本发明属于医药技术领域，涉及一种具有抗肿瘤活性的硫醇类化合物，具体涉及含有6(7)-取代-n-(6-巯基己基)-吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺片段和吡唑并喹啉/异喹啉片段的硫醇类化合物及其药学上可接受的盐、水合物，及其包含所述化合物和其药学上可接受的盐、水合物作为活性成分的药物组合物，以及它们在制备组蛋白去乙酰化酶抑制剂，用于制备治疗和/或预防癌症药物中的用途。
背景技术：
表观遗传研究正成为人类攻克肿瘤的希望。表观遗传改变多发生在肿瘤发生的早期，此时肿瘤细胞尚未对人体造成实质性伤害，此时进行干预，很有可能将其扼杀在摇篮里。另外，相比遗传修饰几乎是不可逆转而言，表观遗传修饰异常可以逆转，是肿瘤细胞恢复为正常状态。因而，表观遗传研究具有更为广阔的应用前景。组蛋白修饰是表观遗传修饰的一种重要方式，人类绝大多数肿瘤细胞都存在组蛋白修饰异常，这种异常能引起抑癌基因沉默致使肿瘤形成。组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase,hdac)是一个包含多个成员的酶家族，目前已知有18种亚型，按其种系及与酵母同源性不同分为以下四类：与酵母rpd3，hos1，host2同源的ⅰ类，包括hdac1、hdac2、hdac3、hdac8；与酵母hda1，hos3同源的ⅱa类，包括hdac4、hdac5、hdac7、hdac9，ⅱb类包括hdac6、hdac10；与酵母sir2同源的ⅲ类，包括sirt1～sirt7；与ⅰ和ⅱ类hdac都有部分同源性，但其种系不同的ⅳ类，包括hdac11。其中ⅰ、ⅱ、ⅳ类为经典的zn2+依赖的hdacs，而第ⅲ类属于sirtuin家族，为nad+依赖的hdacs。研究表明，第ⅰ和ⅱ类hdacs能够抑制肿瘤细胞分化和凋亡、促进肿瘤细胞增殖等，其与肿瘤的发生、发展密切相关，以hdacs为靶点的抑制剂研究已经成为抗肿瘤药物研究的热点之一。
本发明在参考文献的基础上，设计并合成了一系列含有6(7)-取代-n-(6-巯基己基)-吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺片段和吡唑并喹啉/异喹啉片段的硫醇类化合物，及其药学上可接受的盐、水合物，体外抗肿瘤活性测试结果表明，其具有良好的抗肿瘤活性，并表现出优异的hdac抑制作用。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种具有hdac6抑制活性且具有良好抗肿瘤活性的硫醇类化合物及其制备方法，以及该类化合物作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂在预防和/或治疗肿瘤中的应用。化合物具体包含以下片段：6(7)-取代-n-(6-巯基己基)-吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺片段和吡唑并喹啉/异喹啉片段。
本发明涉及式ⅰ所示的化合物、及其药学上可接受的盐，水合物：
其中，
a环为5-6元芳环或杂芳环，所述杂芳环含有1-3个n、o或s的杂原子；所述a环可以被取代基取代，所述取代基为h、卤素、(c1-c6)烷基、卤代(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷氧基、(c1-c6)烷氧基(c1-c6)烷基、(c3-c4)环烷基、(c6-c10)芳基、(c1-c6)烷基取代苯基、(c1-c6)烷氧基取代的苯基或苄基、卤代(c6-c10)芳基、(c6-c10)酚芳基；
"---"代表单键或双键；
x为nh或o；
r选自一个或多个如下取代基：h、(c2-c4)酰基、(c1-c6)烷基、(c6-c10)芳基取代酯基；(c6-c10)芳基；(c1-c6)烷氧基(c1-c6)烷基；所述芳基可以被卤素、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷氧基、硝基、氨基、羟基取代；
本发明优选定义如式ⅰ所示的化合物、及其药学上可接受的盐，水合物：
其中，
a环选自一个或多个如下环系：
r1选自一个或多个如下取代基：h、卤素、(c1-c4)烷基、卤代(c1-c4)烷基、(c1-c4)烷氧基、(c1-c4)烷氧基(c1-c4)烷基、(c3-c4)环烷基、(c6-c10)芳基、(c1-c4)烷基取代苯基、(c1-c4)烷氧基取代苯基或苄基、卤代(c6-c10)芳基、(c6-c10)酚芳基；
r2选自一个或多个如下取代基：h、卤素、(c1-c4)烷基、卤代(c1-c4)烷基、(c1-c4)烷氧基、(c1-c4)烷氧基(c1-c4)烷基、(c3-c4)环烷基、(c6-c10)芳基、(c1-c4)烷基取代苯基、(c1-c4)烷氧基取代苯基或苄基、卤代(c6-c10)芳基、(c6-c10)酚芳基；
r3选自一个或多个如下取代基：h、卤素、(c1-c4)烷基、卤代(c1-c4)烷基、(c1-c4)烷氧基、(c1-c4)烷氧基(c1-c4)烷基、(c3-c4)环烷基、(c6-c10)芳基、(c1-c4)烷基取代苯基、(c1-c4)烷氧基取代苯基或苄基、卤代(c6-c10)芳基、(c6-c10)酚芳基；
r选自一个或多个如下取代基：h、(c2-c4)酰基、(c1-c6)烷基、(c6-c10)芳基取代酯基；(c6-c10)芳基；(c1-c6)烷氧基(c1-c6)烷基；所述芳基可以被卤素、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷氧基、硝基、氨基、羟基取代；
"---"代表单键或双键；
x为nh或o。
本发明优选定义如式ⅰ的化合物、及其药学上可接受的盐，水合物：
其中，
a环优选为：
r1选自一个或多个如下取代基：h、卤素、(c1-c4)烷基、卤代(c1-c4)烷基、(c1-c4)烷氧基、(c1-c4)烷氧基(c1-c4)烷基、(c3-c4)环烷基、(c6-c10)芳基、(c1-c4)烷基取代苯基、(c1-c4)烷氧基取代苯基或苄基、卤代(c6-c10)芳基、(c6-c10)酚芳基；
r2选自一个或多个如下取代基：h、卤素、(c1-c4)烷基、卤代(c1-c4)烷基、(c1-c4)烷氧基、(c1-c4)烷氧基(c1-c4)烷基、(c3-c4)环烷基、(c6-c10)芳基、(c1-c4)烷基取代苯基、(c1-c4)烷氧基取代苯基或苄基、卤代(c6-c10)芳基、(c6-c10)酚芳基；
r选自一个或多个如下取代基：h、(c2-c4)酰基、(c1-c4)烷基、(c6-c10)芳基取代酯基；(c6-c10)芳基；(c1-c4)烷氧基(c1-c4)烷基；所述芳基可以被卤素、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷氧基、硝基、氨基、羟基取代；
"---"代表单键或双键；
x为nh或o。
本发明还优选定义如式ⅰ的化合物、及其药学上可接受的盐，水合物：
其中，
a环优选为
r1选自一个或多个如下取代基：h、卤素、(c1-c4)烷基、卤代(c1-c4)烷基、(c1-c4)烷氧基、(c1-c4)烷氧基(c1-c4)烷基；
r2选自一个或多个如下取代基：h、卤素、(c1-c4)烷基、卤代(c1-c4)烷基、(c1-c4)烷氧基、(c1-c4)烷氧基(c1-c4)烷基；
r选自一个或多个如下取代基：h、(c2-c4)酰基、(c1-c4)烷基、(c6-c10)芳基取代酯基；苯基；苄基；(c1-c4)烷氧基(c1-c4)烷基；所述苯基或苄基可以被卤素、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷氧基、硝基、氨基或羟基取代；
"---"代表单键或双键；
x为nh或o。
本发明还优选定义如式ⅰ的化合物、及其药学上可接受的盐，水合物：
其中，
a环优选为
r1、r2为如下取代基：h、甲基、乙基、甲氧乙基、乙氧乙基、环丙甲基、苄基、对氟苄基、对甲氧基苄基、对羟基苄基；
r选自一个或多个如下取代基：h、(c2-c4)酰基、(c1-c6)烷基、(c6-c10)芳基取代酯基；苯基；苄基；(c1-c6)烷氧基(c1-c6)烷基；所述苯基或苄基可以被卤素、(c1-c6)烷基、(c1-c6)烷氧基、硝基、氨基或羟基取代；
"---"代表单键或双键；
x为nh或o。
本发明还特别优选定义如式ⅰ的化合物、及其药学上可接受的盐，水合物：
其中，
a环优选为
r1、r2优选为如下取代基：h、甲基、乙基、甲氧乙基、乙氧乙基、环丙甲基、苄基、对氟苄基、对甲氧基苄基、对羟基苄基；
r优选为h或乙酰基；
"---"代表单键或双键；
x为nh或o。
本发明还特别优选定义如式ⅰ的化合物、及其药学上可接受的盐，水合物：
其中，
a环优选为
r1、r2优选为如下取代基：h、甲基、乙基、甲氧乙基、乙氧乙基、环丙甲基、苄基、对氟苄基、对甲氧基苄基、对羟基苄基；
r优选为h或乙酰基；
y优选为-ch2-ch2-或-ch＝ch-；
x为nh或o。
具体的，本发明优选如下化合物：
n-(6-巯基己基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-巯基己基)-5,6-二氢-4h-异恶唑并[5,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-5,6-二氢-4h-异恶唑并[5,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-巯基己基)-7-甲基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-7-甲基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-巯基己基)-6-甲基-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-6-甲基-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-巯基己基)-7-苄基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-7-苄基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-巯基己基)-6-苄基-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-6-苄基-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-巯基己基)-7-(4-氟苄基)-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-7-(4-氟苄基)-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-巯基己基)-6-(4-氟苄基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-6-(4-氟苄基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-巯基己基)-7-(4-甲氧基苄基)-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-7-(4-甲氧基苄基)-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-巯基己基)-6-(4-甲氧基苄基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-6-(4-甲氧基苄基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-巯基己基)-7-(4-羟基苄基)-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-7-(4-羟基苄基)-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-巯基己基)-6-(4-羟基苄基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-6-(4-羟基苄基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-巯基己基)-6(7)h-异恶唑并[5,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰硫己基)-6(7)h-异恶唑并[5,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-巯基己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰硫己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
7-甲基-n-(6-巯基己基)-1,7-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
7-甲基-n-(6-乙酰硫己基)-1,7-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
6-甲基-n-(6-巯基己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
6-甲基-n-(6-乙酰硫己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
7-乙基-n-(6-巯基己基)-1,7-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
7-乙基-n-(6-乙酰硫己基)-1,7-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
6-乙基-n-(6-巯基己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
6-乙基-n-(6-乙酰硫己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
7-甲氧乙基-n-(6-巯基己基)-1,7-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
7-甲氧乙基-n-(6-乙酰硫己基)-1,7-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
6-甲氧乙基-n-(6-巯基己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
6-甲氧乙基-n-(6-乙酰硫己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
7-环丙甲基-n-(6-巯基己基)-1,7-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
7-环丙甲基-n-(6-乙酰硫己基)-1,7-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
6-环丙甲基-n-(6-巯基己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
6-环丙甲基-n-(6-乙酰硫己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-巯己基)-4,5-二氢-1h-吡唑并[4,3-h]异喹啉-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基巯己基)-4,5-二氢-1h-吡唑并[4,3-h]异喹啉-3-甲酰胺
n-(6-巯己基)-4,5-二氢-1h-吡唑并[4,3-h]喹啉-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基巯己基)-4,5-二氢-1h-吡唑并[4,3-h]喹啉-3-甲酰胺
n-(6-巯己基)-1h-吡唑并[4,3-h]异喹啉-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基巯己基)-1h-吡唑并[4,3-h]异喹啉-3-甲酰胺
n-(6-巯己基)-1h-吡唑并[4,3-h]喹啉-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基巯己基)-1h-吡唑并[4,3-h]喹啉-3-甲酰胺
n-(6-巯己基)-7-乙基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-7-乙基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-硫己基)-6-乙基-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-6-乙基-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-硫己基)-7-甲氧乙基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-7-甲氧乙基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-硫己基)-6-甲氧乙基-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-6-甲氧乙基-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-硫己基)-7-乙氧乙基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-7-乙氧乙基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-硫己基)-6-乙氧乙基-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-6-乙氧乙基-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-硫己基)-7-环丙甲基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-7-环丙甲基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-硫己基)-6-环丙甲基-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
n-(6-乙酰基硫己基)-6-环丙甲基-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺
或其水合物、溶剂化物、代谢化物以及药学上可接受的盐或它的前药。
此外，本发明还包括本发明化合物的前药。依据本发明，前药是式ⅰ的化合物，它们自身可能具有较弱的活性甚至没有活性，但是在给药后，在生理条件下(例如通过代谢、溶剂分解或者另外的方式)被转化成相应的生物活性形式。
本发明包括药物组合物，该组合物含有上式ⅰ所包含的片段的硫醇类化合物和药物上可接受的赋形剂。所述药物上可接受的赋形剂是指任何可用于药物领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。本发明的化合物可以与其他活性成分组合使用，只要他们不产生其他不利的作用，例如过敏反应。
本发明的药物组合物可配制成若干种剂型，其中含有药物领域中常用的一些赋形剂，例如，口服制剂(如片剂，胶囊剂，溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或者混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制剂(例如软膏或溶液)。
用于本发明药物组合物的载体是药物领域中可得到的常见类型，包括：口服制剂用的粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、色素、矫味剂等；可注射制剂用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。
通过体外抑酶试验筛选，我们发现本发明化合物可抑制组蛋白去乙酰化酶活力，因此，本发明化合物可用于制备治疗与组蛋白去乙酰化酶活性异常表达相关的疾病中的应用，如各种癌症。
通过体外活性筛选及体内药效学研究，我们发现本发明化合物具有抗肿瘤活性，因此本发明化合物可以用于制备治疗和/或预防各种癌症的药物，如乳腺、肺、结肠、直肠、胃、前列腺、膀胱、子宫、胰腺和卵巢癌。
本发明活性化合物可作为唯一抗癌药物使用，或者与一种或多种其他抗肿瘤药物联合使用。联合治疗通过将各个治疗组分同时、顺序或隔开给药来实现。
下文中提供的实施例和制备例进一步阐明和举例说明本发明化合物及其制备方法。应当理解，下述实施例和制备例的范围并不以任何方式限制本发明的范围。
下面的合成路线描述了本发明的式ⅰ化合物的制备，所有的原料都是通过这些路线中描述的方法、通过有机化学领域普通技术人员熟知的方法制备的或者可商购。本发明的全部最终化合物都是通过这些路线中描述的方法或通过与其类似的方法制备的，这些方法是有机化学领域普通技术人员熟知的。这些路线中应用的全部可变因数如下文的定义或如权利要求中的定义。
按照本发明的式ⅰ的化合物，当a环为(取代)吡唑环，"---"为双键时，按照路线一的方法制备目标化合物，各取代基如
技术实现要素：
部分所定义。
试剂和条件:(a)dmf-dma,neat,reflux,1h；(b)nh2nh2.hcl,meoh,reflux.2h；(c)rx,k2co3orkoh,mecn,reflux,2h；(d)dimethyloxalate,lihmds,thf,r.t.,4h；(e)nh2nh2.h2o,acoh,80℃,2h；(f)naoh,h2o,50℃,2h；(g)6-bromohexan-1-amine,edci,hobt,dmf,r.t.,24h；(h)ksac,etoh,reflux,4h；(i)ddq,dioxane,reflux,4h；(j)lioh,meoh,r.t.,1h.
当a环为(取代)吡唑环，"---"为单键时，按照路线二的方法制得目标化合物。其他各取代基如发明内容所定义。
试剂和条件:(a)dmf-dma,neat,reflux,1h；(b)nh2nh2.hcl,meoh,reflux.2h；(c)rx,k2co3orkoh,mecn,reflux,2h；(d)dimethyloxalate,lihmds,thf,r.t.,4h；(e)nh2nh2.h2o,acoh,80℃,2h；(f)naoh,h2o,50℃,2h；(g)6-bromohexan-1-amine,edci,hobt,dmf,r.t.,24h；(h)ksac,etoh,reflux,4h；(i)lioh,meoh,r.t.,1h.
当a环为吡啶环，"---"为单键或双键时，按照路线三的方法制得目标化合物。其他各取代基如发明内容所定义。
试剂和条件:(a)kmno4,ch3cooh,r.t.；(b)dimethyloxalate,lihmds,thf,r.t.,4h；(c)nh2nh2.h2o,ch3cooh,80℃,0.5h；(d)naoh(aq),50℃,1h；(e)6-bromohexan-1-amine,edci,hobt,dmf,r.t.,overnight；(f)ksac,c2h5oh,reflux,1h；(g)lioh(aq),ch3oh,r.t.,4h；(h)ddq,1,4-dioxane,reflux,2h.
本发明制备方法操作简单、条件温和，所得化合物均具有组蛋白去乙酰化酶抑制活性，抗肿瘤作用显著。
具体实施方式：
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1：n-(6-巯基己基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
步骤a：2-(二甲基氨基)亚甲基-1,3-环己二酮的制备
将1,3-环己二酮(50mmol)及n,n-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(dmf-dma)(100mmol)加入250ml茄型瓶中，95℃加热回流1h。随后减压蒸馏回收未反应的dmf-dma，得棕色固体，不经纯化投下一步反应。收率100％。lc-msm/z:168.2[m+h]+。
步骤b：2,5,6,7-四氢-4h-吲唑-4-酮的制备
将2-(二甲基氨基)亚甲基-1,3-环己二酮(50mmol)溶解于甲醇中(100ml)，随后加入盐酸肼(55mmol)，加热60℃反应2h。随后除去反应不溶物，将滤液蒸干得棕色固体，不经纯化投下一步反应。收率100％。lc-msm/z:137.2[m+h]+.
步骤c：2-三苯基甲基-6,7-二氢-2h-吲唑-4(5h)-酮的制备
将2,5,6,7-四氢-4h-吲唑-4-酮(10mmol)溶解于二氯甲烷中(50ml)，随后加入三乙胺(20mmol)，三苯基甲基氯(11mmol)，加热80℃反应4h。随后除去反应溶剂，石油醚重结晶，得白色固体。收率88％。lc-msm/z:179.3[m+h]+.
步骤d：1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-羧酸甲酯的制备
将2-三苯基甲基-6,7-二氢-2h-吲唑-4(5h)-酮(10mmol)溶解于四氢呋喃中(50ml)，随后加入草酸二甲酯(12mmol)，缓慢滴入lihmds(1minthf,12mmol)，室温反应4h。除去反应液，复溶于醋酸中(50ml)，加入水合肼(80％,12mmol)，加热80℃反应4h。待反应液冷却至室温，将反应液倒入水中(100ml)，析出大量固体，抽滤，收集滤饼，得白色固体。收率62％。lc-msm/z:219.1[m+h]+.
步骤e：n-(6-乙酰基硫己基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
将1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-羧酸甲酯(8mmol)溶解于甲醇中(10mmol)，加入氢氧化钠(10mmol)的水溶液，加热50℃反应4h。待反应液冷却至室温，以0.5m盐酸调ph＝2,析出大量固体，抽滤，收集滤饼，真空干燥。随后复溶于dmf中(50ml)，冰浴下依次加入hobt(10mmol)，6-溴-1-己胺(10mmol)，edci(10mmol)，室温反应24h。随后将反应液倒入水中(100ml)，乙酸乙酯萃取(60ml×3)，有机层合并，饱和氯化钠溶液反洗，无水硫酸钠干燥。随后复溶于乙醇中(50ml)，加入硫代乙酸钾(10mmol)，加热60℃反应4h。除去溶剂，硅胶柱层析分离，得白色固体。收率42％。lc-msm/z:362.3[m+h]+.
步骤f：n-(6-乙酰硫己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
将n-(6-乙酰基硫己基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺(5mmol)溶解于二氧六环中(50ml)，加入二氯二氰基苯醌(ddq,10mmol)，加热100℃反应2h。待反应液冷却至室温，加入饱和碳酸氢钠淬灭反应，将反应液倒入水中(100ml)，乙酸乙酯萃取(60ml×3)，有机层合并，饱和氯化钠反洗，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析分离，得白色固体。收率58％。lc-msm/z:360.2[m+h]+.
步骤g：n-(6-巯基己基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
将n-(6-乙酰基硫己基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺(3mmol)溶解于甲醇中(10ml)，加入氢氧化锂溶液(1.2m,3.3mmol)，室温反应4h。随后以0.5m盐酸调ph＝2，将反应液倒入大量水中(100ml)，乙酸乙酯萃取(60ml×3)，有机层合并，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析分离。得白色固体。收率61％。lc-msm/z:320.0[m+h]+.
按照实施例1的制备方法，选择适当的原料，制得实施例2-实施例60的化合物。
实施例2：n-(6-乙酰基硫己基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:362.3[m+h]+.
实施例3：n-(6-巯基己基)-5,6-二氢-4h-异恶唑并[5,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:320.1[m+h]+.
实施例4：n-(6-乙酰基硫己基)-5,6-二氢-4h-异恶唑并[5,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:363.2[m+h]+.
实施例5：n-(6-巯基己基)-7-甲基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:333.2[m+h]+.
实施例6：n-(6-乙酰基硫己基)-7-甲基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:376.3[m+h]+.
实施例7：n-(6-巯基己基)-6-甲基-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:333.2[m+h]+.
实施例8：n-(6-乙酰基硫己基)-6-甲基-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:376.3[m+h]+.
实施例9：n-(6-巯基己基)-7-苄基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:409.2[m+h]+.
实施例10：n-(6-乙酰基硫己基)-7-苄基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:452.3[m+h]+.
实施例11：n-(6-巯基己基)-6-苄基-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:409.2[m+h]+.
实施例12：n-(6-乙酰基硫己基)-6-苄基-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:452.3[m+h]+.
实施例13：n-(6-巯基己基)-7-(4-氟苄基)-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:427.2[m+h]+.
实施例14：n-(6-乙酰基硫己基)-7-(4-氟苄基)-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:470.3[m+h]+.
实施例15：n-(6-巯基己基)-6-(4-氟苄基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:427.2[m+h]+.
实施例16：n-(6-乙酰基硫己基)-6-(4-氟苄基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:470.3[m+h]+.
实施例17：n-(6-巯基己基)-7-(4-甲氧基苄基)-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:439.1[m+h]+.
实施例18：n-(6-乙酰基硫己基)-7-(4-甲氧基苄基)-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:482.2[m+h]+.
实施例19：n-(6-巯基己基)-6-(4-甲氧基苄基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:439.1[m+h]+.
实施例20：n-(6-乙酰基硫己基)-6-(4-甲氧基苄基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:482.2[m+h]+.
实施例21：n-(6-巯基己基)-7-(4-羟基苄基)-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:425.1[m+h]+.
实施例22：n-(6-乙酰基硫己基)-7-(4-羟基苄基)-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:468.2[m+h]+.
实施例23：n-(6-巯基己基)-6-(4-羟基苄基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:425.1[m+h]+.
实施例24：n-(6-乙酰基硫己基)-6-(4-羟基苄基)-1,4,5,6-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:468.2[m+h]+.
实施例25：n-(6-巯己基)-7-乙基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:346.0[m-h]+.
实施例26：n-(6-乙酰基硫己基)-7-乙基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:389.1[m+h]+.
实施例27：n-(6-硫己基)-6-乙基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:346.0[m+h]+.
实施例28：n-(6-乙酰基硫己基)-6-乙基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:389.1[m+h]+.
实施例29：n-(6-硫己基)-7-甲氧乙基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:376.0[m-h]+.
实施例30：n-(6-乙酰基硫己基)-7-甲氧乙基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:420.1[m+h]+.
实施例31：n-(6-硫己基)-6-甲氧乙基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:376.0[m-h]+.
实施例32：n-(6-乙酰基硫己基)-6-甲氧乙基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:420.1[m+h]+.
实施例33：n-(6-硫己基)-7-乙氧乙基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:390.1[m-h]+.
实施例34：n-(6-乙酰基硫己基)-7-乙氧乙基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:434.2[m+h]+.
实施例35：n-(6-硫己基)-6-乙氧乙基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:390.1[m-h]+.
实施例36：n-(6-乙酰基硫己基)-6-乙氧乙基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:434.2[m+h]+.
实施例37：n-(6-硫己基)-7-环丙甲基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:372.0[m-h]+.
实施例38：n-(6-乙酰基硫己基)-7-环丙甲基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:416.3[m+h]+.
实施例39：n-(6-硫己基)-6-环丙甲基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:372.0[m-h]+.
实施例40：n-(6-乙酰基硫己基)-6-环丙甲基-1,4,5,7-四氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:416.3[m+h]+.
实施例41：n-(6-巯基己基)-6(7)h-异恶唑并[5,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:319.0[m+h]+.
实施例42：n-(6-乙酰硫己基)-6(7)h-异恶唑并[5,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:361.2[m+h]+.
实施例43：n-(6-巯基己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:318.1[m+h]+.
实施例44：n-(6-乙酰硫己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:360.2[m+h]+.
实施例45：7-甲基-n-(6-巯基己基)-1,7-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:332.0[m+h]+.
实施例46：7-甲基-n-(6-乙酰硫己基)-1,7-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:374.3[m+h]+.
实施例47：6-甲基-n-(6-巯基己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:332.1[m+h]+.
实施例48：6-甲基-n-(6-乙酰硫己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:374.3[m+h]+.
实施例49：7-乙基-n-(6-巯基己基)-1,7-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:346.3[m+h]+.
实施例50：7-乙基-n-(6-乙酰硫己基)-1,7-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:388.2[m+h]+.
实施例51：6-乙基-n-(6-巯基己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:346.2[m+h]+.
实施例52：6-乙基-n-(6-乙酰硫己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:388.3[m+h]+.
实施例53：7-甲氧乙基-n-(6-巯基己基)-1,7-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:376.0[m+h]+.
实施例54：7-甲氧乙基-n-(6-乙酰硫己基)-1,7-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:418.2[m+h]+.
实施例55：6-甲氧乙基-n-(6-巯基己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:376.1[m+h]+.
实施例56：6-甲氧乙基-n-(6-乙酰硫己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:418.3[m+h]+.
实施例57：7-环丙甲基-n-(6-巯基己基)-1,7-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:372.3[m+h]+.
实施例58：7-环丙甲基-n-(6-乙酰硫己基)-1,7-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:414.2[m+h]+.
实施例59：6-环丙甲基-n-(6-巯基己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:372.2[m+h]+.
实施例60：6-环丙甲基-n-(6-乙酰硫己基)-1,6-二氢吡唑并[3,4-e]吲唑-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:414.3[m+h]+.
实施例61：n-(6-巯己基)-4,5-二氢-1h-吡唑并[4,3-h]异喹啉-3-甲酰胺的制备
步骤a：6,7-二氢异喹啉-8(5h)-酮的制备
将5,6,7,8-四氢异喹啉溶于乙酸中，加入1.2当量的高锰酸钾，室温下搅拌反应8h，向反应液中加水，用大量的二氯甲烷萃取，经快速中压制备液相分离纯化得无色粘稠油状物质，收率15％。lc-msm/z:148.1[m+h]+。
步骤b：4,5-二氢-1h-吡唑并[4,3-h]异喹啉-3-羧酸甲酯的制备
将6,7-二氢异喹啉-8(5h)-酮(10mmol)溶解于四氢呋喃中(50ml)，随后加入草酸二甲酯(12mmol)，缓慢滴入lihmds(1minthf,12mmol)，室温反应4h。除去反应液，复溶于醋酸中(50ml)，加入水合肼(80％,12mmol)，加热80℃反应1h。待反应液冷却至室温，将反应液倒入水中(100ml)，析出大量固体，抽滤，收集滤饼，得粗品，经快速中压制备液相分离纯化，得淡黄色固体，收率为60％。lc-msm/z:230.2[m+h]+。
步骤c：n-(6-溴己基)-4,5-二氢-1h-吡唑并[4,3-h]异喹啉-3-甲酰胺的制备
将4,5-二氢-1h-吡唑并[4,3-h]异喹啉-3-羧酸甲酯(8mmol)溶解于甲醇中(10mmol)，加入氢氧化钠(0.1m,10mmol)的水溶液，加热50℃反应1h。待反应液冷却至室温，以0.5m盐酸调ph＝3，析出大量固体，抽滤，收集滤饼，真空干燥。随后复溶于dmf中(50ml)，三乙胺调ph为弱碱性(7～8)，冰浴下依次加入hobt(10mmol)，6-溴-1-己胺(10mmol)，edci(10mmol)，室温反应24h。随后将反应液倒入水中(100ml)，乙酸乙酯萃取(60ml×3)，有机层合并，饱和氯化钠溶液反洗，无水硫酸钠干燥，经快速中压制备液相分离纯化，得淡黄色油状粘稠物体，收率为55％。lc-msm/z:377.1[m+h]+。
步骤d：n-(6-乙酰基巯己基)-4,5-二氢-1h-吡唑并[4,3-h]异喹啉-3-甲酰胺的制备
将n-(6-溴己基)-4,5-二氢-1h-吡唑并[4,3-h]异喹啉-3-甲酰胺溶于乙醇中，加入硫代乙酸钾(10mmol)，加热60℃反应1h。除去溶剂，经快速中压制备液相分离纯化得淡黄色油状粘稠物体，收率为91％。lc-msm/z:373.4[m+h]+。
步骤e：n-(6-乙酰基巯己基)-1h-吡唑并[4,3-h]异喹啉-3-甲酰胺的制备
将n-(6-乙酰基巯己基)-4,5-二氢-1h-吡唑并[4,3-h]异喹啉-3-甲酰胺(5mmol)溶解于二氧六环中(50ml)，加入二氯二氰基苯醌(ddq,10mmol)，加热100℃反应2h。待反应液冷却至室温，加入饱和碳酸氢钠淬灭反应，将反应液倒入水中(100ml)，乙酸乙酯萃取(60ml×3)，有机层合并，饱和氯化钠反洗，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析分离，得白色固体；收率75％。lc-msm/z:371.1[m+h]+。
步骤f：n-(6-巯己基)-4,5-二氢-1h-吡唑并[4,3-h]异喹啉-3-甲酰胺的制备
将n-(6-乙酰基巯己基)-4,5-二氢-1h-吡唑并[4,3-h]异喹啉-3-甲酰胺(3mmol)溶解于乙醇中(10ml)，加入氢氧化锂溶液(1.2m,3.3mmol)，室温反应4h。随后以0.5m盐酸调ph＝2，将反应液倒入大量水中(100ml)，乙酸乙酯萃取(60ml×3)，有机层合并，无水硫酸钠干燥，快速中压制备液相分离纯化，得淡黄色固体，收率为45％。lc-msm/z:328.8[m-h]-。
按照实施例61的制备方法，选择适当的原料，制得实施例62-实施例68的化合物。
实施例62：n-(6-乙酰基巯己基)-4,5-二氢-1h-吡唑并[4,3-h]异喹啉-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:373.2[m+h]+.
实施例63：n-(6-巯己基)-4,5-二氢-1h-吡唑并[4,3-h]喹啉-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:329.4[m-h]-.
实施例64：n-(6-乙酰基巯己基)-4,5-二氢-1h-吡唑并[4,3-h]喹啉-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:373.4[m+h]+.
实施例65：n-(6-巯己基)-1h-吡唑并[4,3-h]异喹啉-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:327.0[m-h]-.
实施例66：n-(6-乙酰基巯己基)-1h-吡唑并[4,3-h]异喹啉-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:371.1[m+h]+.
实施例67：n-(6-巯己基)-1h-吡唑并[4,3-h]喹啉-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:372.2[m-h]-.
实施例68：n-(6-乙酰基巯己基)-1h-吡唑并[4,3-h]喹啉-3-甲酰胺的制备
lc-msm/z:371.0[m+h]+.
实施例69.本发明产物的药理作用研究
实验设阳性对照组(伏立诺他和acy-1215)。以hela细胞核提取物(enzolifesciences,usa)为hdacs酶源，重组rhdac1、2、3及rhdac6蛋白(bpsbioscience,usa)为亚型酶源。所有反应均在96孔板中进行。反应缓冲液包含25mmtris-hcl(ph8.0)，137mmnacl，2.7mmkcl，1mmmgcl2及0.1mg/mlbsa。梯度浓度的化合物溶液(5μl)及酶(5μl)于25℃预孵育15min，随后加入荧光底物boc–lys(ac)–amc(5μl)起始反应，于37℃孵育60min。最后向体系中加入含trypsin及saha的终止缓冲液(25μl)，再孵育10min。以激发波长355nm，发射波长460nm，测量荧光强度(thermoscientificvarioskanflashstation)。以graphpad计算ic50。目标化合物对hdac的抑制活性见表1。
表一目标化合物对hdac酶的抑制活性
and代表没有活性、测不出活性或者没有测试该亚型的活性。
b所测结果是至少两个独立测定值的平均值，用标准偏差表示，表示为ic50±sd。
上述实验结果表明，本发明要保护的通式的化合物具有良好的抗肿瘤活性和hdac抑制作用。本发明的化合物具有很好的工业应用前景。