浸透大于4小时，取出后以干燥滤纸铺盖于凝胶上，轻压脱水；

将0.3％的甲苯胺蓝溶解在按体积比的乙醇：水：乙酸＝50:8:1形成的溶剂中，配制染色液，将凝胶悬浮在染色液中，放于摇床缓慢振荡染色40-80分钟,然后用乙醇：水：乙酸比例为60:48:1混合成的溶液洗涤。

培养基，以水1000ml作为相对量，按质量计其他组份由：蛋白胨5～10g、酵母膏3～5g、牛肉膏8～12g、葡萄糖15～21g、乙酸钠2～4g、柠檬酸二铵1.0～1.7g、吐温800.5～1.3ml、硫酸镁0.4～0.5g、琼脂12～25g、硝酸铵nh2no30.4～0.5g、硝酸钾kno30.4～0.5g、氯化钙cacl2·2h2o0.4～0.5g、硫酸镁mgso4·7h2o0.4～0.5g、磷酸二氢钾kh2po40.4～0.5g、碘化钾ki0.04～0.05g、硼酸h3bo30.04～0.05g、硫酸锰mnso4·4h2o0.04～0.05g、硫酸锌znso4·7h2o0.04～0.05g、钼酸钠na2moo4·2h2o0.04～0.05g、硫酸铜cuso4·5h2o0.04～0.05g和氯化钴cocl2·6h2o0.04～0.05g组成。

培养基的ph调节为6.0～6.8。

在121℃下对培养基灭菌10～30分钟。

培养基的制备方法包括步骤：

(1)称取各组分，将蛋白胨5～10g、酵母膏3～5g、牛肉膏8～12g、葡萄糖15～21g、乙酸钠2～4g、柠檬酸二铵1.0～1.7g、吐温800.5～1.3ml、硫酸镁0.4～0.5g、琼脂12～25g、硝酸铵nh2no30.4～0.5g、硝酸钾kno30.4～0.5g、氯化钙cacl2·2h2o0.4～0.5g、硫酸镁mgso4·7h2o0.4～0.5g、磷酸二氢钾kh2po40.4～0.5g、碘化钾ki0.04～0.05g、硼酸h3bo30.04～0.05g、硫酸锰mnso4·4h2o0.04～0.05g、硫酸锌znso4·7h2o0.04～0.05g、钼酸钠na2moo4·2h2o0.04～0.05g、硫酸铜cuso4·5h2o0.04～0.05g和氯化钴cocl2·6h2o0.04～0.05g放入容器中，加入酸溶液，调节ph至6.0～6.8，121℃灭菌10～30分钟；

(2)将步骤(1)灭菌后的混合物冷却至35～40℃。

配制的胶浓度为0.5％；

配置的胶厚度为3mm。

每个点样孔上琼脂糖凝胶样量-12微克；

浓度为0.05m的醋酸钡溶液ph为5.5。

进一步，所用培养基冷却室温度为4℃，cetavlon为0.1％浓度溶液；染色时间为1小时。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

琼脂糖凝胶的制备：电泳胶规格为100×70，浓度0.6％，缓冲液0.05m醋酸钡(ph5.8)，电泳胶厚度3mm，将琼脂糖在缓冲液中融化均一后，冷却至60℃左右，倾倒铺制于胶槽中，待凝固使用；

电泳：将凝固后的凝胶置于电泳槽中，以0.05m醋酸钡(ph5.8)为缓冲液，每个胶孔上样10微克样品，上样完毕后，向缓冲液顶部缓慢加入少量石油醚，将整套电泳设备置于4℃培养基冷却室，130v，电泳2小时；

染色与脱色：电泳完毕，将凝胶板取出，在cetavlon溶液中浸透，取出后以干燥滤纸铺盖于凝胶上，小心轻压脱水数次；用甲苯胺蓝溶液，在摇床上缓慢振荡染色30分钟，然后用60:48:1＝乙醇：水：乙酸溶液洗涤多次至背景颜色较浅，条带明显；

最终得到的凝胶，通过凝胶成像系统将电泳结果保存，通过光密度计或者其他软件对粘多糖进行定性定量分析。

所述凝胶优先选择高强度琼脂糖，使用的琼脂糖浓度为0.6％，过低凝胶容易破碎，过高分离效果不佳。

所述甲苯胺蓝有效浓度为0.3％，溶解在乙醇：水：乙酸＝50:9:1的溶液中，所述cetavlon溶液浓度为0.1％。

如图2：分离苹果酸-乳酸发酵菌的方法主要是通过连续在醋酸钡缓冲液和1,2—二氨基丙烷缓冲液中，跑琼脂糖凝胶电泳来分离这两个组分。本发明通过在醋酸钡缓冲液中进行一次琼脂糖凝胶电泳，通过对电泳液进行降温处理、降低电泳电压、延长电泳时间、石油醚封气液界面等方法，有效地将苹果酸-乳酸发酵菌与与猕猴桃其他酸的菌分离。

以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。