本发明属于烟草制品的安全性生物学效应评价技术领域，特别涉及一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞活性氧分泌量影响的方法。
背景技术：
随着人们对健康的关注越来越高，对烟草产品提出了更高的要求，不但要有较好的口感，而且要尽可能的减少人体的不良感受。加热不燃烧卷烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。
加热非燃烧型卷烟，其特征在于加热烟草而非燃烧烟草，向消费者提供一定的烟草特征感受。加热不燃烧卷烟制品研发人员在产品配方设计初期，将不同组份按照不同比例组合调配，形成具有不同风格的初选配方，再结合化学评价和感官评价对配方进行不断筛选调整，形成最终的产品配方。但初选配方数量众多，全部进行感官评价耗时耗力，且感官评价侧重于对产品的风格口感进行筛选，如何利用生物学测试技术对产品初选配方进筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方，目前尚属探索阶段，并无统一的标准方法。
人的机体在遭受各种不利刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ros)产生过多，当氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤，这种现象被称为氧化性损伤。氧化性损伤是一种广谱性损伤机制，活性氧是氧化性损伤的一种重要效应生物标志物，对其进行测定，可用于产品初选配方的进一步筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞活性氧分泌量影响的方法，其以加热不燃烧卷烟总粒相物作为检测基础，为准确评价加热不燃烧卷烟制品对细胞的氧化性损伤影响提供技术支持。
除非另有说明，本发明所采用的百分数均为体积百分数。
本发明中所使用的rpmi1640细胞培养基购买于市场任何可购买到的商品公司。
一种检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞活性氧分泌量影响的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，持续时间3s，抽吸频率为30s的抽吸条件下，连续抽吸10口，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前、抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照公式(1)计算加热不燃烧卷烟总粒相物的质量mtpm；
mtpm＝m1-m0(1)
式中：
m0——抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；
m1——抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；
捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入50ml的三角瓶中，加入二甲基亚砜，使加热不燃烧卷烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/ml；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1ml的冻存管中，-80℃保存待用；
(2)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的制备：人鼻腔上皮细胞rpmi2650复苏后，接种到25cm2细胞培养瓶中，加入10mlrpmi1640细胞培养基，置于37℃、5％co2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的rpmi1640细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1ml0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用rpmi1640细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤(2)所得人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的接种：将步骤(3)计数后的人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液用rpmi1640细胞培养基稀释至2.0×105个/ml，接种到100mm细胞培养皿中，每皿6ml，然后将细胞培养皿置于37℃、5％co2培养箱内培养24h；
(5)受试物暴露：把步骤(1)中制备的样品用pbs稀释成400μg/ml的工作液备用，取出细胞培养皿，去除细胞培养液，将不同剂量的待测液和培养基加入细胞培养板中作为检测样品组，每个检测剂量设4孔平行，置于37℃，5％co2培养箱中培养24h；同时设置阳性对照组，阳性对照物原液为25mg/ml的rosup溶液；
表1细胞活性氧分泌检测加样表
(6)装载探针：步骤(5)暴露培养完成后移除细胞培养板中的细胞培养基，每孔加入终浓度为10μmol/l的2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐dcfh-da荧光探针100μl，37℃、5％co2培养箱中孵育20min；
(7)样品测定：移除步骤(6)细胞培养板中的液体，每孔中的细胞用pbs磷酸盐缓冲液洗3次，去除未进入细胞内的dcfh-da探针，然后在1h～6h内用荧光酶标仪于488nm激发波长下测定光度值；
(8)活性氧水平计算：根据所得光度值，按照下列公式计算样品的活性氧水平，以相对荧光强度表征；
刺激后od值升高则计算活性氧升高率：活性氧升高率＝(刺激后od值-刺激前od值)/刺激前od值×100％；
刺激后od值降低则计算活性氧降低率：活性氧降低率＝(刺激前od值-刺激后od值)/刺激前od值×100％。
本发明有益效果：
本发明综合考察了加热不燃烧卷烟制品的暴露途径，作用方式，建立了加热不燃烧卷烟总粒相物前处理方法，且根据加热不燃烧卷烟制品作用靶细胞选取人鼻腔上皮细胞rpmi2650作为检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合热不燃烧卷烟总粒相物的sod酶活力检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞活性氧分泌量的影响，进而能够有效地评价加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞的氧化性损伤。
具体实施方式
下面将结合具体实例对本发明做详细描述，但并不限制本发明。
实施例1
制备3种(1#、2#、3#)加热不燃烧卷烟用剑桥滤片捕集的总粒相物作为样品，测试其对细胞活性氧分泌量的影响。
具体检测过程，包括以下步骤：
(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，持续时间3s，抽吸频率为30s的抽吸条件下，连续抽吸10口，用直径为44mm的剑桥滤片捕集，分别于抽吸前、抽吸后称量烟气捕集器的质量，按照公式(1)计算加热不燃烧卷烟总粒相物的质量mtpm；
mtpm＝m1-m0(1)
式中：
m0——抽吸前烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；
m1——抽吸后烟气捕集器的质量，单位为毫克(mg)；
捕集完毕后，将捕集后的剑桥滤片放入50ml的三角瓶中，加入二甲基亚砜，使加热不燃烧卷烟总粒相物在二甲基亚砜中的浓度为40mg/ml；将此三角瓶置于超声仪上超声30min；再用无菌滤纸过滤收集二甲基亚砜萃取液，分装至1ml的冻存管中，-80℃保存待用；
(2)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的制备：人鼻腔上皮细胞rpmi2650复苏后，接种到25cm2细胞培养瓶中，加入10mlrpmi1640细胞培养基，置于37℃、5％co2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至85％的汇合率时，移除培养瓶中的rpmi1640细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1ml0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育2min，用rpmi1640细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤(2)所得人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液的接种：将步骤(3)计数后的人鼻腔上皮细胞单细胞悬浮液用rpmi1640细胞培养基稀释至2.0×105个/ml，接种到100mm细胞培养皿中，每皿6ml，然后将细胞培养皿置于37℃、5％co2培养箱内培养24h；
(5)受试物暴露：把步骤(1)中制备的样品用pbs稀释成400μg/ml的工作液备用，取出细胞培养皿，去除细胞培养液，将不同剂量的待测液和培养基加入细胞培养板中作为检测样品组，每个检测剂量设4孔平行，置于37℃，5％co2培养箱中培养24h；同时设置阳性对照组，阳性对照物原液为25mg/ml的rosup溶液；
表1细胞活性氧分泌检测加样表
(6)装载探针：步骤(5)暴露培养完成后移除细胞培养板中的细胞培养基，每孔加入终浓度为10μmol/l的2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐dcfh-da荧光探针100μl，37℃、5％co2培养箱中孵育20min；
(7)样品测定：移除步骤(6)细胞培养板中的液体，每孔中的细胞用pbs磷酸盐缓冲液洗3次，去除未进入细胞内的dcfh-da探针，然后在1h～6h内用荧光酶标仪于488nm激发波长下测定光度值；
(8)活性氧水平计算：根据所得光度值，按照下列公式计算样品的活性氧水平，以相对荧光强度表征；
刺激后od值升高则计算活性氧升高率：活性氧升高率＝(刺激后od值-刺激前od值)/刺激前od值×100％；
刺激后od值降低则计算活性氧降低率：活性氧降低率＝(刺激前od值-刺激后od值)/刺激前od值×100％。
表2.3加热不燃烧卷烟制品对rpmi2650细胞活性氧水平的影响(4h)
由试验结果可以看出，在本发明方法给出的样品处理方法、检测剂量条件下，样品1#、2#、3#与0剂量组相比有显著差异(p<0.05)，在检测剂量范围内与rpmi2650细胞的活性氧水平有剂量效应关系。
本发明综合考察了加热不燃烧卷烟制品的暴露途径，作用方式，建立了加热不燃烧卷烟总粒相物前处理方法，且根据加热不燃烧卷烟制品作用靶细胞选取人鼻腔上皮细胞rpmi2650作为检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞活性氧分泌量影响的方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确检测加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞活性氧分泌量的影响，进而能够有效地评价加热不燃烧卷烟总粒相物对细胞的氧化性损伤。