溆浦鹅肥肝脂肪沉积A-FABP基因及遗传标记的方法与流程

本发明属于家禽分子生物技术及育种领域，主要是检测溆浦鹅肥肝性状相关的遗传标记，具体地说是检测a-fabp基因中的多态性，即与溆浦鹅肥肝性状相关的脂肪性脂肪酸结合蛋白基因的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，缩写为snp)的存在。

技术背景

溆浦鹅是我国的一个地方品种，具有肥肝性能最优，体型大，生长快，抗病性强优势，特别明显的是属于国家级地方品种遗传资源，2014年进入国家级畜禽遗传资源保护名录。鹅肥肝是世界级高档美味健康食品中三大珍品之一，其所富含的不饱和脂肪酸、亚油酸、卵磷脂等对软化血管、降低血脂、预防心脑血管疾病的发生具有重要保健作用。由于溆浦鹅缺乏科学系统选育，导致填肥后肝脏大小个体差异大，严重制约了鹅产业化生产效率、产品品质和经济效益。常规选育较慢，随着生物分子技术的发展，使得我们能够从dna水平寻找与溆浦鹅肥肝性状相关的主效基因或分子标记，并在育种中将其应用于标记辅助选择，一提高选育进程，获得更大的经济效应。

脂肪型脂肪酸结合蛋白(adipocytefattyacidbindingprotein,a-fabp)又称为脂肪酸结合蛋白4(fabp4)或a-fabp，是脂肪酸结合蛋白(fabps)家族中的一员。a-fabp属于膜周边蛋白，在许多组织中表达，特别是与脂质代谢相关的脂肪组织中，能可逆的结合长链脂肪酸，在脂肪酸的合成、运输和代谢过程中起着重要的作用。gerbens等对纯种杜洛克的研究表明，a-fabp多态性与肌内脂肪含量存在显著相关。国内也有相关研究，罗桂芬等在鸡a-fabp基因多态性分析及其与脂肪性状相关研究中，对a-fabp基因进行snps检测和基因型与性状的关联分析。结果发现，a-fabp不同基因型间腹脂率、皮脂厚、肌内脂肪含量差异极显著。叶满红在矮脚鸡上的研究表明，a-fabp基因第一外显子和第一内含子上单碱基变异对脂肪沉积有显著影响。杨志刚等研究发现，在朗德鹅a-fabp基因内含子2上存在单碱基突变，与肥肝性能显著相关。由此可见，a-fabp基因与脂肪沉积密切相关。

目前，关于a-fabp基因多态性的研究主要集中在与肌内脂肪含量的关联分析，与肥肝性能的关联分析相对较少。溆浦鹅dna遗传标记、遗传多样性和相关功能基因的研究仍处于起步阶段，关于溆浦鹅肥肝脂肪沉积相关的遗传标记尚未见报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种a-fabp基因及其作为溆浦鹅肥肝性状遗传标记的用途；同时筛选与溆浦鹅肥肝性状相关的snp，以期应用于标记辅助选择或标记辅助渗入，并提供上述遗传标记在溆浦鹅标记辅助选择中的应用。

本发明是这样实现的，一种a-fabp基因，所述基因为与表示溆浦鹅肥肝性状相关的基因。其基因如seqidno：1所示。

进一步，所述基因如序列表seqidno:1的第186bp处有1个c/t碱基突变，导致多态性存在。

进一步，克隆包括a-fabp基因如序列表seqidno:1所用引物如下：

正向引物：5’-cccaaataagataagaacac-3’

反向引物：5’-acatccaccagacaagaa-3’

本发明的另一目的在于提供一种用a-fabp基因作为溆浦鹅肥肝性状相关遗传标记的方法，该包括如下步骤：

(1)根据genbank中鹅a-fabp基因的序列，用primer5.0设计引物，覆盖该基因外显子2至外显子3全部序列；

(2)以上述溆浦鹅基因组dna为模板，pcr扩增，产物纯化，克隆，获得如序列表seqidno.1所示的核苷酸序列；

(3)鉴定上述所得序列的第186bp处存在1个突变位点。

进一步，所述方法选择溆浦鹅作为研究对象，采用分子生物学的方法筛选溆浦鹅肥肝性

状相关基因，其步骤如下：

(1)选择相同批次健康溆浦鹅60只进行饲养试验；

(2)根据a-fabp基因的序列设计引物，对样品进行扩增、测序；

(3)筛选与肥肝性状相关的snp。

检测与溆浦鹅肥肝性状相关a-fabp基因序列第186bp处突变的引物对，所述引物如下：

正向引物：5’-cccaaataagataagaacac-3’

反向引物：5’-acatccaccagacaagaa-3’

利用a-fabp基因作为溆浦鹅肥肝性状相关遗传标记的的应用，包括如下步骤：

(1)在genbank下载鹅a-fabp基因序列，用primer5.0设计引物，覆盖该基因外显子2至外显子3全部序列；

(2)以溆浦鹅基因组dna为模板，pcr扩增，产物纯化，正向测序一个反应，获得如序列表seqidno.1所示的核苷酸序列；

(3)鉴定该基因序列第186bp是否存在突变。选择相同日龄的健康溆浦鹅50～80只进行填饲试验。28天后进行屠宰，称量溆浦鹅肝脏重量，并从极端样本(大肝和小肝)中分别提取其基因组dna。

根据genbank中鹅a-fabp基因序列，用primer5.0设计引物，覆盖该基因外显子2至外显子3全部序列，引物序列为：5’-cccaaataagataagaacac-3’(正向)，5’-acatccaccagacaagaa-3’(反向)，用上述引物分别对溆浦鹅基因组dna进行扩增。

pcr：20μl反应体系：2×mastermix12μl，上下游引物(10μmol/l))各0.8μl，dna模板1μl，超纯水补至所需体积。

pcr扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，50.3℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃后延长10min，最后4℃保存。

取pcr产物5μl进行凝胶电泳，检测产物片段大小是否符合目的片段大小，pcr产物的长度为621bp。

取pcr扩增产物30μl，产物纯化后送湖南擎科生物技术有限公司测序，正向测序一个反应，测序结果确证了pcr产物是a-fabp基因，序列如序列表中的seqidno：1所示。上述实验结果表明，从溆浦鹅胸肌中提取相关基因为a-fabp基因，并且在该基因序列中筛选到与肝脏脂肪沉积有关的snp，很可能这就是影响溆浦鹅肝脏大小的原因。

与溆浦鹅肥肝脂肪沉积有关的snp在生产实践中的验证

选择60～100日龄及相同饲养管理条件的健康溆浦鹅18～30只进行试验。28天填饲后，对供试溆浦鹅进行屠宰，称量肥肝重量。

用提取的18～25只溆浦鹅胸肌组织样基因组dna，并利用引物序列为：5’-cccaaataagataagaacac-3’(正向)，5’-acatccaccagacaagaa-3’(反向)，进行扩增，然后检测其snp。

1、pcr

pcr反应体系如下表所示：

表1pcr反应体系

pcr循环参数如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，50.3℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃后延长10min，最后4℃保存。

2、a-fabp基因snp位点基因型频率分析

通过卡方检验突变位点基因型频率与等位基因频率，结果如表2所示，该位点处于hardy-weinberg平衡中(p>0.05)。

表2snp位点基因型和基因频率

3、a-fabp基因与溆浦鹅肥肝性状的相关分析

分析不同snp基因型对溆浦鹅肥肝脂肪沉积的影响，从下表3中可见：不同snp基因型对溆浦鹅肥肝性状有显著影响；其中cc基因型溆浦鹅肝重高ct和tt型个体102.52％和93.95％，差异达到显著水平(p<0.05)。

表3不同基因型溆浦鹅肝重比较

注：同一列肩注不同小写字母为差异极显著(p＜0.05)。

本发明采用pcr与dna测序结合的方法首先筛选出a-fabp基因为溆浦鹅肥肝性状的相关基因，继而从溆浦鹅a-fabp基因上筛选到与性状相关的snp，并且通过生产实践验证确定a-fabp基因为肥肝脂肪沉积相关基因，筛选的snp为与之相关的snp。本发明筛选的溆浦鹅a-fabp基因的snp可作为溆浦鹅辅助选择的遗传标记，从而培育出肝脏脂肪沉积更多，肝脏更大的溆浦鹅，具有极其重大的应用价值和经济效益。

附图说明

图1为a-fabp基因突变位点的测序峰图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1溆浦鹅肥肝脂肪沉积相关基因snp筛选

选择相同日龄的健康溆浦鹅60只进行填饲试验。28天后进行屠宰，称量溆浦鹅肝脏重量，并从极端样本(大肝和小肝)中分别提取其基因组dna。

根据genbank中鹅a-fabp基因序列，用primer5.0设计引物，覆盖该基因外显子2至外显子3全部序列，引物序列为：5’-cccaaataagataagaacac-3’(正向)，5’-acatccaccagacaagaa-3’(反向)，由湖南擎科生物技术有限公司合成。用上述引物分别对溆浦鹅基因组dna进行扩增。

pcr：20μl反应体系：2×mastermix12μl，上下游引物(10μmol/l))各0.8μl，dna模板1μl，超纯水补至所需体积。

pcr扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，50.3℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃后延长10min，最后4℃保存。

取pcr产物5μl进行凝胶电泳，检测产物片段大小是否符合目的片段大小，pcr产物的长度为621bp。

取pcr扩增产物30μl，产物纯化后送湖南擎科生物技术有限公司测序，正向测序一个反应，测序结果确证了pcr产物是a-fabp基因，序列如序列表中的seqidno：1所示。图1是突变位点和测序峰图。

上述实验结果表明，从溆浦鹅胸肌中提取相关基因为a-fabp基因，并且在该基因序列中筛选到与肝脏脂肪沉积有关的snp，很可能这就是影响溆浦鹅肝脏大小的原因。

实施例2与溆浦鹅肥肝脂肪沉积有关的snp在生产实践中的验证

选择80日龄及相同饲养管理条件的健康溆浦鹅21只进行试验。28天填饲后，所有供试溆浦鹅进行屠宰，称量肝脏重量。

用提取的21只溆浦鹅胸肌组织样基因组dna，并利用实施例1中的引物扩增，并按照实施例1的方法检测其snp。

1、pcr

pcr反应体系如下表所示：

表1pcr反应体系

pcr循环参数如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，50.3℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃后延长10min，最后4℃保存。

2、a-fabp基因snp位点基因型频率分析

通过卡方检验突变位点基因型频率与等位基因频率，结果如表2所示，该位点处于hardy-weinberg平衡中(p>0.05)。

表2snp位点基因型和基因频率

3、a-fabp基因与溆浦鹅肥肝性状的相关分析

分析不同snp基因型对溆浦鹅肥肝脂肪沉积的影响，从下表3中可见：不同snp基因型对溆浦鹅肥肝性状有显著影响；其中cc基因型溆浦鹅肝重高ct和tt型个体102.52％和93.95％，差异达到显著水平(p<0.05)。

表3不同基因型溆浦鹅肝重比较

注：同一列肩注不同小写字母为差异极显著(p＜0.05)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>湖南农业大学

<120>溆浦鹅肥肝脂肪沉积a-fabp基因及遗传标记的方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>527

<212>dna

<213>鹅(goose)

<220>

<221>mutation

<222>(186)

<223>y＝c或t

<400>1

tgtgggatttgctaccaggaaaatggctggtgtggccaagcccaatgtaactatcagcat60

aaatggtgatgtgataaccatcaaatcagaaagtaccttcaaaaatacagagatctcttt120

caagttgggtgaagagtttgatgagaccacagcagatgacagaaaaacaaaggtgagtct180

aaaaayggcattttccaaatacatctctcaaaggggatgtcagagcaggaggacagagtc240

atggttttgacatacgctgttgaaatgatgccttcagaggtaagcatacaaagaatcctt300

tttgctttagtactgcttggacatggaaacagtcttctcttcagtccatagcaccctgat360

aaaaaggggaaacttaccttttttctttaacagaatgtcataactttagaaaatggctca420

ctgaaacaggtgcagaagtgggatggcaaagagactatcataaagagaaaagtggtggat480

gggaacctggtcgtggtgagtttgtttttgttgtctaatcacagaat527