本发明涉及一种灰树花菌株的培养方法以及一种灰树花液体发酵方法。
背景技术：
灰树花(polyporusfrondosus)，又名舞茸、贝叶多孔菌，属真菌门、担子菌亚门、非褶菌目、多孔菌科、多空菌属。灰树花，是食、药兼用蕈菌，夏秋间常野生于栗树周围。子实体肉质，柄短呈珊瑚状分枝，重叠成丛，其外观，婀娜多姿、层叠似菊；其气味、清香四溢，沁人心脾；其肉质脆嫩爽口，百吃不厌。灰树花具有很好的保健作用和很高的药用价值。近年来，灰树花作为一种高级保健食品，风行日本、中国、新加坡等市场。
灰树花多糖具有抗肿瘤、抗高血压、降低血糖、抗肥胖、抗肝炎的药效。灰树花因其增强免疫系统，有助于预防与抵抗因感冒和流感而带来的不适，维护肝肾功能的抗毒性，有助疾病痊愈恢复，帮助机体应付调理环境压力，免疫调节和杀灭细胞以增强常规抗癌疗效，对抗嗜中性白血球减少症和提升生存率的功能而著名。由于灰树花子实体的培养时间周期较长，成本较高，生产过程会造成一定的环境污染，导致目前灰树花的产品还不能满足市场的需求。
通过生物液体深层发酵生产灰树花发酵产物，灰树花菌株生长代谢过程中分泌代谢物质，包含丰富的灰树花多糖、蛋白多糖、维生素、氨基酸和各种微量元素k、p、fe、zn等，主要营养元素高于灰树花植物子实体中的含量，并且更加有利于人体吸收。
然而，目前培养灰树花的方法或者采用灰树花液体发酵效果并不理想，发酵液中能获得的灰树花多糖的浓度普遍不高，通常在4-5重量‰左右。
发明专利内容
本发明为了克服现有技术中通过培养灰树花菌丝体以获得灰树花多糖产量低的缺陷，提供了一种培养灰树花菌丝体的方法以及一种灰树花液体发酵方法。
因此，一方面，本发明提供了一种灰树花菌株的培养方法，其特征在于，在试管培养阶段，试管培养基包括：氮源、碳源、磷酸盐、硫酸盐、琼脂、和栗树水提溶液；所述氮源优选为马铃薯、所述碳源优选为葡萄糖、马铃薯；其中，所述磷酸盐优选为磷酸的钾盐，更优选为kh2po4；所述硫酸盐优选为mgso4。
本发明还提供了一种灰树花菌株的培养方法，其特征在于，在摇瓶培养阶段，摇瓶种子培养液包括氮源、碳源、磷酸盐、硫酸盐、和栗树水提溶液；所述氮源优选为马铃薯或者酵母粉和马铃薯的组合、所述碳源优选为葡萄糖、马铃薯；其中，所述磷酸盐优选为磷酸的钾盐和铵盐，更优选为kh2po4和nh4h2po4；所述硫酸盐优选为mgso4。
本发明还提供了一种灰树花液体发酵方法，其特征在于，该方法包括发酵培养液包括氮源、碳源、磷酸盐、硫酸盐、和栗树水提溶液；所述氮源优选为马铃薯或者酵母粉和马铃薯的组合、所述碳源优选为葡萄糖、马铃薯；其中，所述磷酸盐优选为磷酸的钾盐和铵盐，更优选为kh2po4和nh4h2po4；所述硫酸盐优选为mgso4。
申请人意外发现对于野生繁殖在栗树上的灰树花菌株，在人工培养过程中，如果在培养基中加入一定浓度的栗树水提溶液作为营养补充剂，大大促进了灰树花的生长以及促进了灰树花有效成分的分泌，例如采用本发明的培养方法，在试管阶段，培养4天就能长满试管，而采用常规的培养基培养至少要培养5天才能长满试管；在摇瓶阶段，在其他相同的培养条件下，采用本发明的培养方法培养收集到的菌丝体是采用常规方法培养收集的菌丝体的至少1.5倍；以相同的接种量和相同容量的发酵罐，获得的菌丝干重能提高至少1.5(传统的玉米浆培养基发酵工艺，发酵液中的菌丝干重含量为1.1％左右)倍，优选能提高约2倍；发酵液中获得的灰树花多糖至少提高1.6倍(传统的玉米浆培养基发酵工艺，灰树花多糖含量5.0‰左右)，优选能提高3倍。此外，本申请发明人还发现，在摇瓶培养阶段以及在发酵阶段采用相同成分的培养基，不仅省去采用不同培养基的操作不便，菌株的有效发酵产物仍然比现有技术中的有效发酵产物增加；在优选的情况下，发酵培养基中栗树水提溶液的含量高于摇瓶培养阶段中培养基中的栗树水提溶液的含量。
具体实施方式
本发明提供了一种灰树花菌株的培养方法，其特征在于，在试管培养阶段，试管培养基包括：氮源、碳源、磷酸盐、硫酸盐、琼脂、和栗树水提溶液。
在试管培养阶段，所述氮源可以为本领域采用的任何氮源，例如酵母粉、花生粉、马铃薯粉、氨水、尿素等；但优选为马铃薯、并优选为马铃薯煮水作为氮源。
在试管培养阶段，所述碳源可以为本领域中通常采用的碳源，例如萄萄糖、玉米淀粉、马铃薯粉、甘蔗糖蜜等；但优选为葡萄糖、马铃薯，马铃薯优选为马铃薯煮水作为碳源。
所述磷酸盐可以为本领域通常采用的磷酸盐，但优选为磷酸的钾盐，更优选为kh2po4。
所述硫酸盐可以为本领域通常采用的硫酸盐，但优选为mgso4，更优选为mgso4·7h2o。
所述栗树水提溶液可以采用将栗树的各个部分与水接触一段时间获得，根据接触的温度不同，接触时间进行相应调节，例如可以在室温接触几天，也可以煮沸几十分钟。
为了进一步改善灰树花菌株的培养效果，在一种优选地实施方式中，所述栗树水提溶液是通过包括以下步骤制备的：栗树与水煮沸10分钟到3个小时，更优选为10分钟到1小时，最优选为15-40分钟；其中，所述栗树(以干重计)与水重量比例为1：1-100，优选为1:3-50，更优选为1:5-30，最优选为1:10-20。
尽管对于栗树的具体部分没有特别限制，优选地，所述栗树为栗树的枝杆。
为了更好地培养灰树花菌株，在一种优选地实施方式中，以所述试管培养基的总重量为基准，所述马铃薯的用量为15-30重量％，所述葡萄糖的含量为1-5重量％，kh2po4的含量为0.1-0.5重量％，mgso4的含量为0.05-0.2重量％，vb1的含量为0.0005-0.003重量％，琼脂的含量为0.5-3重量％，余量为栗树水提溶液，且马铃薯是通过以下方式加入：将所述用量的马铃薯煮水，过滤，将过滤后的液体加入；所述栗树水提溶液是通过以下步骤制备：所述栗树(以干重计)与水重量比例为1:10-20，煮沸15-40分钟。
为了更好地培养灰树花菌株，在一种优选地实施方式中，其中，所述试管培养基包括vb1。
在一种优选地实施方式中，其中，在摇瓶培养阶段，摇瓶种子培养液中添加有栗树水提溶液。
本发明还提供了一种灰树花菌株的培养方法，其特征在于，在摇瓶培养阶段，摇瓶种子培养液包括氮源、碳源、磷酸盐、硫酸盐、和栗树水提溶液。
所述氮源可以为本领域采用的任何氮源，例如玉米浆、豆饼粉、酵母粉、花生粉、马铃薯淀粉、氨水、尿素等；但优选为马铃薯、并优选为马铃薯粉；或者优选为酵母粉和马铃薯(优选为马铃薯粉)的组合。
所述碳源可以为本领域中通常采用的碳源，例如葡萄糖、玉米淀粉、马铃薯淀粉、甘蔗糖蜜等；但优选为葡萄糖、马铃薯，马铃薯优选为马铃薯粉。
所述磷酸盐可以为本领域通常采用的磷酸盐，但优选为磷酸的钾盐和铵盐，更优选为kh2po4和nh4h2po4。
所述硫酸盐可以为本领域通常采用的硫酸盐，但优选为mgso4，更优选为mgso4·7h2o。
所述栗树水提溶液可以采用将栗树的各个部分与水接触一段时间获得，根据接触的温度不同，接触时间进行相应调节，例如可以在室温接触几天，也可以煮沸几十分钟。
为了进一步改善灰树花菌株的培养效果，在摇瓶培养阶段，在一种优选地实施方式中，其中，所述栗树水提溶液是通过包括以下步骤制备的：栗树与水煮沸10分钟到3个小时，更优选为10分钟到1小时，最优选为15-40分钟；其中，所述栗树(以干重计)与水重量比例为1：1-100，优选为1:3-50，更优选为1:5-30，最优选为1:10-20。
尽管对于栗树的具体部分没有特别限制，优选地，所述栗树为栗树的枝杆。
为了进一步改善灰树花菌株的培养效果，在一种优选地实施方式中，以所述摇瓶培养液的总重量为基准，所述马铃薯的含量为0.4-0.8重量％，所述葡萄糖的含量为0.8-3重量％，酵母粉的含量为0.1-0.5重量％，kh2po4的含量为0.08-0.3重量％，mgso4的含量为0.01-0.4重量％，nh4h2po4的含量为0.005-0.02重量％，vb1的含量为0.0005-0.003重量％，余量为栗树水提溶液，且该栗树水提溶液是通过以下步骤制备：所述栗树(以干重计)与水重量比例为1:10-20，煮沸15-40分钟；其中，所述培养基的ph值优选为5.5-7，更优选为6-6.5。
为了进一步改善灰树花菌株的培养效果，在一种优选地实施方式中，其中，所述摇瓶种子培养液还包括vb1。
为了进一步改善灰树花菌株的培养效果，在一种优选地实施方式中，其中，在摇瓶培养阶段，在摇瓶培养基中添加有栗树水提溶液。
本发明提供了一种灰树花液体发酵方法，其特征在于，该方法包括发酵培养基包括氮源、碳源、磷酸盐、硫酸盐、和栗树水提溶液
所述氮源可以为本领域采用的任何氮源，例如玉米浆、豆饼粉、酵母粉、花生粉、马铃薯淀粉、氨水、尿素等；但优选为马铃薯、并优选为马铃薯粉；或者优选为酵母粉和马铃薯(优选为马铃薯粉)的组合。
所述碳源可以为本领域中通常采用的碳源，例如葡萄糖、玉米淀粉、马铃薯淀粉、甘蔗糖蜜等；但优选为葡萄糖、马铃薯，马铃薯优选为马铃薯粉。
所述磷酸盐可以为本领域通常采用的磷酸盐，但优选为磷酸的钾盐和铵盐，更优选为kh2po4和nh4h2po4。
所述硫酸盐可以为本领域通常采用的硫酸盐，但优选为mgso4，更优选为mgso4·7h2o。
为了进一步获得更多的灰树花菌丝体和提高发酵液中灰树花多糖的量，在一种优选地实施方式中，其中，所述栗树水提溶液是通过包括以下步骤制备的：栗树与水煮沸10分钟到3个小时，更优选为10分钟到1小时，最优选为15-40分钟；其中，所述栗树(以干重计)与水重量比例为1：1-100，优选为1:3-50，更优选为1:5-30，最优选为1:8-15。
尽管对于栗树的具体部分没有特别限制，优选地，所述栗树为栗树的枝杆。
为了进一步获得更多的灰树花菌丝体和提高发酵液中灰树花多糖的量，在一种优选地实施方式中，以所述发酵培养液的总重量为基准，所述马铃薯的含量为0.4-0.8重量％，所述葡萄糖的含量为0.8-3重量％，酵母粉的含量为0.1-0.5重量％，kh2po4的含量为0.08-0.3重量％，mgso4的含量为0.01-0.4重量％，nh4h2po4的含量为0.005-0.02重量％，vb1的含量为0.0005-0.003重量％，余量为栗树水提溶液，且该栗树水提溶液是通过以下步骤制备：所述栗树(以干重计)与水重量比例为1:8-15，煮沸15-40分钟；其中，所述培养基的ph值优选为5.5-7，更优选为6-6.5。
为了进一步获得更多的灰树花菌丝体和提高发酵液中灰树花多糖的量，在一种优选地实施方式中，其中，所述发酵培养液还包括vb1。
优选地，所述方法还包括在发酵结束后将发酵液和菌丝体分离的步骤；所述分离方法可以采用简单的固液分离，例如，过滤，离心。优选地，发酵液中灰树花多糖的含量为8‰以上，优选为10‰以上，更优选为12‰以上，更优选为14‰以上，最优选为15‰以上；其中菌丝体干重为1.5％以上，优选为2％以上。
所分离的发酵液可以直接利用，也可以浓缩干燥后利用，还可以将多糖分离出来后利用；该发酵液可以用于食品、保健品、化妆品等；例如，发酵液可以在灭菌后作为饮料，作为食品和保健品的营养补充剂；发酵液还可以在化妆品领域作为原液使用，或者作为营养补充剂。
所分离的菌丝体在粉碎后也可以用于食品、保健品等。
为了进一步获得更多的灰树花菌丝体和提高发酵液中灰树花多糖的量，在一种优选地实施方式中，其中，在灰树花菌株试管培养阶段，在试管培养基中添加有栗树水提溶液；和/或，在灰树花菌株摇瓶培养阶段，在摇瓶种子培养液中添加有栗树水提溶液；优选地，在发酵阶段的培养基中的栗树水提溶液的浓度高于在摇瓶培养阶段的培养基中的栗树水提溶液的浓度和试管培养阶段的培养基中的栗树水提溶液的浓度，在摇瓶培养阶段和发酵阶段的培养基的其它成分相同；优选地，在发酵阶段的培养基中的栗树水提溶液的浓度比在摇瓶培养阶段的培养基中的栗树水提溶液的浓度高至少1％以上，更优选高于2％以上，最优选高于3％以上。
优选地，在摇瓶种子培养阶段和发酵阶段，培养液均以培养液的总重量计基准，所述马铃薯的含量为0.4-0.8重量％，所述葡萄糖的含量为0.8-3重量％，酵母粉的含量为0.1-0.5重量％，kh2po4的含量为0.08-0.3重量％，mgso4的含量为0.01-0.4重量％，nh4h2po4的含量为0.005-0.02重量％，vb1的含量为0.0005-0.003重量％，余量为栗树水提溶液，且该栗树水提溶液是通过以下步骤制备：所述栗树(以干重计)与水重量比例为1:8-15，煮沸15-40分钟；其中，所述培养基的ph值优选为5.5-7，更优选为6-6.5；优选地，在发酵阶段的培养基中的栗树水提溶液的浓度比在摇瓶培养阶段的培养基中的栗树水提溶液的浓度高至少1％以上，更优选高于2％以上，最优选高于3％以上。
实施例1
1、灰树花菌种斜面试管培养：
栗树水提溶液的制备：将栗树树枝(干重)与去离子水以7：100混合，煮沸20min，纱布过滤得到栗树水提溶液。
pda培养基(g/l)：马铃薯250g，加入500ml去离子水煮沸30min，纱布过滤取滤液；加入葡萄糖30g，kh2po42g，mgso4·7h2o0.8g，vb10.01g，琼脂15g，加上述制备的栗树水提溶液定容至1l。
菌种培养阶段：从灰树花菌种(中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号：accc51818)储藏试管中挖取1块(1*1cm)菌苔接种于固体pda培养基，进行活化、复壮，接种菌种后在24℃下恒温箱培养4天，得到生长旺盛(长满试管)，无杂菌的灰树花活化菌株。
2、灰树花摇瓶种子液培养：
栗树水提溶液的制备：将栗树树枝(干重)与去离子水以9：100混合，煮沸20min，纱布过滤得到栗树水提溶液。
摇瓶种子液培养基(g/l)：葡萄糖15g，马铃薯粉6g，酵母粉2g，kh2po41.5g，mgso4·7h2o0.7g，nh4h2po40.3g，vb10.01g，加入上述制备的栗树水提溶液定容至1l，ph调节为6。
摇瓶培养阶段：使用接菌铲挖取已活化、生长旺盛的灰树花菌苔4块(1*1cm)，接种于90ml摇瓶种子液培养基中，培养温度25℃，摇床培养4天，得到灰树花发酵种子液。收集其中一瓶的菌丝体，干燥称重，得到0.009g菌丝体/ml发酵液。
3、灰树花液体发酵培养
发酵液体培养基(g/l)：葡萄糖450g，马铃薯粉180g，酵母粉60g，kh2po445g，mgso4·7h2o21g，nh4h2po49g，vb10.3g，加入步骤2中制备的栗树水提溶液定容至30l，ph调节为6。
发酵培养阶段：使用培养好的灰树花种子液接种到发酵液体培养基中，接种量为9％，发酵罐总容量为30l，发酵液含量为发酵罐总体积的70％。调节发酵温度为25℃，通入无菌空气。当发酵培养基中还原糖含量低于3‰时，终止发酵。通过离心分离，获得灰树花菌丝体和发酵液。将菌丝干燥称重，得到0.017g菌丝体/ml发酵液，通过苯酚-硫酸法检测发酵液中灰树花多糖的浓度为9.87‰。
实施例2
1、灰树花菌种斜面试管培养：
栗树水提溶液的制备：将栗树树枝(干重)与去离子水以5：100混合，煮沸50min，纱布过滤得到栗树水提溶液。
pda培养基(g/l)：马铃薯150g，加入500ml去离子水煮沸30min，纱布过滤取滤液；加入葡萄糖50g，kh2po45g，mgso4·7h2o0.5g，vb10.03g，琼脂30g，加上述制备的栗树水提溶液，定容至1l。
菌种培养阶段：从灰树花菌种(中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号：accc51818)储藏试管中挖取1块(1*1cm)菌苔接种于固体pda培养基，进行活化、复壮，接种菌种后在24℃下恒温箱培养4天，得到生长旺盛(长满试管)，无杂菌的灰树花活化菌株。
2、灰树花摇瓶种子液培养：
栗树水提溶液的制备：将栗树树枝(干重)与去离子水以7：100混合，煮沸40min，纱布过滤得到栗树水提溶液。
摇瓶种子液培养基(g/l)：葡萄糖30g，土豆粉4g，酵母粉5g，kh2po43g，mgso4·7h2o0.2g，nh4h2po40.8g，vb10.008g，加入上述制备的栗树水提溶液定容至1l，ph调节为6.5。
摇瓶培养阶段：使用接菌铲挖取已活化、生长旺盛的灰树花菌苔4块(1*1cm)，接种于90ml摇瓶种子液培养基中，培养温度25℃，摇床培养4天，得到灰树花发酵种子液。收集其中一瓶的菌丝体，干燥称重，得到0.010g菌丝体/ml发酵液。
3、灰树花液体发酵培养
栗树水提溶液的制备：将栗树树枝(干重)与去离子水以9：100混合，煮沸40min，纱布过滤得到栗树水提溶液。
发酵液体培养基(g/l)：葡萄糖900g，土豆粉120g，酵母粉150g，kh2po490g，mgso4·7h2o6g，nh4h2po42.4g，vb12.4g，加入上述制备的栗树水提溶液定容至30l，ph调节为6.5。
发酵培养阶段：使用培养好的灰树花种子液接种到发酵液体培养基中，接种量为9％，发酵罐总容量为30l，发酵液含量为发酵罐总体积的70％。调节发酵温度为25℃，通入无菌空气。当发酵培养基中还原糖含量低于3‰时，终止发酵。通过离心分离，获得灰树花菌丝体和发酵液。将菌丝干燥称重，得到0.019g菌丝体/ml发酵液，通过苯酚-硫酸法检测发酵液中灰树花多糖的浓度为10.95‰。
实施例3
1、灰树花菌种斜面试管培养：
栗树水提溶液的制备：将栗树树枝(干重)与去离子水以7：100混合，煮沸40min，纱布过滤得到栗树水提溶液。
pda培养基(g/l)：马铃薯300g，加入500ml去离子水煮沸30min，纱布过滤取滤液；加入葡萄糖10g，kh2po43g，mgso4·7h2o1.5g，vb10.01g，琼脂5g，加上述制备的栗树水提溶液，定容至1l。
菌种培养阶段：从灰树花菌种(中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号：accc51818)储藏试管中挖取1块(1*1cm)菌苔接种于固体pda培养基，进行活化、复壮，接种菌种后在24℃下恒温箱培养4天，得到生长旺盛(长满试管)，无杂菌的灰树花活化菌株。
2、灰树花摇瓶种子液培养：
栗树水提溶液的制备：将栗树树枝(干重)与去离子水以6：100混合，煮沸50min，纱布过滤得到栗树水提溶液。
摇瓶种子液培养基(g/l)：葡萄糖15g，土豆粉8g，酵母粉3g，kh2po42g，mgso4·7h2o2g，nh4h2po40.6g，vb10.03g，加入上述制备的栗树水提溶液定容至1l，ph调节为6.5。
摇瓶培养阶段：使用接菌铲挖取已活化、生长旺盛的灰树花菌苔4块(1*1cm)，接种于90ml摇瓶种子液培养基中，培养温度25℃，摇床培养4天，得到灰树花发酵种子液。收集其中一瓶的菌丝体，干燥称重，得到0.011g菌丝体/ml发酵液。
3、灰树花液体发酵培养
栗树水提溶液的制备：将栗树树枝(干重)与去离子水以12：100混合，煮沸20min，纱布过滤得到栗树水提溶液。
发酵液体培养基(g/l)：葡萄糖450g，土豆粉240g，酵母粉90g，kh2po460g，mgso4·7h2o60g，nh4h2po418g，vb10.9g，加入上述制备的栗树水提溶液定容至30l，ph调节为6.5。
发酵培养阶段：使用培养好的灰树花种子液接种到发酵液体培养基中，接种量为9％，发酵罐总容量为30l，发酵液含量为发酵罐总体积的70％。调节发酵温度为25℃，通入无菌空气。当发酵培养基中还原糖含量低于3‰时，终止发酵。通过离心分离，获得灰树花菌丝体和发酵液。将菌丝干燥称重，得到0.021g菌丝体/ml发酵液，通过苯酚-硫酸法检测发酵液中灰树花多糖的浓度为15.85‰。
实施例4
1、灰树花菌种斜面试管培养：
pda培养基(g/l)：马铃薯250g，加入500ml去离子水煮沸30min，纱布过滤取滤液；加入葡萄糖30g，kh2po42g，mgso4·7h2o0.8g，vb10.01g，琼脂15g，加如去离子水，定容至1l。
菌种培养阶段：从灰树花菌种(中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号：accc51818)储藏试管中挖取1块(1*1cm)菌苔接种于固体pda培养基，进行活化、复壮，接种菌种后在24℃下恒温箱培养4天，得到生长旺盛(长满试管)，无杂菌的灰树花活化菌株。
2、灰树花摇瓶种子液培养：
栗树水提溶液的制备：将栗树树枝(干重)与去离子水以9：100混合，煮沸20min，纱布过滤得到栗树水提溶液。
摇瓶种子液培养基(g/l)：葡萄糖10g，马铃薯粉6g，酵母粉2g，kh2po41.5g，mgso4·7h2o0.7g，nh4h2po40.3g，vb10.01g，加入上述制备的栗树水提溶液定容至1l，ph调节为6。
摇瓶培养阶段：使用接菌铲挖取已活化、生长旺盛的灰树花菌苔4块(1*1cm)，接种于90ml摇瓶种子液培养基中，培养温度25℃，摇床培养4天，得到灰树花发酵种子液。收集其中一瓶的菌丝体，干燥称重，得到0.009g菌丝体/ml发酵液。
3、灰树花液体发酵培养
发酵液体培养基(g/l)：葡萄糖300g，马铃薯粉180g，酵母粉60g，kh2po445g，mgso4·7h2o21g，nh4h2po49g，vb10.3g，加入步骤2中制备的栗树水提溶液定容至30l，ph调节为6。
发酵培养阶段：使用培养好的灰树花种子液接种到发酵液体培养基中，接种量为9％，发酵罐总容量为30l，发酵液含量为发酵罐总体积的70％。调节发酵温度为25℃，通入无菌空气。当发酵培养基中还原糖含量低于3‰时，终止发酵。通过离心分离，获得灰树花菌丝体和发酵液。将菌丝干燥称重，得到0.017g菌丝体/ml发酵液，通过苯酚-硫酸法检测发酵液中灰树花多糖的浓度为9.87‰。
实施例5
1、灰树花菌种斜面试管培养：
pda培养基(g/l)：马铃薯250g，加入500ml去离子水煮沸30min，纱布过滤取滤液；加入葡萄糖30g，kh2po42g，mgso4·7h2o0.8g，vb10.01g，琼脂15g，加如去离子水，定容至1l。
菌种培养阶段：从灰树花菌种(中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号：accc51818)储藏试管中挖取1块(1*1cm)菌苔接种于固体pda培养基，进行活化、复壮，接种菌种后在24℃下恒温箱培养5天，得到生长旺盛(长满试管)，无杂菌的灰树花活化菌株。
2、灰树花摇瓶种子液培养：
摇瓶种子液培养基(g/l)：葡萄糖15g，马铃薯粉6g，酵母粉2g，kh2po41.5g，mgso4·7h2o0.7g，nh4h2po40.3g，vb10.01g，加入去离子水，定容至1l，ph调节为6。
摇瓶培养阶段：使用接菌铲挖取已活化、生长旺盛的灰树花菌苔4块(1*1cm)，接种于90ml摇瓶种子液培养基中，培养温度25℃，摇床培养4天，得到灰树花发酵种子液。收集其中一瓶的菌丝体，干燥称重，得到0.008g菌丝体/ml发酵液。
3、灰树花液体发酵培养
发酵液体培养基(g/l)：葡萄糖450g，马铃薯粉180g，酵母粉60g，kh2po445g，mgso4·7h2o21g，nh4h2po49g，vb10.3g，加入步骤2中制备的栗树水提溶液定容至30l，ph调节为6。
发酵培养阶段：使用培养好的灰树花种子液接种到发酵液体培养基中，接种量为9％，发酵罐总容量为30l，发酵液含量为发酵罐总体积的70％。调节发酵温度为25℃，通入无菌空气。当发酵培养基中还原糖含量低于3‰时，终止发酵。通过离心分离，获得灰树花菌丝体和发酵液。将菌丝干燥称重，得到0.016g菌丝体/ml发酵液，通过苯酚-硫酸法检测发酵液中灰树花多糖的浓度为9.16‰。
实施例6
1、灰树花菌种斜面试管培养：
栗树水提溶液的制备：将栗树树枝(干重)与去离子水以7：100混合，煮沸40min，纱布过滤得到栗树水提溶液。
pda培养基(g/l)：马铃薯300g，加入500ml去离子水煮沸30min，纱布过滤取滤液；加入葡萄糖10g，kh2po43g，mgso4·7h2o1.5g，vb10.01g，琼脂5g，加上述制备的栗树水提溶液，定容至1l。
菌种培养阶段：从灰树花菌种(中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号：accc51818)储藏试管中挖取1块(1*1cm)菌苔接种于固体pda培养基，进行活化、复壮，接种菌种后在24℃下恒温箱培养4天，得到生长旺盛(长满试管)，无杂菌的灰树花活化菌株。
2、灰树花摇瓶种子液培养：
栗树水提溶液的制备：将栗树树枝(干重)与去离子水以6：100混合，煮沸50min，纱布过滤得到栗树水提溶液。
摇瓶种子液培养基(g/l)：葡萄糖15g，土豆粉8g，酵母粉3g，kh2po42g，mgso4·7h2o2g，nh4h2po40.6g，加入上述制备的栗树水提溶液定容至1l，ph调节为6.5。
摇瓶培养阶段：使用接菌铲挖取已活化、生长旺盛的灰树花菌苔4块(1*1cm)，接种于90ml摇瓶种子液培养基中，培养温度25℃，摇床培养4天，得到灰树花发酵种子液。收集其中一瓶的菌丝体，干燥称重，得到0.010g菌丝体/ml发酵液。
3、灰树花液体发酵培养
栗树水提溶液的制备：将栗树树枝(干重)与去离子水以12：100混合，煮沸20min，纱布过滤得到栗树水提溶液。
发酵液体培养基(g/l)：葡萄糖450g，土豆粉240g，酵母粉90g，kh2po460g，mgso4·7h2o60g，nh4h2po418g，加入上述制备的栗树水提溶液定容至30l，ph调节为6.5。
发酵培养阶段：使用培养好的灰树花种子液接种到发酵液体培养基中，接种量为9％，发酵罐总容量为30l，发酵液含量为发酵罐总体积的70％。调节发酵温度为25℃，通入无菌空气。当发酵培养基中还原糖含量低于3‰时，终止发酵。通过离心分离，获得灰树花菌丝体和发酵液。将菌丝干燥称重，得到0.020g菌丝体/ml发酵液，通过苯酚-硫酸法检测发酵液中灰树花多糖的浓度为14.69‰。
对比例1
1、灰树花菌种斜面试管培养：
pda培养基(g/l)：马铃薯250g，加入500ml去离子水煮沸30min，纱布过滤取滤液；加入葡萄糖20g，kh2po41.5g，mgso4·7h2o1g，vb10.01g，琼脂15g，加去离子水，定容至1l。
菌种培养阶段：从灰树花菌种(中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号：accc51818)储藏试管中挖取1块(1*1cm)菌苔接种于固体pda培养基，进行活化、复壮，接种菌种后在24℃下恒温箱培养5天，得到生长旺盛(长满试管)，无杂菌的灰树花活化菌株。
2、灰树花摇瓶种子液培养：
摇瓶种子液培养基(g/l)：葡萄糖15g，玉米浆20g，酵母粉3g，kh2po42g，mgso4·7h2o1.5g，nh4h2po40.6g，加去离子水定容至1l，ph调节为6.5。
摇瓶培养阶段：使用接菌铲挖取已活化、生长旺盛的灰树花菌苔4块(1*1cm)，接种于90ml摇瓶种子液培养基中，培养温度25℃，摇床培养5天，得到灰树花发酵种子液。收集其中一瓶的菌丝体，干燥称重，得到0.003g菌丝体/ml发酵液。
3、灰树花液体发酵培养
发酵液体培养基(g/l)：葡萄糖450g，玉米浆600g，酵母粉90g，kh2po460g，mgso4·7h2o45g，nh4h2po418g，加去离子水定容至30l，ph调节为6.5。
发酵培养阶段：使用培养好的灰树花种子液接种到发酵液体培养基中，接种量为9％，发酵罐总容量为30l，发酵液含量为发酵罐总体积的70％。调节发酵温度为25℃，通入无菌空气。当发酵培养基中还原糖含量低于3‰时，终止发酵。通过离心分离，获得灰树花菌丝体和发酵液。将菌丝干燥称重，得到0.012g菌丝体/ml发酵液，通过苯酚-硫酸法检测发酵液中灰树花多糖的浓度为4.5‰。