雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积pmel17基因及遗传标记方法与流程

本发明属于雪峰乌骨鸡分子生物技术及育种领域，主要是测定与胸肌黑色素沉积相关的遗传标记，具体地说是，是测定pmel17基因中的多态性，即与雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积相关前黑色素小体蛋白17(pmel17)基因的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，缩写为snp)的存在。

技术背景

雪峰乌骨鸡是湖南珍贵的地方乌骨鸡品种，其肉质鲜嫩，营养丰富，具有保健功效。乌骨鸡药用价值与黑色素相关，《本草纲目》就有“其颜色愈黑者，入药愈佳”的记载，消费者也更倾向选购乌色较深的乌鸡。而雪峰乌骨鸡机体黑色素沉积个体间差异较大，乌度不均一，常规选育进程缓慢。随着生物分子技术的发展，使得我们能够从dna水平寻找与雪峰乌骨鸡黑色素沉积相关的主效基因或分子标记，并在育种中将其应用于标记辅助选择，提高选育效率，获得更大更快的育种进展效应和经济效益。

前黑素小体蛋白17(pre-melanosomalprtein17，pmel17)是一种在内质网中合成的ⅰ型跨膜转运糖蛋白，被转运到黑素小体内，促进黑素小体结构的形成，保障黑色素的顺利合成。人类白癜风患者机体存在自身pmel17抗体，导致pmel17功能失常，阻碍了黑素小体的形成，从而影响黑色素形成。研究发现小鼠pmel17基因一个终止密码子突变，以及一个单核苷酸插入造成额外12个氨基酸的突变都可产生银色毛表现型。马pmel17基因p.arg618cys突变也可产生银色毛表型；鸡pmel17基因包含了11个外显子和10个内含子，鸡pmel17基因p.r618c突变产生红褐色羽毛表型，第10外显子一个9bp插入点产生显性白色羽毛表型。由此可见pmel17基因功能与黑色素沉积密切相关。

雪峰乌骨鸡dna遗传标记、遗传多样性和相关功能基因的研究仍处于起步阶段，关于雪峰乌骨鸡黑色素沉积相关的遗传标记尚未见报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，提供一种pmel17基因及其作为雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状遗传标记的用途；同时筛选与雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状相关的snp，以期应用于标记辅助选择或标记辅助渗入，并提供上述遗传标记在雪峰乌骨鸡标记辅助选择中的应用。

本发明实施例是这样实现的，一种pmel17基因，所述基因为与表示雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积相关的基因。

进一步，所述基因pmel17序列第222bp有一处碱基突变g→a。

进一步，克隆包括pmel17基因外显子2至外显子6全部序列所用引物如下：

正向引物：5’-atcgcatccccgtcccttatc-3’

反向引物：5’-ggacccaaccatccccttgc-3’

本发明实施例的另一目的在于提供一种用pmel17基因作为雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积相关遗传标记的方法，该包括如下步骤：

(1)根据genbank中鸡pmel17基因的序列，用primer5.0设计引物，覆盖该基因外显子2至外显子6全部序列；

(2)以上述雪峰乌骨鸡基因组dna为模板，pcr扩增，产物纯化，克隆，获得如序列表seqidno.1所示的核苷酸序列；

(3)鉴定该基因上述所得序列第222bp处是否存在多态性。

进一步，所述方法选择雪峰乌骨鸡作为研究对象，采用分子生物学的方法筛选雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状相关基因，其步骤如下：

(1)选择相同批次健康雪峰乌骨鸡200只进行饲养试验；

(2)根据pmel17基因的序列设计引物，对样品进行扩增、测序；

(3)筛选与胸肌黑色素沉积相关的snp。基因突变位点的测序峰图，如图1。

本发明采用pcr与dna测序结合的方法首先筛选出pmel17基因为雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积的相关基因，继而从雪峰乌骨鸡pmel17基因上筛选到与性状相关的snp，并且通过生产实践验证确定pmel17基因为黑色素沉积相关基因，筛选的snp为与之相关的snp。本发明筛选的雪峰乌骨鸡pmel17基因的snp可作为雪峰乌骨鸡辅助选择的遗传标记，从而培育出黑色素沉积更多，乌色更深的雪峰乌骨鸡，具有极其重大的应用价值和经济效益。

选择相同日龄的健康雪峰乌骨鸡100至200只进行饲养试验。对该些雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量进行测定，并从高黑色素含量和低黑色素含量样本中分别提取其基因组dna。

根据genbank中鸡pmel17基因序列，用primer5.0设计引物，覆盖该基因外显子2至外显子6全部序列，引物序列为：5’-atcgcatccccgtcccttatc-3’(正向)，5’-ggacccaaccatccccttgc-3’(反向)，用上述引物分别对雪峰乌骨鸡基因组dna进行扩增。

pcr：20μl反应体系：2×mastermix12μl，上下游引物(10μmol/l))各0.8μl，dna模板1μl，超纯水补至所需体积。

pcr扩增程序：95℃5分钟预变性后34个pcr循环参数为：95℃30秒，62.6℃30秒，72℃30秒，最后72℃5分钟。

取pcr产物5μl进行凝胶电泳，检测产物片段大小是否符合目的片段大小，pcr产物的长度为1718bp。

取pcr扩增产物30μl，产物纯化后送湖南擎科生物技术有限公司测序，反向测序一个反应，测序结果确证了pcr产物是pmel17基因，序列如序列表中的seqidno：1所示。图1是突变位点和测序峰图。

上述实验结果表明，从雪峰乌骨鸡胸肌提取的黑色素性状相关基因为pmel17基因，并且在该基因序列中筛选到与胸肌黑色素沉积有关的snp，证明这就是影响雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量的遗传原因。

与雪峰乌骨鸡胸肌黑色素有关的snp在生产实践中的验证

选择相同日龄及相同饲养管理条件的健康雪峰乌骨鸡40～80只进行饲养试验。所有供试雪峰乌骨鸡于120日龄进行屠宰，测定胸肌黑色素含量。

用提取的雪峰乌骨鸡胸肌组织样基因组dna，根据genbank中鸡pmel17基因序列，用primer5.0设计引物，覆盖该基因外显子2至外显子6全部序列，引物序列为：

5’-atcgcatccccgtcccttatc-3’(正向)，5’-ggacccaaccatccccttgc3’(反向)，用上述引物分别对雪峰乌骨鸡基因组dna进行扩增，然后检测其snp。

1、pcr

pcr反应体系如下表所示：

表1pcr反应体系

pcr循环参数如下：

34个循环：95℃，5min；95℃，30s；62.6℃，30s，72℃，30s；72℃，5min

2、pmel17基因snp位点基因型频率分析

通过卡方检验突变位点基因型频率与等位基因频率，结果如表2所示，该位点处于hardy-weinberg平衡中(p>0.05)。

表2snp位点基因型和基因频率

3、pmel17基因与雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状的相关分析

分析不同snp基因型对雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量的影响，结果见表3，从下表3中可见：不同snp基因型对雪峰乌骨鸡胸肌黑色素有显著影响；其中gg基因型雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量高ga型个体107.24％，差异达到极显著水平(p<0.01)。

表3不同基因型胸肌黑色素含量比较

注：同一列肩注不同大写字母为差异极显著(p＜0.01)。

附图说明：

图1为pmel17基因突变位点的测序峰图

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1雪峰乌骨鸡相关基因snp筛选

选择相同日龄的健康雪峰乌骨鸡200只进行饲养试验。对该些雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量进行测定，并从高黑色素含量和低黑色素含量样本中分别提取其基因组dna。

根据genbank中鸡pmel17基因序列，用primer5.0设计引物，覆盖该基因外显子2至外显子6全部序列，引物序列为：5’-atcgcatccccgtcccttatc-3’(正向)，

5’-ggacccaaccatccccttgc-3’(反向)，由湖南擎科生物技术有限公司合成。用上述引物分别对雪峰乌骨鸡基因组dna进行扩增。

pcr：20μl反应体系：2×mastermix12μl，上下游引物(10μmol/l))各0.8μl，dna模板1μl，超纯水补至所需体积。

pcr扩增程序：95℃5分钟预变性后34个pcr循环参数为：95℃30秒，62.6℃30秒，72℃30秒，最后72℃5分钟。

取pcr产物5μl进行凝胶电泳，检测产物片段大小是否符合目的片段大小，pcr产物的长度为1718bp。

取pcr扩增产物30μl，产物纯化后送湖南擎科生物技术有限公司测序，反向测序一个反应，测序结果确证了pcr产物是pmel17基因，序列如序列表中的seqidno：1所示。图1是突变位点和测序峰图。

上述实验结果表明，从雪峰乌骨鸡胸肌提取的黑色素性状相关基因为pmel17基因，并且在该基因序列中筛选到与胸肌黑色素沉积有关的snp，证明这就是影响雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量的遗传原因。

实施例2与雪峰乌骨鸡胸肌黑色素有关的snp在生产实践中的验证

选择相同日龄及相同饲养管理条件的健康雪峰乌骨鸡44只进行饲养试验。所有供试雪峰乌骨鸡于120日龄进行屠宰，测定胸肌黑色素含量。

用提取的44只雪峰乌骨鸡胸肌组织样基因组dna，并利用实施例1中的引物扩增，并按照实施例1的方法检测其snp。

2、pcr

pcr反应体系如下表所示：

表1pcr反应体系

pcr循环参数如下：

34个循环：95℃，5min；95℃，30s；62.6℃，30s，72℃，30s；72℃，5min

2、pmel17基因snp位点基因型频率分析

通过卡方检验突变位点基因型频率与等位基因频率，结果如表2所示，该位点处于hardy-weinberg平衡中(p>0.05)。

表2snp位点基因型和基因频率

3、pmel17基因与雪峰乌骨鸡胸肌黑色素性状的相关分析

分析不同snp基因型对雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量的影响，结果见表3，从下表3中可见：不同snp基因型对雪峰乌骨鸡胸肌黑色素有显著影响；其中gg基因型雪峰乌骨鸡胸肌黑色素含量高ga型个体107.24％，差异达到极显著水平(p<0.01)。

表3不同基因型胸肌黑色素含量比较

注：同一列肩注不同大写字母为差异极显著(p＜0.01)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>湖南农业大学

<120>雪峰乌骨鸡胸肌黑色素沉积pmel17基因及遗传标记方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>566

<212>dna

<213>鸡(chicken)

<220>

<221>mutation

<222>(222)

<223>r＝g或a

<400>1

tgctgacgtccccgtgtccccatgctgatgatgtccccacgtcccccagaccaggtgccc60

attgcggtggatgtgacacagctggaggtggcagcgggggacggcgggagcttcgtgcgc120

aaccgccccgtggccttcaacgtgaggctgcacgaccccagccattacctgcgtgatgct180

gacatctcctattcgtgggacttcggggaccggagcggcacrctcatctcccgcagcccc240

accgtcacccacacctacctgcaggctggttcctttgctgcccgcctggtgctgcaggca300

gccatcccgctcagctcctgcggcacctccgcaccccctgttgtggaccccaccactggg360

ccggtgccctccttgggacccacggccacacagcctgtgggacccaccggatccggcact420

gccatggcacccagcaacctcacgggatccggtactgctgcagcacccggaaccactgca480

gcacccagagcctccggggcaccagcagaacccacgggggtctcagtggctgtgctatca540

gacagcgctgccactgagcccctccc566