一种PCR扩增试剂及其应用的制作方法

文档序号：17158691发布日期：2019-03-20 00:20阅读：554来源：国知局

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种pcr扩增试剂及其应用。

背景技术：

目前高通量测序技术凭借其更低廉的价格，更全面、更深入地对全基因组进行分析的优势已经得到了广泛的应用，在科学研究、疾病诊断和治疗等方面有着重要的意义。在很多实际应用中，并不需要对全基因组进行测序，而只需要分析特定基因组区域。靶向测序技术就是对基因组特定靶向位点进行特异性建库测序的高通量测序技术。目前靶向测序可通过两种方式实现，一是靶向探针捕获测序，二是扩增子测序。扩增子测序是通过设计感兴趣的基因组区域的引物，进行pcr扩增，对目标区域进行富集，针对特定长度的pcr产物进行建库，通过测序分析序列中的变异。采用扩增子测序，研究者可以对基因组中感兴趣的关键区域进行重点研究，该方法可以高效的发现、验证和筛选关注区域的基因组变异。相对于全基因组或全外显子组测序而言，扩增子测序具有针对性强、数据量少、灵活性高、分析简单、测序周期短、测序深度高、成本低等诸多优势。

目标区域富集是通过多重pcr扩增实现，多重pcr(multiplexpcr)的基本原理、反应试剂和操作均与常规pcr相同，区别在于多重pcr体系中含有2对或多对引物，分别扩增不同模板，以对多个靶标进行同时检测，因而多重pcr更为快速、简便。多重pcr体系中多对引物的存在容易引起以引物二聚体为主的非特异扩增的产生，因此，设计引物时应综合考虑引物长度、gc含量及引物与靶序列的同源性。各引物的退火温度应较为接近，以使各引物对其相应的靶序列有相同的扩增效率。由于taqdna聚合酶是mg²⁺依赖酶，dntp、引物也都依赖于mg²⁺，所以最佳mg²⁺浓度对平衡扩增的特异性和灵敏度有很大的影响，通常依据dntp浓度、模板dna量及缓冲液组分来确定mg²⁺浓度。

目前的扩增子测序是通过pcr扩增富集到目标区域后，进行末端修复和加a，加接头，纯化样品，跑胶回收目的条带，pcr扩增，跑胶回收主带，送测序。扩增子建库的成功关键之处在于第一步的目标区域的富集(多重pcr)，获得产量高、均一度好的目标区域才能保证后续顺利构建测序文库。目前很多研究都集中在优化多重pcr过程，期望获得扩增灵敏度高、特异性好、并且能够适用于更多不同样本的多重扩增试剂。

现有的扩增试剂在产物均一度和产量上效果欠佳，表现在针对质量不好的样本，如：福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)样本、细胞游离dna(cfdna)等，以及样本投入量较低(低于0.1ng)时，试剂的灵敏度不够，目标区域得不到较好的扩增。现有的扩增试剂在扩增不同tm值体系时，兼容性较差，这些缺陷都对后续的测序文库构建有很大的影响。

技术实现要素：

本发明目的之一在于提供一种扩增试剂。

本发明目的之二在于提供所述扩增试剂在生物技术领域中的应用。

本发明的目的可以通过以下方案实现：一种pcr扩增试剂，在扩增体系中加入反应添加剂，所述添加剂选自甘油、海藻糖、dmso或明胶中的一种或几种。单独使用一种添加剂有利于提高扩增灵敏度，几种种添加剂结合使用可以更好的提升扩增灵敏度和兼容性。

进一步优选的，所述添加剂的加入体积为每个扩增反应的反应体系总体积的0.5～15％，更进一步优选为1～5％，最优选为1～3％；如果是在2×multi-pcrmix中，则优选为反应体系总体积的1～30％，更进一步优选为2～10％，最优选为2～6％。

在本发明的一种优选的实施例中，扩增体系中含有kcl，所述kcl的量为20～60mm每个扩增反应，优选为40～60mm每个扩增反应，最优选为50mm每个扩增反应；如果是在2×multi-pcrmix中，则优选为40～120mm，进一步优选80～120mm，最优选100mm。

本发明所述的扩增体系，可以在使用添加剂的基础上，进一步通过调整缓冲液中的盐离子(如kcl)浓度，更好的优化反应。

在本发明的一种更为优选的实施例中，所述的pcr扩增试剂指每个扩增反应所用的试剂，包括：taqdna聚合酶1～3u，tris20～30mm，kcl20～60mm，添加剂0.5～15％，mgcl20.5～1.5mm，dntp0.1～0.3mm，ph7.5～7.7。其中taqdna聚合酶可以为本领域现有的taqdna聚合酶，也可以是通过现有的taqdna聚合酶突变形成的突变体。所述kcl的含量如前所述，可以进一步优选40～60mm，最优选为50mm；添加剂可以选自甘油、海藻糖、dmso或明胶中的一种或几种；所述添加剂优选为1～5％，最优选为1～3％。

本发明还提供包含本发明所述pcr扩增试剂的试剂盒。

本发明还提供本发明所述pcr扩增试剂或所述试剂盒在生物技术领域中的应用，特别是在扩增子建库中的应用，如pcr，多重pcr中的应用。

本发明还进一步提供了一种taqdna聚合酶突变体，可以用于上述pcr扩增试剂中，其是如seqidno.1所示的taqdna聚合酶的氨基酸序列中插入、取代、或缺失1个或多个氨基酸，或者在seqidno.1序列的一个或两个末端添加或删除1个或多个氨基酸，且与seqidno.1所示的taqdna聚合酶相比，其扩增灵敏度和产量均增强的氨基酸序列。

在本发明的一种实施例中，本发明所述的taqdna聚合酶突变体，所述突变体在seqidno.1所示的序列中，具有下述的一个或多个氨基酸位置上的氨基酸取代，各取代用三联体表示：字母-数字-字母，其中数字表示突变氨基酸的位置，数字前的字母对应突变涉及的氨基酸，数字后的字母表示用于置换数字前氨基酸的氨基酸：k53n，g364d，r636h。

在本发明的一种实施例中，本发明所述的taqdna聚合酶突变体，序列如seqidno.2所示，或与seqidno.2所示序列具有80％同一性的具有taqdna聚合酶活性的氨基酸序列；优选具有85％同一性，更优选具有90％同一性，最优选的，具有95％同一性。

本发明还提供编码本发明所述的taqdna聚合酶突变体的核苷酸序列。

在本发明的一种实施例中，本发明提供一种编码taqdna聚合酶突变体的核苷酸序列，如seqidno.4所示。

本发明还提供一种包含编码本发明所述的taqdna聚合酶突变体的核苷酸序列的重组载体。

本发明还提供本发明所述的taqdna聚合酶突变体，或本发明所述的编码本发明所述的taqdna聚合酶突变体的核苷酸序列，或本发明所述的重组载体在生物技术领域中的应用。更具体优选的，是在pcr领域中，特别是在多重pcr领域中的应用。

本发明所述的pcr扩增试剂、taqdna聚合酶突变体，或本发明所述的编码本发明所述的taqdna聚合酶突变体的核苷酸序列，或本发明所述的重组载体在生物技术领域中的应用，可以按照本领域常规的或现有技术中存在的pcr的体系或流程进行，例如按照中国专利201610140002.x中的整体构建扩增子文库的流程进行。

本发明可以通过选用合适的taqdna聚合酶突变体，然后在扩增体系中加入合适的反应添加剂，调整反应缓冲液的离子浓度，将该扩增试剂与引物消化、接头连接技术相结合，可得到应用于扩增子建库的试剂盒，进一步提高扩增的灵敏度和兼容性，相对于原有的体系，该体系构建的扩增子文库具有产量高，文库均一度好等优点。

本发明所述的pcr扩增试剂，灵敏度和产量均有所提高，还可以用于低质量样本的多重扩增。

相关术语解释

多重pcr(multiplexpcr)：又称多重引物pcr或复合pcr，它是在同一pcr反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的pcr反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般pcr相同。

高通量测序技术：又称为第二代测序技术、下一代测序技术，可简写为ngs。是指一次并行对几十万到几百万条dna分子进行序列测定的技术，其测定序列长度一般较短。高通量测序主要包括以下流程：样本的收集和核酸提取，靶向序列富集和测序文库构建，测序和结果分析。

扩增子文库构建：一般通过pcr扩增富集到目标区域，末端修复后加a连接头，连接接头后的dna片段进行pcr扩增及质控，测序和结果分析。

附图说明

图1是本发明taq-wt和taq-mut多重扩增核酸电泳图；

图2是taq-mut配制3个不同体系的多重扩增核酸电泳图；

图3是扩增子文库agilentbioanalyzer2100检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

按照常规方法使用南京诺唯赞生物科技有限公司的maxmastermix(p515)和ultraonestepcloningkit(c115)对taqdna聚合酶(序列如seqidno.1所示)进行定点突变，用于点突变的引物如下所示，得到突变体，称为taq-mut,其突变位点是：k53n，g364d，r636h(序列如seqidno.2所示)，突变前的核酸序列如seqidno.3所示，突变后的核酸序列如seqidno.4所示。

点突变所用的引物序列(5’-3’)如下：

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将得到的taq-mut用于配制多重扩增体系，通过常规方法提取293t细胞核酸dna作为扩增的模板，反应体系(1×)如下：taq-mut2u，tris25mm，kcl20mm，mgcl21mm，dntp0.2mm，引物10nmeach，ph7.6，dna投入量1ng，对照组用野生型taq(taq-wt)2u,其他组分含量不变，两个重复。

体系中引物为207对，是用于扩增人类肿瘤相关基因热点突变区域的207个引物对。反应程序如下：99℃2min；(99℃15sec；60℃4min)；22个循环；72℃10min；4℃hold。3％的琼脂糖凝胶跑核酸电泳，得到如图1所示结果，可见：使用taq-mut的多重扩增得到的产物电泳条带更亮，说明taq-mut相对于taq-wt灵敏度和产量更高。

实施例2taq-mut在扩增子建库中的应用

使用taq-mut配制如下不同的反应体系进行pcr：

多重扩增反应体系1：taq-mut2u，tris25mm，kcl20mm，mgcl21mm，dntp0.2mm，引物10nmeach,dna投入量1ng,ph7.6；

多重扩增反应体系2：taq-mut2u，tris25mm，kcl20mm，dmso2％，mgcl21mm，dntp0.2mm，引物10nmeach,dna投入量1ng,ph7.6；

多重扩增反应体系3：taq-mut2u，tris25mm，kcl50mm，dmso2％，mgcl21mm，dntp0.2mm，引物10nmeach,dna投入量1ng,ph7.6；

上述3个体系进行多重扩增，293t细胞核酸dna，投入量1ng，反应程序如下：99℃2min；(99℃15sec；60℃4min)；22个循环；72℃10min；4℃hold。3％的琼脂糖凝胶跑核酸电泳，得到如图2所示结果，体系1为低离子浓度(kcl20mm)下，不使用添加剂；体系2为低离子浓度(kcl20mm)下，使用添加剂(dmso2％)；体系3为高离子浓度(kcl50mm)下，使用添加剂(dmso2％)。由图2可知：3个体系都使用taq-mut，相对于体系1，通过使用dmso可以进一步促进扩增，通过添加剂和高离子浓度缓冲液的结合使用，可以再进一步促进扩增。

实施例3

配制用于多重扩增所需的试剂包括扩增试剂multi-pcrmix，该multi-pcrmix是2×浓度，关键组分浓度为：taq-mut4u，tris50mm，kcl100mm，dmso4％，mgcl22mm，dntp0.4mm，ph7.6。结合常规连接需要的adapters和ligationenzymemix，用扩增人类肿瘤相关基因热点突变区域的207个引物对(南京诺唯赞生物科技有限公司，vahtsampseqcancerhotspotpanelna102)，样本是人的ffpe样本和人的cfdna样本各一个，用常规方式提取dna后，反应体系(1×浓度)：taq-mut2u，tris25mm，kcl50mm，mgcl21mm，dmso2％，dntp0.2mm，引物10nmeach，ph7.6，ffpedna投入量10ng/cfdna投入量1ng，引物消化，连接接头，纯化，文库扩增，文库纯化，得到扩增子文库wk1、wk2，用普通野生型taqdna聚合酶试剂，未使用添加剂和高离子浓度的缓冲液，得到的扩增子文库wk3、wk4，通过qubit和qpcr检测上述4个文库的浓度，并通过agilentbioanalyzer2100检测之后于illumina测序平台进行高通量测序，后进行数据分析，得到如表1、图3和表2所述结果。

从表1可知：针对ffpe样本，优化后的体系获得的文库产出(浓度)，通过qubit和qpcr检测后都比优化之前的明显增高；针对cfdna样本，优化后的体系也明显产出更高。

表1：文库产出信息

从图3可知：a图(wk1)和b图(wk3)是针对ffpe样本的行agilentbioanalyzer2100结果，横坐标70-80s位置的峰是目的峰，纵坐标显示的数值代表产量，可知，优化后的体系构建的文库(wk1)产量比未优化的体系高。c图(wk2)和d图(wk4)是针对cfdna样本的agilentbioanalyzer2100结果，横坐标200-300bp位置的峰是目的峰，从图3中可知，优化后的体系(wk2)能获得目的峰，而未优化的体系(wk4)基本无法获得文库。

表2中uniformity表示均一度，该数据显示，无论是ffpe样本还是cfdna样本构建的扩增子文库，优化后的体系均一度显著高于优化前的体系。

表2：扩增子文库下机数据评价

序列表

<110>南京诺唯赞生物科技有限公司

<120>一种pcr扩增试剂及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>832

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

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