具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物医用高分子材料技术领域，涉及具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球及其制备方法与应用。

背景技术：

现有的磁性微载体是将磁性材料表面进行处理、包裹高分子材料、结合抗原、抗体、核酸等生物大分子物质得到的，磁性材料位于微载体的内部，并且磁性微载体大多是后期种植细胞，细胞是生长在微载体的表面的。例如，将包覆了抗体的磁珠与待分离细胞充分作用，借助抗体磁珠将与相应的细胞结合成细胞-抗体-磁珠复合物的形式，利用其在磁场中的运动与其他细胞的差异，可以特异性地分离细胞。但现有磁性微载体在应用方面仍然具有一定的局限性，一方面，细胞生长在微载体的表面，无法满足组织工程三维培养的要求，另一方面，磁性材料处于微载体的内部，无法去除，不能用于临床修复。因此，现有磁性微载体的功能是细胞培养和分选，一般仅作为体外研究使用。

大量研究表明，三维培养环境会更利于细胞向相关组织生长。而共培养技术在众多组织工程中也已经广泛使用，共培养技术将目标细胞和种子细胞共同培养于同一环境中，目标细胞会分泌很多利于种子细胞分化的细胞因子促进种子细胞分化。目前常用的共培养有2d-2d细胞共培养，2d-3d细胞-支架共培养，3d-3d支架共培养，后期将目标细胞和种子细胞分离时都是利用起初的空间分布来实现，这就造成了不同细胞之间空间较远，目标细胞分泌的相关因子无法快速有效地被种子细胞获得。

cn102286422a公开了一种用于体外共培养的复合微囊模型，该模型以天然多糖海藻酸钠为基质材料，将多糖海藻酸钠滴入到多价阳离子溶液中经两次凝胶化处理，形成由内外两层海藻酸钠凝胶微球构成的球包球式复合微囊模型，其中一层凝胶微球可包含一种细胞，另一层中可包含另一种细胞。虽然在微囊模型中内层凝胶微球实现了细胞在三维环境中生长，也可以解决目标细胞与种子细胞之间空间相隔较远的问题，但是，该复合微囊模型无法实现外层凝胶和内层凝胶中不同细胞的分离，加之内外两层凝胶的材质相同，内外两层凝胶中的细胞会在两层凝胶之间发生迁移，这会进一步增加共培养完成后不同细胞的分离难度，因此该复合微囊模型仍然只能用于体外研究，不能用于临床修复。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球及其制备方法与应用，以解决现有微载体在共培养结束后无法实现磁性材料的去除以及共培养体系中不同细胞的分离，不能用于临床植入修复等问题。

本发明提供的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球，包括凝胶微球和包覆所述凝胶微球的超顺磁凝胶涂层，所述凝胶微球中含有细胞，所述超顺磁凝胶涂层中含有超顺磁颗粒，超顺磁凝胶涂层能被洗脱去除，且超顺磁凝胶涂层与凝胶微球不能被同时洗脱去除。

上述具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球的技术方案中，构成凝胶微球的凝胶材料为生物相容性的温敏材料、光敏材料或者离子敏感材料，构成超顺磁凝胶涂层的凝胶材料为生物相容性的温敏材料或者离子敏感材料，构成凝胶微球与构成超顺磁凝胶层的凝胶材料不同。

优选地，构成凝胶微球的凝胶材料为温敏材料或光敏材料，同时构成超顺磁凝胶涂层的凝胶材料为离子敏感材料，超顺磁凝胶涂层通过在溶液中溶解去除，例如，超顺磁凝胶涂层的凝胶材料可以采用海藻酸钙凝胶，海藻酸钙凝胶可以在柠檬酸溶液中溶解去除；或者，构成凝胶微球的凝胶材料为光敏材料、温敏材料或离子敏感材料，同时构成超顺磁凝胶涂层的凝胶材料为随着环境温度变化能在液态与凝胶态之间相互可逆转换的温敏材料，超顺磁凝胶涂层通过改变环境温度去除，当构成凝胶微球和超顺磁凝胶涂层的凝胶材料均为温敏材料时，温敏材料的选择原则应确保构成凝胶微球与构成超顺磁凝胶涂层的凝胶材料不在同一温度条件下被去除，例如，超顺磁凝胶涂层的凝胶材料可以采用明胶凝胶，明胶凝胶可在升温至30℃左右开始液化而被去除。

作为可选的方式，所述温敏材料可以是胶原、明胶、聚异丙基丙烯酰胺及其衍生物等凝胶温度低于40℃的材料形成的凝胶材料；所述光敏材料可以是甲基丙烯酸酐或马来酸酐改性的透明质酸衍生物、硫酸软骨素衍生物、普鲁兰多糖衍生物等水溶性光敏多糖在光引发剂和适当的光照条件下反应形成的凝胶材料，所述的光引发剂可以是2-羟基-4’-(羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(i2959)、1-羟基环己基苯基丙酮(i184)或者2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮(i651)；所述离子敏感材料可以是海藻酸衍生物与钙离子交联形成的凝胶材料。

进一步地，所述随着环境温度变化能在液态与凝胶态之间相互可逆转换的温敏材料包括明胶凝胶和聚(n-异丙基丙烯酰胺)凝胶。

更进一步地，当构成凝胶微球和超顺磁凝胶涂层的凝胶材料均为温敏材料时，同时构成超顺磁凝胶涂层的凝胶材料应为随着环境温度变化能在液态与凝胶态之间相互可逆转换的温敏材料，构成凝胶微球的温敏材料可以是随着环境温度变化能在液态与凝胶态之间相互可逆转换的温敏材料，也可以是在形成凝胶状态后，随着环境温度变化不能转变为液态的温敏材料，构成凝胶微球和超顺磁凝胶涂层的温敏材料的选择原则应确保构成凝胶微球与构成超顺磁凝胶涂层的凝胶材料不在同一温度条件下被去除。例如，按照凝胶微球-涂层的形式，温敏材料的组合形式可以为胶原微球-明胶涂层，胶原微球-聚(n-异丙基丙烯酰胺)涂层。

上述具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球的技术方案中，所述超顺磁凝胶涂层中的超顺磁颗粒的尺寸根据凝胶微球和超顺磁凝胶涂层的凝胶网络结构的孔隙进行选择，超顺磁凝胶涂层中的超顺磁颗粒的尺寸应大于超顺磁凝胶涂层的凝胶网络尺寸，同时所述超顺磁凝胶涂层中的超顺磁颗粒的尺寸大于凝胶微球的凝胶网络尺寸，以避免超顺磁颗粒渗透进入凝胶微球和泄漏进入细胞共培养的培养基中。这有利于提高后期分离的稳定性，同时避免超顺磁颗粒对凝胶微球包裹细胞产生生物毒性。优选地，所述超顺磁凝胶涂层中，超顺磁颗粒的尺寸为1～50μm，进一步优选为5～40μm，10～30μm或15～25μm，所述超顺磁凝胶涂层中超顺磁颗粒的含量为0.1～10mg/ml。

上述具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球的技术方案中，所述超顺磁凝胶涂层的厚度为10～150μm。

上述具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球的技术方案中，该细胞-微球为球形或接近球形，为了有利于凝胶微球内的细胞获得养分增殖，同时有利于细胞分泌的相关因子的扩散和获得，细胞-微球的尺寸根据实际应用需求进行确定，细胞-微球的尺寸通常为30～3000μm，优选为30～1000μm。

本发明还提供了一种上述具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球的制备方法，包括以下步骤：

(1)调节凝胶材料溶液的ph值至6.5～7.5，去除凝胶材料溶液中的气泡，将经计数的细胞由培养基或缓冲液配成细胞悬液，然后加入到去除气泡后的凝胶材料溶液中，得到细胞-凝胶材料混合液；

(2)将所述细胞-凝胶材料混合液分散于油相液体中，经乳化和凝胶化处理，得到细胞-微球，并将细胞-微球表面环境调控至步骤(3)的涂层材料凝胶化所需的条件条件；比如，调控细胞-微球表面的温度或者离子浓度达到步骤(3)的涂层材料凝胶化所需的条件；

(3)将凝胶材料与超顺磁颗粒混合均匀形成涂层材料，然后在细胞-微球表面均匀涂覆涂层材料，涂覆于细胞-微球表面的涂层材料凝胶化转变为凝胶涂层，再通过离心或静置去除多余的涂层材料，清洗，得到具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球。

上述具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球的制备方法的技术方案中，覆盖凝胶微球的可洗脱超顺磁凝胶涂层的厚度根据实际应用需求进行确定，增加步骤(3)涂覆涂层材料和凝胶化处理操作的次数，可以增加超顺磁凝胶涂层的厚度。具体地，步骤(3)可以按照以下操作进行：

①将凝胶材料与超顺磁颗粒混合均匀形成涂层材料，然后在细胞-微球表面均匀涂覆涂层材料，涂覆于细胞-微球表面的涂层材料凝胶化转变为凝胶涂层，通过离心或静置去除多余的涂层材料，清洗；

②去除步骤①清洗后得到的微球表面的水分，然后在所述微球表面均匀涂覆涂层材料，涂覆于细胞-微球表面的涂层材料凝胶化转变为凝胶涂层，通过离心或静置去除多余的涂层材料，清洗；

③根据实际应用时对超顺磁凝胶涂层厚度的要求，重复步骤②的操作数次，例如0～5次，得到具有适当厚度的可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球。

上述具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球的制备方法的技术方案中，步骤(2)所述经乳化和凝胶化处理中具体采用的凝胶化处理方法与用具体采用的凝胶微球的凝胶材料有关，凝胶化处理手段可以是温度调控、离子交联、光引发交联等成胶方法，例如：温敏材料需要在特定的温度环境中形成凝胶，比如从35℃升温至凝胶温度以上并保持1～45分钟；离子敏感材料需要在交联离子存在的环境下形成凝胶，比如滴加二价阳离子溶液，氯化钙、氯化锌、氯化镁等实现成胶，光敏材料需要在光引发剂和特定的光照环境中形成凝胶，比如用特定波长的紫外光照射10～360秒。

上述具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球的制备方法的技术方案中，步骤(3)所述涂覆于细胞-微球表面的涂层材料发生凝胶化的条件，以及步骤(2)将细胞-微球表面环境调控至步骤(3)的涂层材料凝胶化所需的条件，与具体采用的凝胶涂层的凝胶材料有关，例如：温敏材料需要在特定的温度环境中形成凝胶，比如从35℃升温至凝胶温度以上并保持1～45分钟；离子敏感材料需要在交联离子存在的环境下形成凝胶，比如滴加二价阳离子溶液，氯化钙、氯化锌、氯化镁等实现成胶。

上述具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球的制备方法的技术方案中，步骤(1)通过离心或静置的方式去除凝胶材料溶液中的气泡。

上述具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球的制备方法的技术方案中，步骤(2)的操作具体为：

在油相液体中加入体积百分浓度为0％～10％(v/v)的表面活性剂，然后在机械搅拌作用下，加入细胞-凝胶材料混合液，使凝胶材料均匀分散于所述油相液体中形成油包水微球，搅拌两相混合液的同时选择相应的凝胶条件实现微球的凝胶化，采用离心或过滤等常用的分离方式分离出凝胶微球。

优选地，所述的油相液体可以是甲基硅油、石蜡油等矿物油或橄榄油、蓖麻油、玉米油、菜籽油等植物油中的一种或其混合，优先选择粘度为20～200mpa·s的油相液体。所述的表面活性剂可以是tween-20、tween-40、tween-60、tween-80、span-20、span-40、span-60、span-80、tritonx-100中的一种。

优选地，细胞-凝胶材料混合液(水相溶液)与油相液体的比例为0.5％～40％，优选1％～5％，以100～1500rpm的转速持续搅拌1～30min，使水相分散成微球。

上述具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球的制备方法的技术方案中，步骤(2)在凝胶化处理之后还包括洗涤分离操作，通过洗涤分离步骤充分去除油相液体。所述洗涤操作具体为：将分离出的凝胶微球在培养基或者含0％～0.1％(v/v)tween80的缓冲液中分散、冲洗2～4次。所述的培养基可以是rpmi1640培养基、mem培养基或αmem培养基，所述的缓冲液可以是生理盐水、pbs缓冲液或hepes缓冲液。

本发明还提供了上述具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球在用于临床植入修复的含细胞凝胶微球的细胞共培养及共培养后期分离中的应用。

一种可行的应用方式如下：

(1)按照本发明的方法制备装载了目标细胞的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球；

(2)参照本发明的方法制备装载了种子细胞的具有可洗脱凝胶涂层的细胞-微球，该微球的凝胶涂层中不含超顺磁颗粒；

(3)将步骤(1)和步骤(2)制备的微球进行共培养；

(4)共培养结束后施加磁场将两种微球分离，装载了种子细胞的微球由于不含超顺磁颗粒，也不含目标细胞，将凝胶涂层去除后可以用于临床植入修复。

第二种可行的应用方式如下：

(1)按照本发明的方法制备装载了种子细胞的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球；

(2)参照本发明的方法制备装载了目标细胞的具有可洗脱凝胶涂层的细胞-微球，该微球的凝胶涂层中不含超顺磁颗粒；

(3)将步骤(1)和步骤(2)制备的微球进行共培养；

(4)共培养结束后施加磁场将两种微球分离，装载了种子细胞的微球的超顺磁凝胶涂层能洗脱去除，超顺磁凝胶涂层去除后，可以用于临床植入修复。

第三种可行的应用方式如下：

(1)按照本发明的方法制备装载了第一种种子细胞的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球；

(2)参照本发明的方法制备装载了第二种种子细胞的具有可洗脱凝胶涂层的细胞-微球，该微球的凝胶涂层中不含超顺磁颗粒；

(3)将步骤(1)和步骤(2)制备的微球进行共培养；

(4)共培养结束后施加磁场将两种微球分离，装载了第二种子细胞的微球不含超顺磁颗粒，将凝胶涂层去除后可以用于临床植入修复；装载了第一种种子细胞的微球的超顺磁凝胶涂层能洗脱去除，超顺磁凝胶涂层去除后，得到的装载了第一种种子细胞的凝胶微球也可以用于临床植入修复。

与现有技术相比，本发明产生了以下有益的技术效果：

1.本发明提供的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球，包括含细胞的凝胶微球和包覆含细胞的凝胶微球的超顺磁凝胶涂层，超顺磁凝胶涂层能被洗脱去除，超顺磁凝胶涂层与凝胶微球不能被同时洗脱去除。一方面，细胞装载在凝胶微球可以提供给细胞3d培养环境，3d培养环境更利于细胞向相关组织生长；另一方面，较小的微球尺寸，有利于细胞获得养分增殖，通过微米级尺寸微球的共混有利于细胞分泌的相关因子的扩散和获得；同时，超顺磁凝胶涂层具有磁性和能被洗脱去除的特点，将两种包裹了不同细胞或者微组织的微球进行共培养，在体外共培养完成后利用超顺磁凝胶涂层的磁性可以实现两种微球的分离，之后利用超顺磁凝胶涂层可以去除的特点将其洗脱去除，避免磁性物质残留，此外，凝胶涂层可以阻止共培养时细胞向微球外部迁移，避免共培养时不同细胞在两种微球之间相互迁移出现无法分离问题。以上这些特点使得本发明提供的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球可以在用于临床植入修复的含细胞凝胶微球的细胞共培养及共培养后期分离中应用，可以解决现有微载体在共培养结束后无法实现磁性材料的去除以及共培养体系中不同细胞的分离，不能用于临床植入修复的问题。

2.构成本发明提供的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球的凝胶微球和超顺磁凝胶涂层的凝胶材料为生物相容性的环境敏感型凝胶材料，具有生物相容性好和生物可降解性能，这使得本发明提供的细胞-微球用于临床植入修复时具备安全、可降解吸收、生物相容性好等特点。

3.本发明还提供了具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球的制备方法，该方法具有操作简单、工艺条件温和成本低的特点，有利于实现工业化生产。

附图说明

图1是实施例1制备的胶原凝胶微球，实施例3制备的微球的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球的光学显微镜照片。

图2是实施例2制备的荧光胶原凝胶微球、实施例5和6制备的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的荧光胶原凝胶微球的光学显微镜照片。

图3是实施例5和6制备的具有可洗脱凝胶涂层的荧光胶原凝胶微球的凝胶涂层的厚度柱状图。

图4是实施例1制备的胶原凝胶微球的扫描电镜照片。

图5是实施例4制备的具有可洗脱凝胶涂层的细胞-微球的扫描电镜照片。

图6是实施例7中的紫色微球在磁场条件下处于悬浮状态的照片。

图7是实施例7施加磁场前后微球分离情况的照片。

图8是实施例8洗脱去除超顺磁凝胶涂层前后的照片。

图9是实施例9中细胞活性测试结果。

图10是实施例10中培养骨髓间充质干细胞-胶原凝胶微球和具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的骨髓间充质干细胞-胶原凝胶微球的培养皿底部光学显微照片。

图11是实施例11中进行共培养的示意图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明提供的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球及其制备方法与应用作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例中，制备装载骨髓间充质干细胞的胶原凝胶微球，步骤如下：

(1)取浓度为15mg/ml的胶原溶液，在冰水浴中用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值至7.4，然后将胶原溶液稀释至胶原浓度为10mg/ml；将提前准备好的骨髓间充质干细胞计数并且用α-mem培养基制备成细胞悬液，加入到胶原溶液中并分散均匀得到细胞-胶原混合液，细胞-胶原混合液中，胶原终浓度为6.5mg/ml，细胞密度为5×10⁶个/ml。

(2)取粘度为50mpa·s的甲基硅油70ml，加入0.05％(v/v)的span-80形成油相，用磁力搅拌器以500rpm的转速搅拌，在冰水浴条件下，将细胞-胶原混合液(水相)滴加到油相中，继续搅拌30分钟，然后将水相-油相混合体系升温至37℃，继续搅拌20分钟，搅拌完成后，将所得混合液离心，将底层沉淀分散到α-mem培养基中清洗，用α-mem培养基冲洗3次，即得骨髓间充质干细胞-胶原凝胶微球。

实施例2

本实施例中，制备装载荧光颗粒的胶原凝胶微球，步骤如下：

(1)取浓度为15mg/ml的胶原溶液，在冰水浴中用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值至7.4，然后将胶原溶液稀释至胶原浓度为6mg/ml；取红色荧光颗粒和绿色荧光颗粒(v/v:1/50)均匀分散到胶原溶液中得到荧光颗粒-胶原混合液。

(2)取粘度为50mpa·s的甲基硅油60ml，用磁力搅拌器以550rpm的转速搅拌，在冰水浴条件下，将荧光颗粒-胶原混合液(水相)滴加到油相中，继续搅拌30分钟，然后将水相-油相混合体系升温至37℃，继续搅拌20分钟，搅拌完成后，将所得混合液离心，将底层沉淀分散到pbs缓冲液中清洗，用pbs缓冲液冲洗3次，即得荧光胶原凝胶微球。

实施例3

本实施例中，制备具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球，步骤如下：

(1)取实施例1制备的骨髓间充质干细胞-胶原凝胶微球，置于离心管中，用氯化钠溶液清洗3次，然后置于含氯化钙的氯化钠溶液中浸泡3分钟，将液体吸干备用。

(2)将6％的海藻酸钠溶液用含有4mg/ml的直径为1μm的超顺磁颗粒的溶液稀释一倍，混合均匀得到形成涂层材料，备用。

(3)将步骤(2)制备的涂层材料滴加到经过步骤(1)处理的骨髓间充质干细胞-胶原凝胶微球上，混合均匀，滴加到所述凝胶微球表面的涂层材料与凝胶微球表面的钙离子交联反应而凝胶化，形成凝胶涂层，通过离心去掉所述微球表面多余的涂层材料，然后置于α-mem培养基中清洗3次，以去除多余的海藻酸盐和超顺磁颗粒，即得具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球。

实施例4

本实施例中，制备具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球，步骤如下：

(1)取实施例1制备的骨髓间充质干细胞-胶原凝胶微球，置于离心管中，用氯化钠溶液清洗3次，然后置于含氯化钙的氯化钠溶液中浸泡3分钟，将液体吸干备用。

(2)将6％的海藻酸钠溶液用含有4mg/ml的直径为1μm的超顺磁颗粒的溶液稀释一倍，混合均匀得到形成涂层材料，备用。

(3)将步骤(2)制备的涂层材料滴加到经过步骤(1)处理的骨髓间充质干细胞-胶原凝胶微球上，混合均匀，滴加到所述凝胶微球表面的涂层材料与凝胶微球表面的钙离子交联反应而凝胶化，形成凝胶涂层，通过离心去掉所述微球表面多余的涂层材料，然后置于α-mem培养基中清洗3次，以去除多余的海藻酸盐和超顺磁颗粒，即得具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球。

(4)取步骤(3)所得具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球，重复步骤(1)和(3)的操作1次，得到包覆了两层具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球。

实施例5

本实施例中，制备具有可洗脱凝胶涂层的荧光胶原凝胶微球，步骤如下：

(1)取实施例2制备的荧光胶原凝胶微球，置于离心管中，用氯化钠溶液清洗3次，然后置于含氯化钙的氯化钠溶液中浸泡3分钟，将液体吸干备用。

(2)将6％的海藻酸钠溶液用去离子水稀释一倍，混合均匀得到形成涂层材料，备用。

(3)将步骤(2)制备的涂层材料滴加到经过步骤(1)处理的荧光胶原凝胶微球上，混合均匀，滴加到所述凝胶微球表面的涂层材料与凝胶微球表面的钙离子交联反应而凝胶化，形成凝胶涂层，通过离心去掉所述微球表面多余的涂层材料，然后置于pbs缓冲液中清洗3次，以去除多余的海藻酸盐，即得具有可洗脱凝胶涂层的荧光胶原凝胶微球。

实施例6

本实施例中，制备具有可洗脱凝胶涂层的荧光胶原凝胶微球，步骤如下：

(1)取实施例2制备的荧光胶原凝胶微球，置于离心管中，用氯化钠溶液清洗3次，然后置于含氯化钙的氯化钠溶液中浸泡3分钟，将液体吸干备用。

(2)将6％的海藻酸钠溶液用去离子水稀释一倍，混合均匀得到形成涂层材料，备用。

(3)将步骤(2)制备的涂层材料滴加到经过步骤(1)处理的荧光胶原凝胶微球上，混合均匀，滴加到所述凝胶微球表面的涂层材料与凝胶微球表面的钙离子交联反应而凝胶化，形成凝胶涂层，通过离心去掉所述微球表面多余的涂层材料，然后置于pbs缓冲液中清洗3次，以去除多余的海藻酸盐，即得具有可洗脱凝胶涂层的荧光胶原凝胶微球。

(4)取步骤(3)所得具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球，重复步骤(1)和(3)的操作5次，得到包覆了六层具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的荧光胶原凝胶微球。

实施例1制备的胶原凝胶微球，实施例3制备的微球的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球的光学显微镜照片依次如图1的(a)、(b)图所示。实施例2制备的荧光胶原凝胶微球、实施例5和6制备的具有可洗脱凝胶涂层的荧光胶原凝胶微球的光学显微镜照片依次如图2的(a)、(b)、(c)图所示，其中(b)(c)两图中虚线示意处为胶原凝胶微球的外边界和凝胶涂层的外边界。图3为实施例5和6制备的具有可洗脱凝胶涂层的荧光胶原凝胶微球的凝胶涂层的厚度柱状图，由图3可知，根据涂覆次数的不同，凝胶涂层的厚度可以在10～150nm范围内调控。

实施例1制备的胶原凝胶微球的扫描电镜照片如图4所示，图4的(a)、(b)、(c)图示意的是不同放大倍数下的扫描电镜照片。实施例4制备的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球的扫描电镜照片如图5所示，图5的(a)、(b)、(c)图示意的是不同放大倍数下的扫描电镜照片。由图5可知实施例4制备的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球接近球形，尺寸约为700～800μm。

实施例7

本实施例中，按照以下步骤对具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球与不含可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球进行分离。

(1)将实施例1制备的细胞-微球和实施例4制备的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球用tb染色。实施例4制备的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球被标记为紫色。由于实施例1制备的骨髓间充质干细胞-胶原凝胶微球中不含海藻酸钠凝胶涂层(不含多糖成分)，所以无法被tb染成紫色。

(2)将上述两种微球加入离心管中，加水，摇晃离心管至两种微球处于悬浮状态，将离心管竖直放置，用磁铁在离心管壁处施加磁场，实验发现紫色微球在磁场条件下可以处于悬浮状态，如图6所示。

(3)将上述两种微球加入离心管中，加水，摇晃离心管至两种微球处于悬浮状态，将离心管横向放置，用磁铁在离心管壁处施加磁场，实验发现紫色微球会被吸在离心管管壁上，用滴管将未被吸住的微球移入到另外的离心管中。施加磁场前后的照片如图7的(a)、(b)两图所示。

(4)转移至新的离心管之后，用磁铁在新离心管壁处施加磁场，实验发现紫色微球被吸在离心管管壁上，用滴管将未被吸住的微球移入到另外的离心管中。

(5)重复步骤(4)的操作数次，即可完成对两种微球的分离。

实施例8

本实施例中，对实施例4制备的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球表面的涂层进行洗脱。

(1)将实施例4制备的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球加入离心管中，加入浓度为55mmol/l的柠檬酸钠的水溶液浸泡5分钟，过滤，吸干微球表面的柠檬酸钠水溶液，然后置于α-mem培养基中清洗3次。

(2)取经过步骤(1)处理的微球，重复步骤(1)的操作2次。

(3)将经过步骤(2)处理的微球用tb染色，结果发现没有紫色异染出现，说明微球表面的超顺磁凝胶涂层已经被洗脱去除干净。

具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球表面的超顺磁凝胶涂层洗脱去除前后的照片分别如图8的(a)、(b)两图所示，其中(a)图中的紫色异染为超顺磁凝胶涂层被tb染色，而(b)图中不见紫色异染，说明超顺磁凝胶涂层已被完全洗脱去除。

实施例9

本实施例中，考察在实施例1制备的骨髓间充质干细胞-胶原凝胶微球表面增加超顺磁凝胶涂层是否会影响胶原凝胶微球中的骨髓间充质干细胞的活性。

取实施例1和实施例3制备的微球，进行细胞活性测试。用pbs将微球清洗3次，加入到提前配置好的fda-pi染色液中，染色5分钟后再用pbs清洗3次，利用激光共聚焦显微镜进行观察并拍照。结果如图9所示，由图9可知，在细胞-凝胶微球表面增加超顺磁凝胶涂层并不影响胶原凝胶微球中的细胞的活性。

实施例10

本实施例中，考察在实施例1制备的骨髓间充质干细胞-胶原凝胶微球表面增加超顺磁凝胶涂层是否有助于阻止胶原凝胶微球中的骨髓间充质干细胞向微球之外迁移。

取实施例1和实施例3制备的微球，在培养皿内培养三天后，在光学显微镜下观察培养皿底面是否有细胞粘附。由于培养皿有很好的细胞粘附能力，微球内如果有细胞迁移出来，就可以在培养皿底面观察到贴壁细胞。结果如图10所示，图10的a、b两图分别是培养实施例1制备的骨髓间充质干细胞-胶原凝胶微球的培养皿底部的光学显微照片，b图是a图的局部放大图，图10的c、d两图分别是培养实施例3制备的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的骨髓间充质干细胞-胶原凝胶微球的培养皿底部光学显微照片，d图是c图的局部放大图。由图10可知，在细胞-凝胶微球表面增加超顺磁凝胶涂层有助于阻止凝胶微球中的细胞向微球之外迁移。

实施例11

本实施例中，提供本发明所述具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-微球在用于临床植入修复的含细胞凝胶微球的细胞共培养及共培养后期分离中的应用，示意图如图11所示。

(1)参照实施例1的方法制备装载了种子细胞的胶原凝胶微球(种子细胞-胶原凝胶微球)；参照实施例1的方法制备装载了种子细胞的胶原凝胶微球(目标细胞-胶原凝胶微球)；

(2)取种子细胞-胶原凝胶微球，参照实施例4的方法制备具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的种子细胞-微球；

(3)取目标细胞-胶原凝胶微球，参照实施例4的方法制备具有可洗脱凝胶涂层的目标细胞-微球。注意在制备时不添加超顺磁颗粒，制备得到的微球的凝胶涂层中不含超顺磁颗粒。

(4)将步骤(2)制备的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的种子细胞-微球和步骤(3)制备的具有可洗脱凝胶涂层的目标细胞-微球共混，进行共培养，根据实际需要通过调整两种微球的浓度即可调整微球之间的距离。

(5)共培养结束后施加磁场将两种微球分离，分离后参照实施例8的方法将种子细胞-微球表面的超顺磁凝胶涂层洗脱去除，去除超顺磁凝胶涂层后可以用于临床植入修复。

实施例12

本实施例中，制备具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的软骨细胞-透明质酸凝胶微球，步骤如下：

(1)取适量甲基丙烯酸化透明质酸，加入提前准备好的含有光引发剂i2959的pbs缓冲液中；将提前准备好的软骨细胞计数并用α-mem培养基制备成细胞悬液，加入到透明质酸溶液中并分散均匀得到细胞-透明质酸混合液，细胞-透明质酸混合液中，甲基丙烯酸化透明质酸终浓度为10mg/ml，细胞密度为5×10⁶个/ml。

(2)取粘度为50mpa·s的甲基硅油70ml，加入0.01％(v/v)的span-80形成油相，用磁力搅拌器以500rpm的转速搅拌，在冰水浴条件下，将细胞-透明质酸混合液(水相)滴加到油相中，继续搅拌30分钟，在混合液中插入紫外光发射探头，照射1分钟完成微球的凝胶化处理，将所得混合液离心，将底层沉淀分散到α-mem培养基中清洗，用α-mem培养基冲洗3次，即得软骨细胞细胞-透明质酸凝胶微球。

(3)取步骤(2)制备的软骨细胞细胞-透明质酸凝胶微球，置于离心管中，用pbs缓冲液清洗3次，然后置于4℃的pbs缓冲液中浸泡5分钟，将液体吸干，保持在4℃冰浴中。

(4)将30℃处于液态的8％的明胶水溶液用含有4mg/ml的直径为2μm的超顺磁颗粒的溶液稀释一倍，混合均匀得到形成涂层材料，保持在30℃环境中备用。

(5)将步骤(4)制备的涂层材料滴加到经过步骤(3)处理的软骨细胞细胞-透明质酸凝胶微球上，混合均匀，滴加到所述凝胶微球表面的涂层材料接触到4℃的凝胶微球会转变为凝胶状态，形成明胶凝胶涂层，通过离心去掉所述微球表面多余的涂层材料，然后置于培养基中清洗3次，以去除多余的明胶和超顺磁颗粒，即得具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-透明质酸凝胶微球。

(6)取步骤(5)所得具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-透明质酸凝胶微球，重复步骤(3)和(5)的操作3次，得到包覆了四层具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-透明质酸凝胶微球。

使用本实施例制备的具有可洗脱超顺磁凝胶涂层的细胞-透明质酸凝胶微球进行共培养是，控制共培养温度在20℃，共培养结束后，将微球分离，置于35℃的pbs缓冲液中清洗去除超顺磁凝胶涂层。

本实施例中的超顺磁凝胶涂层的明胶凝胶也可以替换为聚(n-异丙基丙烯酰胺)凝胶，在采用适当的方式形成超顺磁凝胶涂层后，也可以采用改变环境温度的方式将聚(n-异丙基丙烯酰胺)凝胶涂层去除。