人YTHDF1基因的用途的制作方法

本发明涉及一种基因的新用途，尤其是人ythdf1基因的新用途。
背景技术：
：后天修饰有甲基化、乙酰化和泛素化等。rna修饰是后天修饰的一种。迄今为止，不同的细胞内rna如trna、rrna、mrna和长链非编码rna等已经发现了100多种化学修饰。而20世纪70年代发现的n6-methyladenosine是细胞内mrna及长链非编码rna最常见的修饰类型，且从病毒到酵母，乃至哺乳动物都广泛存在。最近的研究表明m6a修饰异常可导致大脑发育异常和其他疾病,包括癌症。rna结合蛋白(rna-bindingproteins)是转录后处理过程中的关键因素,它调节rna的拼接、稳定性、定位和翻译,许多rbps在不同的癌症类型中异常表达,导致癌基因蛋白和肿瘤抑制因子的功能障碍。参加m6a甲基化的酶一共有三大类酶，分别是writers、erasers和readers。writers是指在从dna→rna过程中的甲基化酶mettl3、mettl14和wtap等，在它们的作用下腺苷酸第六位n发生甲基化修饰。而这些已经发生m6a修饰的碱基，在fto和alkbh这两种酶的作用下发生去甲基化，故这类酶称为erasers。其中fto可与alkbh5一起，使得rna甲基化成为一种可逆的反应。最后这些发生甲基化修饰的rna碱基位点，需要特定的酶即readers来识别。已知ythdf家族包括ythdf1、ythdf2、ythdf3以及酿酒酵母中的mrb1基因、粟酒裂殖酵母中的mmi1基因都是readers类蛋白。这些酶能够识别发生m6a甲基化的碱基，参与下游翻译、mrna降解、加快mrna出核速度等作用。m6a修饰及其相关的调控蛋白在多种肿瘤起着关键的作用。美国安德森癌症中心黄素云课题组与芝加哥大学何川课题组合作的关于m6a去甲基化酶alkbh5的重要发现,指出alkbh5在恶性胶质瘤细胞中起到维持细胞干性的作用，并详细地揭示了alkbh5介导的foxm1基因mrna上的m6a修饰参与了肿瘤细胞干性的维持。肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。2017年美国最新肿瘤统计表明,肺癌估计的死亡人数为:男性84590例,女性71280例,分别占各类肿瘤死亡的27％和25％,位居各类肿瘤死亡之首。根据生物学特性，肺癌分为小细胞肺癌(sclc)和非小细胞肺癌(nsclc)。前者约占肺癌的15％～20％,后者约占肺癌的80％～85％。目前肺癌的治疗包括手术切除、以铂类(如顺铂或卡铂)为基础的联合化疗、放疗以及靶向药物治疗等，但临床疗效仍不理想，5年生存率不超过15％，其主要原因是肺癌细胞的发生、发展尚不完全清楚。因此，探索肺癌发生、发展过程中新的关键分子对明确肺癌发生的分子机制以及以此为靶点进行靶向治疗具有重要意义,有助于提高肺癌患者的生存率,改善其生存质量。技术实现要素：本发明的目的在于提供人ythdf1基因的新用途，即将人ythdf1基因表达量检测试剂应用在制备肺癌临床诊断试剂中；将人ythdf1基因表达量检测结果作为肺癌病人临床治疗的依据。检测人ythdf1基因表达量是利用人ythdf1基因序列设计人ythdf1的mrna的引物序列，并通过实时定量pcr法检测人ythdf1的mrna的水平；所述mrna的引物序列为：seqidno:7︰tgatctaatgtgaaatgtaag；seqidno:8︰cttacatttcacattagatca。针对肺癌病人中人ythdf1基因的高表达，本发明另一目的是将人ythdf1基因作为肺癌细胞的作用靶点应用于制备治疗肺癌的药物，所述针对肺癌细胞的作用靶点为rna干扰作用靶标。所述rna干扰作用靶点选自下述核苷酸序列：seqidno:1︰acagacagtgtgatggatgat；seqidno:2︰tcacttcctctgaactgttac。将抑制人ythdf1基因表达的shrna序列克隆入慢病毒载体后获得rna干扰慢病毒，用于制备肺癌的基因治疗药物；表达shrna的序列包括两个靶向人ythdf1基因编码dna的反向重复序列，中间由一茎环序列分隔；其中，两个反向重复序列分别为人ythdf1基因的shrna靶点序列及其互补序列；所述人ythdf1基因的shrna靶点核苷酸序列选自下述核苷酸序列：seqidno:1︰acagacagtgtgatggatgat；seqidno:2︰tcacttcctctgaactgttac。所述表达shrna的序列的正义链序列如seqidno:3所示，反义链序列如seqidno:4所示；或者正义链序列如seqidno:5所示和反义链序列如seqidno:6所示。forwardoligo:ythdf1fo1(seqidno:3)ccggacagacagtgtgatggatgatctcgagatcatccatcacactgtctgttttttg；reverseoligo:ythdf1ro1(seqidno:4)aattcaaaaaacagacagtgtgatggatgatctcgagatcatccatcacactgtctgt；或者forwardoligo:ythdf1fo2(seqidno:5)ccggtcacttcctctgaactgttacctcgaggtaacagttcagaggaagtgatttttg；reverseoligo:ythdf1ro2(seqidno:6)aattcaaaaatcacttcctctgaactgttacctcgaggtaacagttcagaggaagtga；ythdf1基因是m6a修饰的mrna的结合蛋白，是我们实验室通过高原低氧适应趋同进化筛选到的一个候选基因；本发明通过比较藏族人群和6种高原家养哺乳动物与平原汉族及平原近缘种比较分析，大量高原低氧适应特异的基因被富集出来，同时被富集出来的还有很多肿瘤相关基因及功能未知的基因，ythdf1是其中之一，初步的数据分析显示，该基因在多种肿瘤中高表达，但其作用机制并不清楚。因而我们实验室对其在肺癌的发生发展中的作用进行了解析，通过real-timepcr检测，我们发现与对照组正常肺上皮细胞相比，ythdf1的rna水平在肺癌细胞系中的表达明显增高，用蛋白免疫印迹(wb)的方法检测发现ythdf1的蛋白水平在肺癌细胞系中较正常上皮细胞高。通过对临床组织样本的检测也发现，ythdf1在肺癌患者中呈高表达趋势，由此推测，ythdf1在肺癌的发生发展中起着重要作用；因此，我们通过ncbi数据库，找到人的ythdf1的序列，人ythdf1基因的核苷酸序列见genebank中基因登录号为nm_017798中的第295..1974位所示。本发明基于ythdf1基因在肺癌细胞中表达量明显相较正常人肺上皮细胞(beas-2b)高，而且在肺癌患者中存在ythdf1基因扩增的现象，通过降低ythdf1的表达能抑制肺癌细胞增殖、体内的异种移植肿瘤及体内自发诱导肺癌肿瘤模型中小鼠肺腺癌的形成，ythdf1基因敲除小鼠成瘤能力检测实验显示细胞增殖受到显著抑制，细胞的凋亡明显上升；表明人ythdf1基因可以作为癌症治疗的靶点；针对人ythdf1基因设计的rna干扰慢病毒，在癌症细胞内降低了ythdf1表达，能明显抑制肺癌细胞的增殖、使细胞阻滞在g0/g1期，促进细胞的凋亡、抑制异种移植肿瘤的形成，进而能达到治疗肺癌的目的，同时为将来基于ythdf1基因的肺癌治疗药物的开发提供了可能，本发明具有较大的应用价值和市场推广前景。附图说明图1为ythdf1在不同肺癌细胞系中的mrna表达结果示意图；图2为ythdf1在不同的肺癌细胞系中蛋白的表达结果示意图；图3为ythdf1在不同的临床肺癌组织中蛋白的表达结果示意图(a)及统计结果图(b)；其中a图中p表示癌旁组织，t表示癌组织；图4为免疫组化实验染色结果以及肺癌组织芯片(tma)检测肺癌和非癌组织中ythdf1的表达情况结果，a图为不同肺癌组织中ythdf1不同表达强度示意图，negative:阴性；weak:弱阳性；moderate:中等强度阳性信号；strong:强阳性；scc:肺鳞癌；adc:肺腺癌,b图ihc量化数据(nclt：非癌肺组织，nsclc：非小细胞肺癌组织)；图5为通过实时pcr(b图：a549和d图:h1299)和ythdf1、β-actin、flag抗体免疫印迹验证了ythdf1shrna敲低或过表达效率(a图:a549和c图:h1299)，其中ythdf1为ythdf1抗体检测结果，flag检测的是flag-ythdf1即过表达ythdf1的表达水平；β-actin为actin抗体检测结果，作为上样内参；图6为抑制ythdf1表达、抑制细胞增殖实验结果；a图为a549相关细胞株，b图为h1299相关细胞株；图7为edu插入实验结果，其中a图为edu结合试验中ythdf1敲低后，dna合成在a549细胞中受到抑制结果；b图为ythdf1敲低后，dna合成在h1299细胞中受到抑制的结果；图8为细胞周期检测实验结果；a图为549细胞流式分析检测结果，b图为定量分析图，**p<0.01,t-test；图9为细胞周期检测实验结果；a为h1299细胞流式分析检测结果，b图为定量分析图，**p<0.01,t-test；图10为ythdf1敲低后细胞周期相关蛋白检测结果；图11裸鼠成瘤实验结果；a图为稳定表达ctr或ythdf1shrnas的a549移植到裸鼠体内后6周肿瘤的生长情况；b图为ythdf1敲低显著抑制异种移植肿瘤的重量结果，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,t-test；c图为ythdf1敲低显著降低雄性nude小鼠皮下移植瘤生长结果，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,t-test；图12为ythdf1敲除小鼠与krasg12d/p53lox/lox肺癌小鼠模型杂交及实验流程图；图13为小鼠用adeno-cre滴鼻诱导肺癌12周后取出肺组织，kp小鼠肺组织和kpy小鼠的肺组织照片(左)，he染色(全景图(中)，200×放大图(右)；柱状图为统计结果图；图14为kp和kpy肺癌组织中ythdf1染色结果；图15为kp肺癌小鼠模型诱导产生的肿瘤类型结果示意图；图16为检测ythdf1基因不同表达水平在kp小鼠中的增殖和凋亡情况，柱状图是统计结果；图17为k和ky肺癌组织中ythdf1染色结果；图18为小鼠滴鼻诱导肺癌22周后取出肺组织全景图(左)，he染色(200×放大图(右))；柱状图为统计结果图；图19为检测ythdf1基因不同表达水平在不同k小鼠中的增殖和凋亡情况，柱状图是统计结果；上述图中ctrshrna为scrambleshrna对照细胞株；ythdf1sh#1为敲低shrna#1的稳转细胞株；ythdf1sh#2为敲低shrna#2的稳转细胞株。具体实施方式下面通过实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，所用试剂如无特殊说明，均为常规时售试剂或按常规方法配制的试剂。下述实施例中kp是krasg12d/p53lox/lox小鼠肺组织(左)，kpy是krasg12d/p53lox/lox/ythdf1lox/lox小鼠肺组织，k是krasg12d小鼠肺组织，ky是krasg12d/ythdf1lox/lox小鼠肺组织，ythdf1敲除小鼠与krasg12d/p53lox/lox肺癌小鼠模型杂交及实验流程图见图12；实施例1：rt-pcr实验检测ythdf1在肺癌细胞系中的表达情况1、细胞总rna抽提(1)正常肺上皮细胞和肺癌细胞生长到80％覆盖度时，去掉上清，pbs洗除血清，加入1mltrizol，水平放置5分钟，保证trizol均匀分布于细胞表面并裂解细胞，吹打细胞，使细胞从培养皿上脱落，将所有液体转移至离心管内，反复吹打直至裂解液中无明显大块沉淀；室温静置5min；(2)于4℃离心机中以12,000g离心5min，上清转移至新的1.5ml离心管中；(3)加入200μl氯仿，漩涡仪振荡，于4℃离心机中以12,000g离心15min，此后液体分为三层；(4)吸取上层水相(注意不要碰到中间的蛋白质层)，转入新的rnaasefree的离心管中；(5)加入等体积的异丙醇，轻柔地上下颠倒5次，室温静置10min；(6)12,000rpm转速，4℃离心10min，此时出现白色沉淀；(7)弃上清，加入1ml经depc处理的75％乙醇，上下颠倒数次洗涤沉淀；7500g离心5分钟，弃上清保留沉淀；(8)rna于室温下干燥，然后加入无rna酶的水溶解；(9)测量od值，以确定rna的浓度和质量，然后置于-80℃保存。2、反转录反应(reversetranscription,rt)上述提取的rna取1μg用takarakit进行反转录。具体如下：按如下成分于冰上配制反应混合液，然后再分装到每个反应管中，最后加入rna样品；轻柔混匀，按照42℃2min(或者室温5min)进行反应；组分体积(μl)5×gdnaeraserbuffer2gdnaeraser1总rna1μgrnasefreedh2o加至10总体积10反应后样品置于冰上，按下表配制混合mix，然后再分装10ul到每个反应管：轻柔混匀后立即进行反转录反应：37℃15min，85℃5s，4℃。3、qpcr每个样本设置三个重复孔，按如下组分配制：组分体积(ul)sybergreenmix10cdna模板110um上下游引物mix0.6灭菌双蒸水8.4总体积20；混匀以上组分，加入到96孔板各孔，封膜后，离心使液体聚集到管底；根据以下条件进行pcr反应，热循环参数如下：50℃，2min；95℃，2min；95℃，10min；95℃，15s，60℃1min，40个循环。所用引物如下：ythdf1_f:tgatctaatgtgaaatgtaag；ythdf1_r:cttacatttcacattagatca；β-actin_f:aagtgtgacgtggacatccgc；β-actin_r:ccggactcgtcatactcctgct,其中，β-actin作为内参。结果见图1所示不同肺细胞系中ythdf1mrna的表达量，正常人肺上皮细胞(beas-2b)和肺癌癌性细胞系(h1975、a549、h838、h1299、glc-82、spc-a1和h1650)作为对照；实验结果显示与正常肺上皮细胞相比，肺癌细胞中ythdf1mrna的表达明显上调。实施例2：蛋白免疫印迹检测ythdf1蛋白表达情况1、wb(westernblotting)检测1.1细胞总蛋白的提取按照特定实验处理后的细胞，弃去上清培养基，用pbs洗涤1次；根据细胞沉淀的量加入相应的细胞裂解液，反复冻融裂解3次，期间不停吹打；4℃、12000rpm离心10min，取上清弃沉淀用于后续实验。1.2蛋白浓度检测与变性处理蛋白浓度检测试剂盒为碧云天bca蛋白浓度测定试剂盒(增强型)，货号：p0010s，方法如下：将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl，使得标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml；加适当体积样品到96孔板的样品孔中；各孔加入200μlbca工作液，37℃放置20min；用酶标仪测定a562波长的吸光度；根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。取适量的蛋白样品，加入5×上样缓冲液，置于100℃金属干热仪中煮10min；取出后冷却，分装，-80℃保存或者直接进行sds-page(聚丙烯酰氨凝胶)电泳。1.3sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(1)清洗电泳配制凝胶用玻璃板，烘干，固定在配胶架子上；按照需要，配制8％-12％不同浓度的分离胶，待胶充分凝固后按配方加入浓缩胶，插入样品槽梳子；待胶凝固后，取出胶，拔出梳子，蒸馏水清洗表面胶；把玻璃板和凝胶一同固定在电泳架上，加入的tris-甘氨酸电泳缓冲液，使电泳缓冲液在短玻璃板上方约0.5cm；每孔加入蛋白量30-50μg，首先80v电压下电泳跑完浓缩胶，再用120v电压电泳；把转膜架放在转膜液中，黑色塑料板面向下，白色在上，在黑色面上方放一块海绵垫，海绵垫上方放两张滤纸；轻轻把凝胶从电泳玻璃板上取下来后放到滤纸上，把pvdf膜放到凝胶上方，再放两张滤纸，滤纸上方放一块海绵垫，把黑白两块塑料板固定牢固，放入已经预冷的转膜缓冲液中；冰浴条件下，83v电压转膜3h；把pvdf膜放入含5％脱脂奶粉的tbst中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭2h；加入用含5％脱脂奶粉的tbst稀释的一抗，4℃缓慢摇动中孵育过夜；tbst洗膜10min×3次；加入hrp标记的二抗(抗鼠：1:20000，抗兔1:2000稀释)，室温孵育1h；tbst洗膜10min×3次；把pvdf膜转移到发光板上，避光条件下加入ecl试剂(用前把a,b液进行等量混合)，经显影，定影后拍照。结果见图2在不同的肺细胞系中ythdf1蛋白的表达；细胞裂解物分别检测ythdf1和β-actin的表达，β-actin作为对照；实验结果显示与正常肺上皮细胞相比，肺癌细胞中ythdf1蛋白的表达明显上调。图3在18个肺癌病人癌旁与癌组织中ythdf1蛋白的表达；组织裂解物分别检测ythdf1和β-actin的表达，β-actin作为对照；实验结果显示与正常肺上皮细胞相比，肺癌组织中ythdf1蛋白的表达明显上调。图5在a549、h1299稳定敲低表达细胞株和过表达外源性的flag-ythdf1细胞裂解物中分别检测ythdf1、flag和β-actin的表达，β-actin作为对照，结果所示为ythdf1敲低和过表达的表达情况；图10为细胞周期相关蛋白在a549、h1299稳定敲低表达细胞株中cdk2、cdk4、cyclind1蛋白表达显著降低，p27蛋白表达显著升高；cdk6无显著差异。实施例3：临床实验1、免疫组化实验肺癌组织芯片和肺癌病理组织切片与中南大学湘雅医院病理科等医院合作获得，裸鼠肿瘤样本通过福尔马林固定后浸蜡切片制备而成，将样本置于80℃烤片2小时，二甲苯浸泡脱蜡，梯度酒精脱水，浸没在0.3％的双氧水(甲醇和水配制)溶液15分钟以去除组织过氧化物酶，用trisbuffersaline(tbs)漂洗,微波炉95℃抗原修复20分钟，室温恢复1小时；然后tbs洗三次，5％的山羊血清孵育30分钟去除非特异性结合，一抗anti-ythdf1(proteintech，11515-1-ap，1:200)，anti-cleaved-caspase3(cc3:cst，9661s，1:1000)，anti-ki67(maximbiotechnologies，mab-0005，readytouse)，anti-napsina(maximbiotechnologies，mab-0704,readytouse)，anti-ttf(maximbiotechnologies，mab-0599,readytouse),4℃孵育两小时，tbs洗三次，hrp标记的二抗(santacruz，usa)孵育30分钟；diaminobenzidine(dab)显色，苏木素进一步染色，然后将切片脱水，二甲苯透明，dibutylphthalatexylene(dpx)封片；显微镜(olympus,tokyo,japan)拍照并分析；采用h-scores方法对ythdf1的表达进行评分，从肿瘤表达强度和表达阳性率两方面进行综合评估。根据染色强度分为：阴性(0)，弱阳性(1)，中度阳性(2)和强阳性(3)四个等级。根据染色阳性细胞比例：阴性(0)，1-25％(1)，26-50％(2)，51-75％(3)，76-100％(4)；判断每个标本染色的最终指标为强度×阳性率。评分＜8定为ythdf1低表达组，≥8定为ythdf1高表达组，结果见图4的a、b图。图13、14、15、16、17、18、19是肺癌小鼠模型中各种染色的结果，图13、18显示了不同来源小鼠肺组织的he染色图，结果显示肿瘤数量和大小在ythdf1敲除小鼠中明显减少；图15显示了诱发小鼠肺癌的肿瘤性质是肺腺癌，肺腺癌的两个标志物napsina和ttf-1染色结果显示阳性；图14显示了kp小鼠中ythdf1蛋白高达，而kpy小鼠中，ythdf1蛋白表达未被检出；图17显示了k小鼠中ythdf1蛋白高达，而ky小鼠中，ythdf1蛋白表达未被检出；图16、19检测ythdf1基因不同表达水平在不同k和kp小鼠中的增殖和凋亡情况，图16显示ythdf1敲除的kp小鼠中细胞增殖(ki67)受到显著抑制，细胞的凋亡(cleaved-caspase3)明显上升；图19显示了ythdf1敲除k小鼠中细胞增殖(ki67)受到显著抑制，细胞的凋亡(cleaved-caspase3)明显上升。表1：487个病人的临床和病例特征实施例4：质粒构建与稳转细胞系的建立针对人ythdf1设计两条用于独立敲低表达的shrna靶点，分别为acagacagtgtgatggatgat(shrna#1)或者tcacttcctctgaactgttac(shrna#2)；对照shrna为scrambleshrna：gcactaccagagctaactca；合成oligo序列后，稀释成浓度20μm；oligo序列如下：forwardoligo:ythdf1fo1(seqidno:3)ccggacagacagtgtgatggatgatctcgagatcatccatcacactgtctgttttttgreverseoligo:ythdf1ro1(seqidno:4)aattcaaaaaacagacagtgtgatggatgatctcgagatcatccatcacactgtctgt或者forwardoligo:ythdf1fo2(seqidno:5)ccggtcacttcctctgaactgttacctcgaggtaacagttcagaggaagtgatttttgreverseoligo:ythdf1ro2(seqidno:6)aattcaaaaatcacttcctctgaactgttacctcgaggtaacagttcagaggaagtga按照下述条件进行反应：5μlforwardoligo、5μlreverseoligo、5μl10×nebbuffer、35μlddh2o；水浴锅中沸水浴4分钟，缓慢降温至室温；用ecorⅰ和ageⅰ酶切plko.1，电泳并回收载体片段；取oligo反应混合液与酶切回收的载体片段在t4连接酶的催化下，16℃连接过夜；取连接产物进行热激转化至stbl3中，涂布于含有氨苄青霉素的lb平板上，37℃倒置培养过夜；挑取单克隆于含有氨苄青霉素液体lb中，37℃振荡培养18h，抽取质粒进行酶切鉴定(ecorⅰ和ncoⅰ)，对阳性克隆进行测序验证；扩增阳性目的质粒；通过磷酸钙转染法将目的质粒导入hek-293t进行病毒制备：配制转染液：a液：ddh2o420μl、cacl2(2mol/l)60μl、pspax27.5μg、pmd2.g5μg、plko.1-shrna12.5μg；b液：2×hepes500μl。充分混匀后，将a液逐滴加入至b液中，振荡混匀，室温反应30min，滴加至覆盖率为70％左右的hek-293t中，5％co2、37℃培养箱中培养；转染后8h进行换液，48h和72h后收病毒，用0.45μm的滤膜过滤得到病毒上清液；将新鲜的病毒液感染目的细胞(a549、h1299)，用4μg/mlpolybrene促进感染效率；感染72h后，用相应浓度的嘌呤霉素筛选阳性细胞，至少三次；扩增并鉴定目的基因的敲低效率，得到的稳转细胞株经real-timepcr鉴定后发现，ythdf1的mrna和蛋白水平成功敲低(见图5)。实施例5：细胞增殖抑制实验1、为测定细胞增殖能力，取对数期生长的稳定敲降细胞株，胰酶消化后成单细胞，终止消化制成细胞悬液，进行浓度测定；按照所需细胞数(a549:2.0×104/孔、h1299:2.0×104/孔)，用完全培养基配制相应的细胞悬液种至12孔板中(1.5ml/孔)，37℃、5％co2培养6天；每天进行计数：弃上清，500μl胰酶消化进行计数；根据浓度分别算出细胞数，绘制生长曲线；实验结果表明当ythdf1敲低时，细胞的增殖得到抑制(图6)。2、edu插入实验，是通过10medu代替胸腺嘧啶掺入dna，利用edu的抗体检测edu掺入的比例来验证细胞的增殖能力；a549和/或h1299稳定敲降细胞生长到80％覆盖度时，去掉上清，pbs洗除血清，0.25％胰酶1ml消化3分钟，然后加入5ml培养基终止，吹打成单细胞悬液，用countstar细胞计数仪进行计数，按照每孔500μl5×104的细胞总量，种于8孔板中，置于37℃，5％co2二氧化碳培养箱中过夜，24小时后，加入10μmedu(终浓度)在培养箱中孵育，20min后从培养箱中取出，去培养基，pbs漂洗一次；加200μl4％多聚甲醛(pfa)固定，20分钟后，pbs洗一次，edu染色按照试剂盒所提供试剂与操作流程进行，染色结束，4度保存，荧光显微镜进行拍照并计数。稳转的ythdf1敲低细胞株中edu的掺入明显较对照组减少(见图7)。实施例6：细胞周期检测实验1、样品准备a549和h1299稳定敲降细胞生长到80％覆盖度时，去掉培养基上清，pbs清洗一次，0.25％胰酶1ml消化3分钟，然后加入5ml培养基终止，吹打成单细胞悬液，用countstar进行计数，按照每孔2ml培养基体积，细胞总量3×105-4×105个，种于6孔板中，每个样品设置三个重复孔，轻轻混匀以保证细胞分布均匀，然后置于37℃，5％co2二氧化碳培养箱中过夜；24小时后，去除培养基上清，加2ml无血清培养基进行饥饿，置于37℃，5％co2二氧化碳培养箱中过夜；去除无血清培养基，加入含血清的完全培养基进行释放6-8小时；去掉培养基上清，pbs清洗一次，0.25％胰酶0.5ml消化3分钟，然后加入2ml培养基终止，轻柔地吹打成单细胞悬液；收集细胞到离心管中，1500rpm离心5分钟；加入5mlpbs洗一次，1500rpm离心5分钟，重复一次；去除pbs液体，用500μlpbs重悬细胞沉淀，注意轻柔；将4.5ml预冷的75％的乙醇加入到新的离心管中，标注清楚样品名称；将重悬好的细胞悬液逐滴加入到预冷的75％乙醇中，注意滴入后装有乙醇的管及时摇匀，以保证充分固定，另外样品须一一对应；盖紧离心管盖，上机前于4℃保存。2、流式检测实验将样品从4℃取出，1500rpm离心5分钟；去除固定液，加入5mlpbs清洗，1500rpm离心5分钟，重复一次；每管加入500μl含有rnaase(1:500)的pbs+0.1％trionx-100+10μlpi溶液进行染色；15-30分钟后使用流式细胞仪进行检测细胞周期的变化；数据进行整理分析，绘制细胞周期分布图和统计图。细胞周期试验表明，ythdf1敲低的稳转株，细胞阻滞在g0/g1期(见图8、9)。实施例7：裸鼠成瘤实验5周龄雄性balb/c裸鼠购买于上海斯莱克实验动物中心(动物许可证号为syxk(粤)2010-0102)。裸鼠饲养于spf级环境中，适应2-3天。打裸鼠当天，a549稳定敲降细胞生长到80％覆盖度，去掉培养基上清，pbs清洗一次，0.25％胰酶1ml消化3分钟，然后加入5ml培养基终止，吹打成单细胞悬液，用countstar细胞计数仪进行计数，稀释至1×107/ml密度且准备1.5ml细胞悬液，置于冰上。裸鼠随机分为3组，编好号。用碘伏消毒裸鼠腋窝皮肤后，将胰酶消化好的单细胞悬液ythdf1scramble，ythdf1shrna1#和ythdf1shrna2#分别接种于各组裸鼠腋窝皮下，每只接种100μl(含1.0×106个细胞)。接种后一周开始每3天观察裸鼠的一般情况，并用游标卡尺测量肿瘤体积的最大径(l：瘤长)和最小径(w：瘤宽)，按公式v＝l×w2/2计算肿瘤的近似体积。同时电子天平称量瘤重，绘制裸鼠的移植瘤生长、体重和瘤重曲线。6周时处死裸鼠，解剖并完整取出瘤块，并拍照。取出的移植瘤组织-80℃保存或者置于福尔马林中固定。敲低了ythdf1的a549细胞能明显抑制裸鼠体内肿瘤的生长(图11)。序列表<110>中国科学院昆明动物研究所<120>人ythdf1基因的用途<160>10<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>1acagacagtgtgatggatgat21<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>2tcacttcctctgaactgttac21<210>3<211>58<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>3ccggacagacagtgtgatggatgatctcgagatcatccatcacactgtctgttttttg58<210>4<211>58<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>4aattcaaaaaacagacagtgtgatggatgatctcgagatcatccatcacactgtctgt58<210>5<211>58<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>5ccggtcacttcctctgaactgttacctcgaggtaacagttcagaggaagtgatttttg58<210>6<211>58<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>6aattcaaaaatcacttcctctgaactgttacctcgaggtaacagttcagaggaagtga58<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>7tgatctaatgtgaaatgtaag21<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>8cttacatttcacattagatca21<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>9aagtgtgacgtggacatccgc21<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>10ccggactcgtcatactcctgct22当前第1页12