检测DMDA827T、DMDA5741T和DMD6436insC位点突变的引物和方法与流程

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc位点突变的引物，采用普通pcr结合sanger测序技术，可用于快速检测dmd/bmd患者体内dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc位点的突变情况。

背景技术：

假性肥大型肌营养不良(duchenne/beckermilsculardystrophy，dmd/bmd)是常见的x-连锁隐性遗传性肌肉疾病，由dmd基因突变所致。dmd在活产男婴中的发病率为1/3500，多于5岁前发病，病程进展快，12岁前失去独立行走能力，20岁左右死于心力衰竭或呼吸衰竭。bmd起病年龄较dmd晚，病程进展缓慢，一般于16岁后失去独立行走能力。由于本病发病率与致残率高，给患者家庭带来沉重的精神和经济负担，目前临床上尚无有效的治疗方法，所以准确、快速的dmd致病基因检测，优质的遗传咨询及准确的产前诊断对防止患儿的出生显得尤为重要。

肌萎缩蛋白基因(dystrophingene，dmd)是人类最大的基因之一，位于xp21.2，长2.4mb，约占人类基因组的0.1％，含79个外显子，其mrna序列长14kb，编码3685个氨基酸，组成抗肌萎缩蛋白(dystrophin)。dmd基因突变导致肌细胞内缺乏dystrophin蛋白，造成肌细胞膜不稳定，无法在收缩时保持完整，出现钙内流，最终导致肌细胞坏死和功能缺失，肌肉组织纤维化，表现为假性肥大肌营养不良。sanger测序法是基因检测的主要手段之一，也是基因检测的金标准。通过测序法对dmd基因突变进行检测可发现dmd基因已知和未知的全部类型的异常，为dmd/bmd的诊断提供依据。本发明中发现dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc三个位点的突变在中国人群中普遍存在。因此，临床在利用dmd基因突变辅助诊断dmd/bmd时需格外谨慎，加以区别。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc位点突变的引物，采用pcr技术，可用于快速检测dmd/bmd患者体内dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc位点的突变情况。所述检测dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc位点突变情况的引物，其特征在于，包括：

扩增dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc位点的引物，其碱基序列为：

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进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：

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进一步地，引物序列dmda827t-f和dmda827t-r是扩增dmd基因第827位碱基的引物；引物序列dmda5741t-f和dmda5741t-r是扩增dmd基因第5741位碱基的引物；引物序列dmd6436insc-f和dmd6436insc-r是扩增dmd基因第6436位碱基的引物。

本发明还提供了检测dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc位点突变情况的方法，包括以下步骤：

1.抽提外周血或肌肉组织中的基因组dna；

2.用pcr扩增步骤1中提取的dna；

3.对步骤2中的扩增产物进行测序；

4.对测序结果进行判断，确定dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc位点是否发生突变；

其中pcr扩增引物为：

扩增dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc位点的引物，其碱基序列为：

dmda827t-f：tgtaaaacgacggccagtatgttctgttttctaccatgttg

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进一步地，测序引物碱基序列为：

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本发明还提供了一种检测dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc位点突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(i)血液/组织dna抽提试剂；

(ii)检测体系pcr扩增反应液：包括扩增dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc位点的引物，其碱基序列为：

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dmd6436insc-r：aacagctatgaccatgttctttaatgttagtgcctttca；

(iii)测序体系试剂：包括测序引物，其碱基序列为：

m13f：tgtaaaacgacggccagt

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(iv)阳性对照品和阴性对照品。

有益效果：本发明设计了扩增dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc的引物。采用pcr技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明利用测序技术检测患者dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc突变热点的方法，可以将dmd基因dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc的突变检测出来，相比较荧光定量pcr法降低了检测的成本和难度。荧光定量pcr法要针对不同的突变类型设计3个探针，成本高，检测难度大。

附图说明

图1为3对扩增引物的琼脂糖凝胶电泳图，m为markerdl2000，1和2为血液样本1和样本2，经3对引物扩增后，引物扩增有效，且目的条带清晰，产物大小正确。

图2为样本2检测dmda827t位点的阳性测序截图结果。

图3为样本2检测dmda5741t位点的阳性测序截图结果。

图4为样本2检测dmd6436insc位点的阳性测序截图结果。

具体实施方式

实施例1

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

一种检测dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc位点突变的引物，该引物的设计是针对dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc突变位点所设计的特异性扩增引物，包括：

扩增dmd基因第827位、5741位和6436位碱基的引物，其碱基序列为：

dmda827t-f：tgtaaaacgacggccagtatgttctgttttctaccatgttg

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一种检测dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc位点突变的试剂盒，包括

(i)血液/组织dna抽提试剂；

(ii)检测体系pcr反应液；

(iii)测序体系试剂；

(iv)阳性对照品和阴性对照品。

其中，血液/组织dna抽提试剂可购自天根dna抽提试剂盒等商品化试剂。

检测体系pcr扩增反应液包括：2×pcrbuffer；2mmdntps；kodfxdnapolymerase(1u/μl)；dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc位点上、下游引物(10μm)。

测序体系试剂包括：测序纯化液(exoi:0.6u，cip:1.2u)、edta(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、hidi(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc的上、下游引物(3.2μm)。

实施例2

血液/细胞/组织基因组dna抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的组织dna：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12,000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液ga，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶k溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中。6)向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱cb3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份18μl分装：

x＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：加入检测体系pcr反应液中2μldna；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。

(4)扩增：检测在常规pcr仪上进行，可用仪器包括abiveriti(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件如下：

pcr扩增体系试剂配制方法如下：

其中，引物序列为：

注：f为上游引物，r为下游引物

(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110v，35min，凝胶成像系统观察。

如图1所示，即为2例血液样本以相应的引物扩增后所得产物的电泳图谱。通过电泳图的分析表明本发明所述扩增有效，且条带清晰。

(6)sanger测序：

取9pcr产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：

测序反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl125mmol的edta，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μlcbl后进行变性5min，最后-20℃2min上测序仪(abi3730)测序。

(7)结果判断：分别将测序结果与dmd(dmddp427m:004006.2)阴性参考序列进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

取30例临床外周血样品，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系pcr反应液中2μl。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。测序后发现dmda827位点基因突变情况为样本1无突变，其余样本全部突变；dmda5741位点样本全部突变；dmda6436位点样本全部突变。样本1和样本2的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，阳性测序图如图2-图4所示。

序列表

<110>杭州艾迪康医学检验中心有限公司

<120>检测dmda827t、dmda5741t和dmd6436insc位点突变的引物

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<210>2

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tgtaaaacgacggccagtttagcttcctatacatgggtc39

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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aacagctatgaccatgtttaccagaaaacacatcaca37

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<212>dna

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<212>dna

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tgtaaaacgacggccagt18

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aacagctatgaccatg16