本发明涉及肽类药物制造
技术领域：
，具体涉及一种发酵生产杆菌肽的方法。
背景技术：
：杆菌肽，化学式为c66h103n17o16s，是一种白色或淡黄色的粉末，其抗菌谱与青霉素相似，对革兰阳性细菌和阴性球菌、肺炎双球菌、葡萄球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌及螺旋体等均有杀菌作用，因此具有很高的医用价值。但是在现代化的大规模生产过程中仍存在各种不足，例如生产成本高、杆菌肽最终效价低以及生产周期偏长等各种不足。专利号为cn106893751a的发明公开了一种发酵生产杆菌肽的方法，该方法通过优化有机复合氮源和发酵条件，保证了批次间发酵单位的稳定性，降低了杂质f含量以及在杆菌肽合成期间添加超顺磁性微球，降低发酵产物对产生菌的反馈抑制。该制备方法虽然在生产成本上面有所降低，但是其生产得到的杆菌肽极易受到氧化而被破坏，从而极大的降低了杆菌肽的最终效价。因此，发明一种能提高杆菌肽最终效价的生产杆菌肽的方法是一项有待解决的技术问题。技术实现要素：(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种城市污泥槽式发酵工艺。(二)技术方案本发明通过以下技术方案予以实现：一种发酵生产杆菌肽的方法，包括以下步骤：1)发酵液预处理：取重量为1000份的发酵液，并向发酵液中加入重量为30-60份的硫代硫酸钠后搅拌均匀，再将发酵液泵入预处理罐内，加入酸化剂调节ph至2.5-3.0，搅拌1h；2)树脂吸附：向步骤1中酸化后的发酵液中加入液碱调节ph至4.0-4.5，然后按放罐效价投入001×1.1-h+吸附树脂对杆菌肽吸附3-6h，使得吸附尾液中杆菌肽含量不超过50u/ml；3)树脂分离、漂洗：吸附完成后的树脂经树脂分离器将饱和树脂和料液分离，然后用去离子水漂洗至水清澈且无漂浮物；4)解析脱氨：漂洗后的树脂经过真空抽入解析柱内，然后用去离子水对树脂全方位清洗至水澄清后，通入浓度为2.5-3.5％的氨水进行解析，并将解析液经脱氨柱内001×14-h+脱氨树脂进行脱氨，当脱氨液由无色变为浅黄色时，收集脱氨液于储存罐中，并加入重量为2-8份硫代硫酸钠，当脱氨柱出口的脱氨液ph≧8.5时，停止收集；5)一次纳滤：将步骤4中的收集液通过纳膜浓缩至原体积8-10％；6)萃取浓缩：将一次纳滤后的浓缩液放入萃取罐中，并加入重量为2-5份的硫代硫酸钠，充分搅拌后加入萃取剂进行萃取，向萃取液中加入沉淀剂后，沉淀过滤后，对滤液进行浓缩干燥即得杆菌肽。优选地，所述步骤1中酸化剂为草酸、醋酸和稀硫酸中的任一种。优选地，所述步骤2中的吸附树脂按放罐效价菌投放具体分为1400l、1600l、1800l、2000l和2200l五类大小，其对应的杆菌肽效价分别为≦400u/ml、401-500u/ml、501-600u/ml、601-700u/ml以及701-800u/ml。优选地，所述步骤4中解析速度为300-400l/h。优选地，所述步骤5中的纳膜浓缩的系统压力为0.4-1.5mpa，且浓缩过程中不产生背压。优选地，所述步骤6中的萃取剂为乙醇、正丁醇和乙酸丁酯其中的任一种。优选地，所述步骤6中的的萃取是在搅拌速度为30-50r/min的搅拌作用下，萃取20-30min。优选地，所述步骤6中的沉淀剂为乙醚、氯仿或丙酮中的任一种，且沉淀剂用量为萃取剂体积的2-3倍。(三)有益效果本发明在对发酵液预处理的过程中加入足量的硫代硫酸钠，有效防止发酵液中溶液微量的氧气对杆菌肽造成氧化，从而保证了所得到的发酵液杆菌肽的效价高于普通发酵得到的杆菌肽，另外本发明对发酵液酸化后的处理在密封罐中进行，后续的解析脱氨也是在真空的解析柱内处理，极大程度上隔绝了生产过程中杆菌肽受氧化造成的最终效价低的不足，能够有而且本发明操作简单、制备周期短，可用于大量工业生产杆菌肽。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1：一种发酵生产杆菌肽的方法，包括以下步骤：1)发酵液预处理：取重量为1吨的发酵液，并向发酵液中加入重量为50kg的硫代硫酸钠后搅拌均匀，再将发酵液泵入预处理罐内，加入草酸调节ph至2.5-3.0，搅拌1h；2)树脂吸附：向步骤1中酸化后的发酵液中加入氨水调节ph至4.0-4.5，并检测发酵液中杆菌肽的效价，投入1600l的001×1.1-h+吸附树脂对杆菌肽吸附5h，使得吸附尾液中杆菌肽含量不超过50u/ml；3)树脂分离、漂洗：吸附完成后的树脂经树脂分离器将饱和树脂和料液分离，然后用去离子水漂洗至水清澈且无漂浮物；4)解析脱氨：漂洗后的树脂经过真空抽入解析柱内，然后用去离子水对树脂全方位清洗至水澄清后，通入浓度为3.0％的氨水，以350l/h的解析速度进行解析，并将解析液经脱氨柱内001×14-h+脱氨树脂进行脱氨，当脱氨液由无色变为浅黄色时，收集脱氨液于储存罐中，并加入重量为6kg硫代硫酸钠，当脱氨柱出口的脱氨液ph≧8.5时，停止收集，得到1200l的收集液；5)一次纳滤：将步骤4中的收集液通过纳膜浓缩至原体积10l，其中系统压力为0.8mpa，且浓缩过程中不产生背压；6)萃取浓缩：将一次纳滤后的浓缩液放入为8l的正丁醇入罐中，并加入重量为3kg的硫代硫酸钠，充分搅拌后剂进行萃取，其中萃取是在搅拌速度为35r/min的搅拌作用下萃取30min，萃取完成后向萃取液中加入20l的丙酮，沉淀过滤后，对滤液进行浓缩干燥即得杆菌肽。实施例2：一种发酵生产杆菌肽的方法，包括以下步骤：1)发酵液预处理：取重量为1吨的发酵液，并向发酵液中加入重量为35kg的硫代硫酸钠后搅拌均匀，再将发酵液泵入预处理罐内，加入草酸调节ph至2.5-3.0，搅拌1h；2)树脂吸附：向步骤1中酸化后的发酵液中加入氨水调节ph至4.0-4.5，并检测发酵液中杆菌肽的效价，投入1400l的001×1.1-h+吸附树脂对杆菌肽吸附5h，使得吸附尾液中杆菌肽含量不超过50u/ml；3)树脂分离、漂洗：吸附完成后的树脂经树脂分离器将饱和树脂和料液分离，然后用去离子水漂洗至水清澈且无漂浮物；4)解析脱氨：漂洗后的树脂经过真空抽入解析柱内，然后用去离子水对树脂全方位清洗至水澄清后，通入浓度为3.0％的氨水，以350l/h的解析速度进行解析，并将解析液经脱氨柱内001×14-h+脱氨树脂进行脱氨，当脱氨液由无色变为浅黄色时，收集脱氨液于储存罐中，并加入重量为3kg硫代硫酸钠，当脱氨柱出口的脱氨液ph≧8.5时，停止收集，得到1160l的收集液；5)一次纳滤：将步骤4中的收集液通过纳膜浓缩至原体积10l，其中系统压力为0.8mpa，且浓缩过程中不产生背压；6)萃取浓缩：将一次纳滤后的浓缩液放入为8l的正丁醇入罐中，并加入重量为2kg的硫代硫酸钠，充分搅拌后剂进行萃取，其中萃取是在搅拌速度为40r/min的搅拌作用下萃取25min，萃取完成后向萃取液中加入20l的丙酮，沉淀过滤后，对滤液进行浓缩干燥即得杆菌肽。实施例3：一种发酵生产杆菌肽的方法，包括以下步骤：1)发酵液预处理：取重量为1吨的发酵液，并向发酵液中加入重量为55kg的硫代硫酸钠后搅拌均匀，再将发酵液泵入预处理罐内，加入草酸调节ph至2.5-3.0，搅拌1h；2)树脂吸附：向步骤1中酸化后的发酵液中加入氨水调节ph至4.0-4.5，并检测发酵液中杆菌肽的效价，投入1600l的001×1.1-h+吸附树脂对杆菌肽吸附4.5h，使得吸附尾液中杆菌肽含量不超过50u/ml；3)树脂分离、漂洗：吸附完成后的树脂经树脂分离器将饱和树脂和料液分离，然后用去离子水漂洗至水清澈且无漂浮物；4)解析脱氨：漂洗后的树脂经过真空抽入解析柱内，然后用去离子水对树脂全方位清洗至水澄清后，通入浓度为3.0％的氨水，以320l/h的解析速度进行解析，并将解析液经脱氨柱内001×14-h+脱氨树脂进行脱氨，当脱氨液由无色变为浅黄色时，收集脱氨液于储存罐中，并加入重量为8kg硫代硫酸钠，当脱氨柱出口的脱氨液ph≧8.5时，停止收集，得到1080l的收集液；5)一次纳滤：将步骤4中的收集液通过纳膜浓缩至原体积9l，其中系统压力为0.8mpa，且浓缩过程中不产生背压；6)萃取浓缩：将一次纳滤后的浓缩液放入为8l的正丁醇罐中，并加入重量为5kg的硫代硫酸钠，充分搅拌后剂进行萃取，其中萃取是在搅拌速度为35r/min的搅拌作用下萃取30min，萃取完成后向萃取液中加入20l的丙酮，沉淀过滤后，对滤液进行浓缩干燥即得杆菌肽。实施例4：一种发酵生产杆菌肽的方法，包括以下步骤：1)发酵液预处理：取重量为1吨的发酵液，并向发酵液中加入重量为45kg的硫代硫酸钠后搅拌均匀，再将发酵液泵入预处理罐内，加入草酸调节ph至2.5-3.0，搅拌1h；2)树脂吸附：向步骤1中酸化后的发酵液中加入氢氧化钠调节ph至4.0-4.5，并检测发酵液中杆菌肽的效价，投入1800l的001×1.1-h+吸附树脂对杆菌肽吸附4h，使得吸附尾液中杆菌肽含量不超过50u/ml；3)树脂分离、漂洗：吸附完成后的树脂经树脂分离器将饱和树脂和料液分离，然后用去离子水漂洗至水清澈且无漂浮物；4)解析脱氨：漂洗后的树脂经过真空抽入解析柱内，然后用去离子水对树脂全方位清洗至水澄清后，通入浓度为2.5％的氨水，以350l/h的解析速度进行解析，并将解析液经脱氨柱内001×14-h+脱氨树脂进行脱氨，当脱氨液由无色变为浅黄色时，收集脱氨液于储存罐中，并加入重量为5kg硫代硫酸钠，当脱氨柱出口的脱氨液ph≧8.5时，停止收集，得到1260l的收集液；5)一次纳滤：将步骤4中的收集液通过纳膜浓缩至原体积11l，其中系统压力为0.8mpa，且浓缩过程中不产生背压；6)萃取浓缩：将一次纳滤后的浓缩液放入为10l的正丁醇入罐中，并加入重量为4kg的硫代硫酸钠，充分搅拌后剂进行萃取，其中萃取是在搅拌速度为45r/min的搅拌作用下萃取30min，萃取完成后向萃取液中加入20l的丙酮，沉淀过滤后，对滤液进行浓缩干燥即得杆菌肽。实施例5：一种发酵生产杆菌肽的方法，包括以下步骤：1)发酵液预处理：取重量为1吨的发酵液，并向发酵液中加入重量为50kg的硫代硫酸钠后搅拌均匀，再将发酵液泵入预处理罐内，加入草酸调节ph至2.5-3.0，搅拌1h；2)树脂吸附：向步骤1中酸化后的发酵液中加入氨水调节ph至4.0-4.5，并检测发酵液中杆菌肽的效价，投入1600l的001×1.1-h+吸附树脂对杆菌肽吸附5.5h，使得吸附尾液中杆菌肽含量不超过50u/ml；3)树脂分离、漂洗：吸附完成后的树脂经树脂分离器将饱和树脂和料液分离，然后用去离子水漂洗至水清澈且无漂浮物；4)解析脱氨：漂洗后的树脂经过真空抽入解析柱内，然后用去离子水对树脂全方位清洗至水澄清后，通入浓度为3.5％的氨水，以300l/h的解析速度进行解析，并将解析液经脱氨柱内001×14-h+脱氨树脂进行脱氨，当脱氨液由无色变为浅黄色时，收集脱氨液于储存罐中，并加入重量为6kg硫代硫酸钠，当脱氨柱出口的脱氨液ph≧8.5时，停止收集，得到1050l的收集液；5)一次纳滤：将步骤4中的收集液通过纳膜浓缩至原体积8l，其中系统压力为0.8mpa，且浓缩过程中不产生背压；6)萃取浓缩：将一次纳滤后的浓缩液放入为8l的乙酸丁酯入罐中，并加入重量为3kg的硫代硫酸钠，充分搅拌后剂进行萃取，其中萃取是在搅拌速度为35r/min的搅拌作用下萃取30min，萃取完成后向萃取液中加入20l的丙酮，沉淀过滤后，对滤液进行浓缩干燥即得杆菌肽。对比组1：1)发酵液预处理：取重量为1吨的发酵液泵入预处理罐内，加入草酸调节ph至2.5-3.0，搅拌1h；2)树脂吸附：向步骤1中酸化后的发酵液中加入氨水调节ph至4.0-4.5，并检测发酵液中杆菌肽的效价，投入1600l的001×1.1-h+吸附树脂对杆菌肽吸附5h，使得吸附尾液中杆菌肽含量不超过50u/ml；3)树脂分离、漂洗：吸附完成后的树脂经树脂分离器将饱和树脂和料液分离，然后用去离子水漂洗至水清澈且无漂浮物；4)解析脱氨：漂洗后的树脂经过真空抽入解析柱内，然后用去离子水对树脂全方位清洗至水澄清后，通入浓度为3.0％的氨水，以350l/h的解析速度进行解析，并将解析液经脱氨柱内001×14-h+脱氨树脂进行脱氨，当脱氨液由无色变为浅黄色时，收集脱氨液于储存罐中，当脱氨柱出口的脱氨液ph≧8.5时，停止收集，得到1200l的收集液；5)一次纳滤：将步骤4中的收集液通过纳膜浓缩至原体积10l，其中系统压力为0.8mpa，且浓缩过程中不产生背压；6)萃取浓缩：将一次纳滤后的浓缩液放入为8l的正丁醇入罐中进行萃取，其中萃取是在搅拌速度为35r/min的搅拌作用下萃取30min，萃取完成后向萃取液中加入20l的丙酮，沉淀过滤后，对滤液进行浓缩干燥即得杆菌肽。对比组2：1)发酵液预处理：取重量为1吨的发酵液，并向发酵液中加入重量为50kg的硫代硫酸钠后搅拌均匀，再将发酵液倒入开口槽中，加入草酸调节ph至2.5-3.0，搅拌1h；2)树脂吸附：向步骤1中酸化后的发酵液中加入氨水调节ph至4.0-4.5，并检测发酵液中杆菌肽的效价，投入1600l的001×1.1-h+吸附树脂对杆菌肽吸附5h，使得吸附尾液中杆菌肽含量不超过50u/ml；3)树脂分离、漂洗：吸附完成后的树脂经树脂分离器将饱和树脂和料液分离，然后用去离子水漂洗至水清澈且无漂浮物；4)解析脱氨：漂洗后的树脂经过抽入解析柱内(非真空)，然后用去离子水对树脂全方位清洗至水澄清后，通入浓度为3.0％的氨水，以350l/h的解析速度进行解析，并将解析液经脱氨柱内001×14-h+脱氨树脂进行脱氨，当脱氨液由无色变为浅黄色时，收集脱氨液于储存罐中，并加入重量为6kg硫代硫酸钠，当脱氨柱出口的脱氨液ph≧8.5时，停止收集，得到1200l的收集液；5)一次纳滤：将步骤4中的收集液通过纳膜浓缩至原体积10l，其中系统压力为0.8mpa，且浓缩过程中不产生背压；6)萃取浓缩：将一次纳滤后的浓缩液放入为8l的正丁醇入罐中，并加入重量为3kg的硫代硫酸钠，充分搅拌后剂进行萃取，其中萃取是在搅拌速度为35r/min的搅拌作用下萃取30min，萃取完成后向萃取液中加入20l的丙酮，沉淀过滤后，对滤液进行浓缩干燥即得杆菌肽。为对比本发明的有益效果，取实施例1至对比组2制备的杆菌肽进行最终效价测定，并记录数据如下表1：表1实施例\性能杆菌肽最终效价u/ml实施例11024实施例2967实施例31031实施例41064实施例51057对比组1694对比组2786从表1可以看出，本发明制备的杆菌肽的最终效价与对比组1不加硫代硫酸钠以及对比组2不隔绝空气下操作，有实质性的提升，增加了杆菌肽的医用价值。从以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。当前第1页12