本发明涉及生物防治菌
技术领域：
，具体为哈茨木霉ltr-2在防治番茄花叶病方面的应用。
背景技术：
：长期以来，番茄病毒病的广泛传播严重影响着番茄的产量和质量。到目前为止，与之相关的病毒已报道的达40多种，其中以番茄花叶病毒引起的花叶病危害最为严重。在我国，番茄病毒病的发生多以番茄花叶病毒侵染为主。番茄花叶病毒(tomatomosaicvirus，tomv)作为引起番茄病毒病最主要的毒原之一，能够侵染茄科、藜科、十字花科和豆科等植物。该病毒尤其是对番茄的危害十分严重。感染番茄花叶病毒的番茄植株出现发育滞缓，整株叶片呈现黄化、皱缩、出现黑褐色或灰白色小点，影响植株坐果；未出现滞育和叶片黄化现象的植株，叶片出现叶脉黄褐色坏死，后沿叶柄蔓延至茎部，出现深褐色坏死条斑，严重时，植株整株枯死，严重影响其产量。早期发病的损失可达50-70％，甚至绝收。此外，病株上成熟的果实也会发生病变，轻者着色不均，严重者果实会出现凹陷的褐色病斑，导致“花脸”果的产生，果实品质大为降低，对其经济生产带来巨大损失。据研究，番茄花叶病毒流行的诱因大致有两种：一是天气原因，如番茄生长期，由于高温、干旱，容易产生花叶病；二是茄科、藜科、十字花科和豆科等植物重茬、连茬时间过久的农田。目前对番茄花叶病毒的防治手段多采用化学防控为主要措施。为有效防控该危害，多数果蔬产区会多次、大量施用化学农药，而化学农药的毒副作用以及化学残留问题至今尚未有效解决，对食品安全也是巨大隐患。由于木霉菌通过分泌抗生素类及酶类等物质，对病原产生抑制作用并能够促进植株生长。本发明借助木霉菌产生的钝化番茄花叶病毒物质进行番茄花叶病的生物防治，以期为保障茄科蔬菜，尤其是番茄产量与品质，为加强食品安全性提供参考。技术实现要素：鉴于此，本发明提供了哈茨木霉ltr-2在防治番茄花叶病方面的应用，该菌株具有钝化番茄花叶病的独特作用，且可对泛起花叶病进行预防，从而可有效防治番茄花叶病。本发明的技术方案如下：哈茨木霉ltr-2在防治番茄花叶病方面的应用，该哈茨木霉(trichodermaharzianum)菌株ltr-2是由山东省科学院生态研究所分离获得并保存，于2005年1月30日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：cgmccno.1498；该哈茨木霉(trichodermaharzianum)菌株ltr-2在防治番茄花叶病方面的应用；该菌株具有钝化番茄花叶病毒的独特作用，从而对番茄花叶病毒引发的番茄花叶病有良好防效。上述哈茨木霉(trichodermaharzianum)菌株ltr-2，菌丝纤细无色，具分隔，多分枝；分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，对生或互生，一般有2～3次分枝，著生分生孢子的小梗呈瓶形或锥形；分生孢子呈球形，孢壁具小疣突，呈蓝绿色；菌落在pda固体培养基上初为白色絮状，后变为暗绿色。所述的哈茨木霉ltr-2在防治番茄花叶病方面的应用，具体为哈茨木霉ltr-2代谢产物在防治番茄花叶病方面的应用。上述代谢产物的制备方法如下：(1)发酵液的获得：将保藏的哈茨木霉ltr-2接种于pda固体培养基，30℃±1℃的温度条件下培养72h后，在超净工作台中取φ＝6mm菌块接种至液体发酵培养基，于30℃±1℃﹑转速160r/min条件下，震荡发酵120h；(2)具有钝化番茄花叶病毒功能的代谢产物的获取：120h发酵结束后，液体发酵产物先后经滤网过滤，取滤液经乙酸乙酯萃取，取下层，用超低温真空干燥，获得干粉；(3)2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液的制备：准确称取(2)中代谢产物干粉2.00g，加入适量无菌水，震荡充分溶解，按质量百分比加入氯化钾5％-6％，双乙酸钠0.1％-0.3％，黄原胶0.2％-0.3％，最终配置为浓度20.00g/l的代谢产物溶液(质量体积比)。在上述代谢产物制备方法的步骤(1)中，液体发酵培养基配方：每1000ml中含有去皮马铃薯200g，加热煮沸20min，8层纱布过滤除滤渣，滤液补充去离子水至1000ml；每1000ml滤液含有葡萄糖20.00g，蛋白胨20.00g，酵母粉5.00g，磷酸二氢钾3.00g，七水硫酸镁1.50g，ph7.0-7.5；500ml三角瓶装100ml液体培养基；0.1mpa，115℃灭菌30min，待冷却到室温条件下使用。所述的哈茨木霉ltr-2在防治番茄花叶病方面的应用，包括在钝化番茄花叶病方面的应用和预防番茄花叶病方面的应用。优选的，将2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液应用在钝化番茄花叶病方面中，2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液为10倍稀释液时，钝化番茄花叶病毒效率达到100％；2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液为100倍稀释液时，钝化番茄花叶病毒效率约为95％；2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液为500倍稀释液时，钝化番茄花叶病毒效率达到85％以上。优选的，将2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液应用在预防番茄花叶病方面中，2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液为10倍稀释液时，对番茄花叶病防效接近90％；2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液为100倍稀释液时，对番茄花叶病防效超过85％；2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液为500倍稀释液时，对番茄花叶病防效约为80％。将2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液在番茄苗期使用和/或在设施地番茄种植中使用，效果更佳。本发明的有益效果：本发明提供了哈茨木霉(trichodermaharzianum)菌株ltr-2在防治番茄花叶病方面的应用，包括钝化番茄花叶病、预防番茄花叶病；利用液体发酵获得钝化及预防番茄花叶病毒活性代谢产物的方法；该代谢产物应用于预防番茄花叶病，为微生物源农药的开发开拓新的途径。本发明与现有技术相比，具有如下优点：本发明与生产常用化学农药相比，对番茄花叶病的防治效果好，一般防治效果在80％以上，最高可达90％；对设施地番茄的防治效果优于露天番茄的防治效果；用于番茄花叶病防治的2％哈茨木霉ltr-2代谢产物制备方法简单，易操作。具体实施方式为了使本
技术领域：
的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。实施例1哈茨木霉ltr-2在防治番茄花叶病方面的应用中，用于防治番茄花叶病的代谢产物的制备方法，如下：(1)发酵液的获得：将保存的哈茨木霉ltr-2接种于pda固体培养基，30℃±1℃条件培养72h后，在超净工作台中取φ＝6mm菌块接种至普通马铃薯糖水液体培养基，于30℃±1℃﹑转速160r/min条件下，震荡发酵120h；(2)具有钝化番茄花叶病毒功能的代谢产物的获取：120h发酵结束后，液体发酵产物先后经滤网过滤，取滤液经乙酸乙酯萃取，取下层，用超低温真空干燥，获得干粉；(3)2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液的制备：准确称取(2)中代谢产物干粉2.00g，加入适量无菌水，震荡充分溶解，按质量百分比加入氯化钾5.50％，双乙酸钠0.20％，黄原胶0.25％，最终配置为浓度20.00g/l的代谢产物溶液(质量体积比)。以下实施例2﹑3﹑4﹑5中所述的2％哈茨木霉ltr-2代谢产物均为实施例1所制；所述产品的百分含量均为质量/体积百分比。实施例2哈茨木霉ltr-2在防治番茄花叶病方面的应用中，对番茄花叶病毒的钝化作用，由以下步骤进行：(1)供试样品液的制备：取上述实施例1中的2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液用无菌水分别稀释为10×、100×和500×(浓度分别为2000mg/l﹑200mg/l和40mg/l)；(2)钝化番茄花叶病毒的测定：采用半叶枯斑法测定供试样品液钝化番茄花叶病毒(tomv)的作用。选择处于真叶期三生烟，右半叶接种经供试样品液处理的含有少量二氧化硅的tomv接种液(tomv接种液和供试样品液体积比为1∶1)100μl，左半叶接种经无菌水处理的含有少量二氧化硅的tomv接种液(tomv接种液和无菌水体积比为1∶1)100μl作为対照，完成接种后用清水冲洗干净，每棵烟草处理1片叶子，每处理15株，重复3次，3d后观察统计左右半叶的枯斑数目，并计算钝化作用效率。钝化作用效率(％)＝(对照平均枯斑数－处理平均枯斑数)/对照平均枯斑数×100％表1哈茨木霉ltr-2对番茄花叶病毒的钝化作用不同处理钝化作用效率(％)10倍稀释的2％哈茨木霉ltr-2代谢产物处理/清水对照99.37±0.64100倍稀释的2％哈茨木霉ltr-2代谢产物处理/清水对照94.54±0.43500倍稀释的2％哈茨木霉ltr-2代谢产物处理/清水对照85.23±0.11结果显示，2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液为10倍稀释液时，钝化番茄花叶病毒效率达到100％；2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液为100倍稀释液时，钝化番茄花叶病毒效率接近95％；2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液为500倍稀释液时，钝化番茄花叶病毒效率达到85％以上。这表明哈茨木霉ltr-2代谢产物对番茄花叶病毒有很好的钝化效果。实施例3哈茨木霉ltr-2在防治番茄花叶病方面的应用中，对番茄花叶病的预防作用，由以下步骤进行：(1)试验在山东省科学院生态所试验田进行，品种为易感品种“中研100”；(2)试验共6个处理：2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液为10倍稀释液，2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液为100倍稀释液，2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液为500倍稀释液，8％嘧肽霉素水剂200倍液，病毒a可湿性粉剂500倍液，清水对照；采用喷雾法施药，每处理30株，3次重复；苗期施药，每隔7天用药1次，连续用药5次；在最后一次施药后10天调查药后病情指数。试验期间平均温度28℃。取样调查每组处理随机调查6株，记录供试各株的病级；(3)病情严重度分级指标：参考中华人民共和国行业标准(ny/t1464-2007)病害分级标准中的番茄花叶病分级标准，以整株为单位进行分级。0级：无病株；1级：明脉，轻花叶；3级：心叶及中部叶片花叶；5级：心叶及中部叶片花叶，少数叶片畸形、皱缩或植株轻度矮化；7级：重花叶，多数叶片畸形、皱缩或植株矮化；9级：重花叶，叶片明显畸形，植株严重矮化，甚至死亡。病情指数＝∑(病级叶数×该级代表值)/调查总叶数×发病最高级防效(％)＝[1－(对照区药前病指×处理区药后病指)/(对照区药后病指×处理区药前病指)]×100％数据统计分析：统计分析用excel2010和spss22.0软件进行，多重比较采用邓肯氏新复极差检验法。表2哈茨木霉ltr-2对番茄花叶病的防效由表2可知，2％哈茨木霉ltr-2代谢产物500倍稀释液对番茄花叶病防治效果(80.36％)较常见化学药剂8％嘧肽霉素(as)200倍液(80.73％)相仿，防效优于常见化学药剂病毒a可湿性粉剂500倍液(73.82％)的防效，并且安全性高。实施例4哈茨木霉ltr-2在防治番茄花叶病方面的应用中，哈茨木霉ltr-2对不同苗期的番茄花叶病的防治，经由以下步骤进行：(1)试验在山东省科学院生态所试验田进行，品种为易感品种“中研100”；(2)试验共5个处理：2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液为100倍稀释液，2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液为500倍稀释液，8％嘧肽霉素水剂200倍液，病毒a可湿性粉剂500倍液，清水对照；5个处理分别于番茄的苗期和成株期进行施药。每7天用药1次，连续用药5次。在最后一次施药后10天调查药后病情指数。试验期间平均温度28℃。取样调查每组处理随机调查6株，记录供试各株的病级；(3)病级分级指标和统计方式见实施例3中(3)实施。表3哈茨木霉ltr-2对不同苗期的番茄花叶病的防治由表3可知，哈茨木霉ltr-2对番茄花叶病的苗期防效和成株期防效分别为80.36％和61.86％，防效优于或接近对照药剂的防效，另外，哈茨木霉ltr-2应用于苗期的防效优于成株期的防效。实施例5哈茨木霉ltr-2在防治番茄花叶病方面的应用中，哈茨木霉ltr-2对设施地/露天的番茄花叶病的防治，经由以下步骤进行：(1)试验在山东农业大学试验田和设施地(温棚)进行，品种为易感品种“中研100”；(2)露天试验和设施地试验均按农业部药检所田间试验准则设计，共5个处理：2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液为100倍稀释液，2％哈茨木霉ltr-2代谢产物溶液为500倍稀释液，8％嘧肽霉素水剂200倍液，病毒a可湿性粉剂500倍液，清水对照。在苗期采用喷雾法施药，在下午17：00后进行，每处理100株，3次重复，每隔7天用药1次，连续用药5次。在最后一次施药后10天调查药后病情指数。每小区采用双对角线固定5点取样，每点调查6株，记录各株病级。病级分级指标和统计方式见实施例3中(3)实施。表4哈茨木霉ltr-2对设施地/露天的番茄花叶病的防治由表4可知，哈茨木霉ltr-2对不同种植条件下的番茄地的番茄花叶病防效略有差异，设施番茄地的防效(82.37％)略优于露天番茄地的防效(79.98％)。当前第1页12