一种非零等梯度电场介电泳微粒分选方法与流程

本发明属于电学方法分离粒子的
技术领域：
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背景技术：
：微粒(包含细胞)分选具有重要的意义：(1)循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell)简称ctc，通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞。在血液中分选出ctc对预后评估、复发风险评估、疗效监测、个性化医疗都具有重要的意义。(2)循环胎儿细胞由于具有全套的婴儿基因，在孕妇血液中分离出循环胎儿细胞，进一步进基因分析，其分选对于无创产前诊断具有重要的意义。介电泳作为一种电学分离粒子的方法，具有小型化、低成本、操作简单等优点，近年来受到广泛的关注。介电泳是指介电粒子在非均匀电场下受力的现象，当施加信号一定(包括幅值和频率)时，介电力大小和三个因素有关系：粒子本身的电学特性和形态特性；溶液的电学特性；电场梯度的大小。因此介电泳法可以基于粒子的电学特性和形态特性对粒子进行分选。由于介电力的大小与电场的梯度有关，目前采用的介电力芯片的电场在空间分布都是非等梯度电场或梯度为零等梯度电场(平行金属板产生的均匀电场即为梯度为0的等梯度电场，不会产生介电效应)，造成同种粒子在不同位置的介电力可能不同，不同粒子在不同位置上的介电力可能相等，这使得粒子的分辨率大大降低，增加了分选的随机性，使得粒子分选纯度难以提高。本项目提出了非零等梯度介电泳分选法，能够实现基于粒子的电学特性和形态特性对粒子进行分离，且进一步提高粒子分选的分辨率。非零等梯度电场即在某一空间内电场梯度等于一个非零常数。为了实现非零等梯度电场介电泳，本设计提出了基于光电导材料的生产大空间等电场梯度介电泳的方法(大空间在这里指非零等梯度电场空间占电极间空间的80％以上)。技术实现要素：本发明首次提出了非零等梯度电场介电泳，并提出利用光电导材料实现等梯度电场构建，利用等梯度电场介电泳实现高分辨率介电泳微粒分选方案。目前为止，由于传统电极的限制，难于形成大空间范围的非零等梯度电场，因此目前报道的介电泳分选方法基本全部采用了非等梯度电场。本专利首次提出了等梯度电场介电泳，同时提出了利用光电导材料实现等梯度电场构建的方法，并验证了其可以提高细胞分选分辨率。一种非零等梯度电场介电泳微粒分选方法，其特征在于：构建非零等梯度电场实现非零等梯度电场介电泳分选粒子的直径从亚微米到数百微米。进一步，非零等梯度电场应该大于粒径的1.5倍。基于光电导材料的非零等梯度电场器件，包含上下两层，上下每层至少包括基底，导电层，光电导材料在上下两层一个导电层上有或者两个导电层上都有；其中，基底为透明支撑材料，导电层为透明导电材料，光导层通过光强的变化实现光电导层电导率的改变，从而改变施加在溶液上的电压，进一步实现对电场分布的控制。进一步，构建等梯度电场的方法如下：(1)标定光电导材料的性能，即电导随光强变化的规律；(2)根据所设计的芯片尺寸，即上下两层的大小以及他们的间距，在有限元仿真软件中建立模型，设置光电导材料的电导率分布，并仿真电场分布，使其最终能够形成等梯度电场；设置电导率的方法如下(a)：首先选择一个电场梯度的方向，此方向平行于上、下基底；(b)：在这个方向上改变电导率的分布，其按照公式δ＝a+byc进行设置，其中δ为电导率，y为选定的梯度方向上距离；a，b，c为参数；首先设置a，b，c初始值，然后根据仿真结果修正参数，若发现电场梯度沿着梯度方向降低，则增加c的值，若发现电场梯度沿着梯度方向升高，则降低c值；(3)基于光电导材料的特性数据和将所设置的电导率分布推导出光强的分布。实验系统包括投影仪、能够将投影仪的像缩小的物镜，非零等梯度电场芯片，显微镜ccd，函数发生器，计算机以及注射泵；投影仪在电脑的控制下产生不同光强分布的像，其通过物镜投射到非等梯度电场芯片上，因此芯片的光电导层的一面朝向投影仪；注射器将粒子或者细胞注入到芯片内部；函数发生器产生正弦信号，施加在芯片两端，产生介电效应；通过显微镜和ccd从芯片的上面观察到分选的过程。附图说明图1(a)梯度为零的电场；(b)非等梯度电场；(c)非等梯度电场。图2等梯度电场器件基本结构图3结构图和控制原理图4实验系统图图5a仿真模型图；b电场分布图；c不同高度不同位置的电场梯度(横坐标为y方向的位置，上下两层中间的空间高度为0.6mm)图6电场粒子分离仿真结果示意图(a)等梯度电场(b)非等梯度电场具体实施方式非零等梯度电场是指在所研究的空间范围内，电场强度的梯度相等且不为零。多数情况，常规的导电体产生的电场梯度为零，如平行金属板，或者为非等梯度电场，如点电极和面电极形成的电场或点电极与点电极形成的电长，在一定的空间内是非等梯度电场,如图2所示。本专利提出了一种灵活构建等梯度电场的方案：基于光电导材料的非零等梯度电场器件，其基本结构如图2所示。主要包含上下两层，每层包括基底，导电层，光导层和绝缘层。其中，基底为透明支撑材料，可以使用玻璃，亚克力等。导电层为透明导电材料，如ito(为常规导电电极，厚度对最终效果无影响)。导电层上为光电导材料层，通过光强的变化可以实现光电导层电导率的改变，从而改变施加在溶液上的电压，进一步实现对电场分布的控制。绝缘层主要是保护光电导层，可以使用派瑞林，二氧化硅，氮化硅等材料，厚度为0nm-200nm。光电导材料可以单独一个基底上有或者两个基底上都有，绝缘层可以根据具体的情况选择添加或去除(如，光导电材料如果比较稳定，不容易损耗，则可以不使用绝缘层)。因此，此器件的结构可以为多种形态(1)sco(i)/sco(i)，(2)sc(i)/sco(i),其中s表示基底，c表示导电层，o表示光导层，i表示绝缘层，其中“/”左右表示上下两层，“()”中的层表示根据实际情况进行添加或去除。基于以上器件构建等梯度电场的布置如下：构建等梯度电场的方法如下：(1)标定光电导材料的性能，即电导随光强变化的规律。(2)根据所设计的芯片尺寸(上下两层的大小以及他们之间的间距)在有限元仿真软件中建立模型，模型包括上、下层光导电层以及中间的溶液。设置光电导材料的电导率分布，并仿真电场分布，使其最终能够形成等梯度电场。设置电导率的方法如下(a)：首先选择一个电场梯度的方向，此方向平行于上、下基底。(b)：在这个方向上改变电导率的分布，其按照公式δ＝a+byc进行设置，其中δ为电导率，y为选定的梯度方向上距离。a，b，c为参数。首先设置初始，a，b，c，然后根据仿结果修正参数，如发现电场梯度沿着梯度方向降低，则增加c的值，如果发现电场梯度沿着梯度方向升高，则降低c值，同时通过a和b来辅助实现电场梯度优化。(3)基于光电导材料的特性数据和将所设置的电导率分布推导出光强的分布。如图3所示，其结构为sc/sco型，上层是由玻璃和ito层组成(玻璃是基底，ito层为导电层)，下层是由玻璃、ito层和氢化多晶硅(一种导电材料，厚度为0.5微米)组成，氢化多晶硅是通过pecvd工艺制备而成。将两层基底用具有生物兼容性的双面胶粘接成微腔体，腔体的高度是100微米。通过光强的变化可以实现氢化多晶硅光电导层电导率的改变，从而改变施加在溶液上的电压，进一步实现对电场分布的控制。本实施例中氢化多晶硅的电导率随光强变化的数据如下表所示。结合有限元仿真实现构建等梯度电场的光强分布设计，通过投影仪将不同光强分布投射到光电导材料中。为了实现较小光束的投射，使得梯度尽可能大。在芯片与投影仪之间设计图像缩小光路。实验系统如图4所示。其包括投影仪、能够将投影仪的像缩小的物镜(x20倍)，非零等梯度电场芯片，显微镜ccd，函数发生器，计算机以及注射泵。投影仪在电脑的控制下可以产生不同光强分布的像，其通过物镜投射到非等梯度电场芯片上，因此芯片的光电导层的一面朝向投影仪。注射器可以将粒子或者细胞注入到芯片内部。函数发生器通可以产生正弦信号，施加在芯片两端，产生介电效应。通过显微镜和ccd可以从芯片的上面观察到分选的过程。表1氢化多晶硅面导电率随光强变化的关系光强/lux电导(s/m2)04.93836e-052400.0003317573700.0004187575300.0005279647300.0006467859570.00076562311850.00091243314600.001123703通过上述方法，此实施例中电导率分布是δ＝10y-1,y的范围是0到5从最后的仿真结果可以得到电场分布如图5b所示，其中从图5b和5c中中可以看出，在微流道的不同高度内形成非零等梯度电场。根据公式(1)所示，在同一溶液中，施加信号一定时，粒子受到的介电力与电场梯度和粒子本身的形态、电学参数以及溶液的电学参数是有关系的。其中fdep为介电力，r表示粒子的半径，是粒子形态参数，εm是溶液的相对介电常数。fcm是介电极化因子，包含了溶液介电常数和电导率，粒子介电常数和电导率，其为一个复数，re表示取其实部，e表示电场，表示求梯度。若在相同的电场中，有两种相近的粒子，它们在相同电场梯度作用下，假设深色粒子比浅色粒子受到的介电力略大，如图6a所示(仿真结果示意图)，粒子的速度大小与与受到的介电力成正比关系，两个粒子会随着时间的增加，间距会不断的增加。最终实现粒子的分离。然而目前已报道介电泳电极产生的电场均为非等梯度电场(如图6b所示)，由于位置的随机性，浅色粒子有一定的概率处于电场梯度较大的位置，深色粒子处在电场梯度较小的位置，此时深色粒子与浅色粒子受到的介电力可能相同，这种情况将意味着两种粒子很难被分离(如图6b图所示)。综上所述，两个相近的粒子通过等梯度电场介电泳实现了分离，而非均匀电场却无法完全将其分离。因此，非零等梯度电场可以提高粒子分辨。分选粒子的直径可以从亚微米到数百微米。如介电力不足可以通过提高施加信号的幅值实现增加介电力。但是不会改变等梯度电场的性质。为了能够实现效果更好粒子的分选，电极空间应该大于粒径的1.5倍。本发明中，非零等梯度电场不局限与上文中构建的基于光电导材料器件形成的非零等梯度电场。利用上述构建的等梯度芯片，对8微米和10微米聚苯乙烯微粒进行分选。在电极上施加的信号电压峰峰值为20v、频率为10khz的交流电压信号。共进行5次实验，每次实验，两种粒子的初始位置不同，3分钟后，5次实验均能够有较好分离效果(两种粒子的分离距离大于50微米)。在同等条件下，进行了点、面电极形成的非等梯度电场下的介电分离实验，5次实验的结果出现不一致：其中两个在一分内实现了分离(分离距离大于50微米)，三个最后分离距离无法实现分离(分离距离小于30微米)。在同等条件下，进行了在电场梯度为零的电场下的介电分离实验，粒子保持在原位不动。由此可见等梯度芯片可以提高粒子的效果和分辨率。当前第1页12