一种通过转化旱柳SmZIP蛋白提高植物重金属Cd转运能力及抗性的方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种通过转化旱柳smzip蛋白提高植物重金属cd转运能力及抗性的方法。

背景技术：

重金属cd污染严重威胁着生态环境和人类健康，治理重金属污染的方法分为物理修复、化学修复和生物修复，植物修复技术以其不破坏土壤生态环境、安全廉价、不造成二次污染等特点，已成为国内外研究和开发的热点领域。到目前为止，已发现了450多种重金属超富集积累植物。然而，现已发现的超富集植物多为草本，地上部生物量小，富集及转移重金属量少，修复时间长，效率低，直接限制了植物修复的效果，所以重金属超积累植物一般仅作为重金属吸收和忍耐机理研究的材料。木本植物对重金属的富集能力方面不如草本超富集积累植物，但是，多年生、高大的速生木本植物由于生物量大、根系发达、不与食物链相连等特性使得其在治理重金属污染的土壤中具有更明显的优越性，具有成为植物修复候选植物的潜力。

锌-铁转运蛋白(zip)在植物、动物、真菌和细菌中均被检测到，主要吸收和运输fe、zn、mn、cd、co和ni等二价金属离子，zip属于跨膜蛋白，不仅位于细胞质膜上，还位于叶绿体膜及液泡膜上，zip家族氨基酸序列为309-476个，其氨基酸组成中含有多个疏水集团，有8个跨膜区，n-端和c-端均位于膜外侧，将二价金属离子从胞外运输至胞内。

通过生物技术将锌-铁转运蛋白(zip)进行转化或者过表达，从而提高速生木本植物的重金属转运能力和抗性，提高植物修复的效率。因此，本发明将为植物修复实践提供理论基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种通过转化旱柳smzip蛋白提高植物重金属cd转运能力及抗性的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种蛋白质在如下a1)-a2)任一中的应用：

a1)提高植物重金属cd转运能力及抗性；

a2)选育具有重金属cd高转运能力及高抗性的植物品种；

所述蛋白质具有序列表中序列1所示的氨基酸序列。

一种蛋白质的编码基因或含有所述编码基因的重组载体在如下a1)-a2)任一中的应用：

a1)提高植物重金属cd转运能力及抗性；

a2)选育具有重金属cd高转运能力及高抗性的植物品种；

所述编码基因具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。

一种通过转化旱柳smzip蛋白提高植物重金属cd转运能力及抗性的方法

包括如下步骤：

a)向目的植物中导入蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，重金属cd转运能力及抗性得到提高的转基因植物；

所述smzip蛋白由350个氨基酸组成，在所述方法中，所述编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pcambia3301、pcambia2300、pcambia2301、pcambia1300、pcambia1301、pwm101、pgreen0029、pbi121、pbin19、pcambia1301-ubin等或其它衍生植物表达载体。

在本发明中，所述重组表达载体具体为如下所述：

将如序列表中序列2所述的dna片段插入含有酶切位点kpni和bamhi的载体pmd18，得到重组质粒pmd18-t-smzip。

其中，序列2的编码dna片段是通过设计的引物(smzip-f、smzip-r)，以旱柳的cdna为模板，扩增出smzip基因的全序列，将pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化目的条带后连t载体，引物序列如下：

smzip-f:5’-cggaattcccttcatcttcaatcccttct-3’，见序列表序列3；

smzip-r:5’-cgcggatccctacaggttcaagcccattt-3’，见序列表序列4；

用碱裂法提取含有smzip基因序列的t载体质粒，用限制性内切酶kpni/bamhi，回收酶切产物，将其与经过同样双酶切的pcambia2300-35s-ocs载体的骨架片段相连，构建表达载体pcambia2300-smzip。

在上述方法中，将携带有所述编码基因的所述重组表达载体导入所述目的植物，具体可为：使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、电击法/农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在上述应用或方法中，所发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此被转化的植物即可来源于烟草、油菜、棉花、大豆、杨树、桉树、小麦、水稻、玉米、苜蓿等。

在上述应用或方法中，所述植物具体为野生型烟草。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过基因工程技术将此基因转移到野生型烟草中，使其在植物细胞中特异表达，可以显著提高其对重金属cd的转运能力及抗性；本发明的方法具有广泛的实用性，可获得新型的对cd具有高转运能力及抗性的植物品种。

附图说明

图1为转基因烟草基因组pcr验证结果图。

图2为转基因烟草植株生长至花期图片。

图3为野生型和smzip转基因型烟草叶片在cd胁迫第28天时的生长情况，其中smzip-ck和wt-ck为转基因型和野生型烟草未受到cd胁迫时的的叶片；smzip-1和wt-1为转基因型和野生型烟草受到10μmol/lcdcl2溶液处理28天时的叶片；smzip-2和wt-2为转基因型和野生型烟草受到100μmol/lcdcl2溶液处理28天时的叶片。

对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。实施例中应用的生物材料的来源如下所述：野生型烟草保存于天津师范大学生命科学学院实验室。大肠杆菌(escherichiacoli)dh5α和农杆菌(agrobacterium)c58购自上海唯地生物技术有限公司。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明的基因来源于旱柳(salixmatsudanakoidz.)的zip基因，genbank号为ku921227，其序列全长为1140bp，包含一个1053bp的开放阅读框，编码350个氨基酸，编码框位置是：71bp-1123bp，5’非编码区70bp，3’非编码区17bp。序列为(见序列表序列2)：

cggattcccttcatcttcaatcccttctcctcaactttgcaaacaaattttctcttgatatcatctcaccatgcagagttctatcaaattttatttaaagttcttttgcttgcttctgctactccctactcttgctttaggagaatgcacatgtgatgcagcaggaggagaagacacgaataaatctgaggccttgaaatacaaagccgcagcaattgcttctatcctttttgcgggtgcagttggagtttgtattccagttcttggaaaaaagatccctgttttaagccctgaaaggagtattttcttcatcatcaaagcttttgcggccggtgttatattgtcgacagcctttattcatgtgcttcccgatgcttttgatagcttgacatcgccatgcctcgctgagaatccttggggtaaatttcccttcacgggttttgtggcaatgatgtcggcaattgggactttaatggtggattgtcttgctagttcttattttacacggttgcacctcatcaaggctcaaccagaggagagcggggacgaggagaaggcagcaggagaggctcatgttcatactcatgcccattctcatggcatagttgcggatagttctggttctgctccatctcctcagcttattcgccatcgggttattactcaggttctcgagttgggaattgtggtgcactctgtgattataggagtttctctgggagcttcttcaagtcccaagacaataagacctctagtgggtgccctaagctttcaccaattttttgagggtataggacttggtggatgcattactcaggcaaaattcaagaccaaaactatggtgacaatgggactcttcttctctctaacaaccccagttggaattgcagtcgggttaggcatatcaaatgtctataacgagagcagtcctaatgctcttattgttgaaggaatttttaatgccgcatcagctggtatcctaatctacatggctcttgtggatcttctggcagctgattttatgcatccaagagtgcaaagtaatggagctcttcaacttggggtcaacgtttctcttcttctaggagttggctgtatgtctctcatcgccaaatgggcttgaacctgtagggatccgcg。

所编码的氨基酸序列为(见序列表序列1)：

mqssikfylkffclllllptlalgectcdaaggedtnksealkykaaaiasilfagavgvcipvlgkkipvlspersiffiikafaagvilstafihvlpdafdsltspclaenpwgkfpftgfvammsaigtlmvdclassyftrlhlikaqpeesgdeekaageahvhthahshgivadssgsapspqlirhrvitqvlelgivvhsviigvslgassspktirplvgalsfhqffegiglggcitqakfktktmvtmglffslttpvgiavglgisnvynesspnalivegifnaasagiliymalvdllaadfmhprvqsngalqlgvnvslllgvgcmsliakwa

1.smzip基因的克隆

(1)合成smzip基因的cdna的第一链

选取来自天津师范大学生命科学学院培养的旱柳(salixmatsudanakoidz.)插条，生根培养7天后，取幼根液氮速冻，用easyspin植物microrna快速提取试剂盒(艾德莱，北京)提取根部总rna，再使用transscriptfirst-strandcdnasynthesis试剂盒(20μl体系)，以旱柳总rna为模板合成cdna的第一链，反转录体系如下：

使反应物充分混匀，pcr条件是25℃10min；42℃30min；85℃5min。产物立即使用或保存于-20℃冷冻保存。

(2)设计引物

利用生物学软件primeprime5.0设计用于扩增smzip基因的上下游引物：

smzip-f:5’-cggaattcccttcatcttcaatcccttct-3’；

smzip-r:5’-cgcggatccctacaggttcaagcccattt-3’；

以旱柳cdna第一链为模板开始扩增smzip基因的全长，pcr反应体系如下：

pcr反应条件为：94℃4min；94℃30s，56.4℃30s，72℃1min20s(34cycles)；72℃8min；4℃∞。pcr产物经电泳检测。

(3)smzip目的基因的回收、纯化、菌落验证与测序

pcr扩增产物经过1％琼脂糖凝胶电泳验证后，由dna琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化，将纯化的smzip基因插入到pmd18-t载体，热击转化法将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性菌落进行菌落pcr验证，再将含有目的条带的菌株重新摇菌，送至华大基因测序。

2.smzip基因植物表达载体的构建

(1)用质粒提取试剂盒提取含有smzip基因序列的t载体质粒，用限制性内切酶kpni和bamhi酶切，回收酶切产物；

(2)用限制性内切酶kpni和bamhi酶切载体pcambia2300-35s-ocs(本实验室保存)，回收载体骨架；

(3)用t4-dna连接酶(takara)将步骤(1)的酶切产物和步骤(2)的载体骨架连接，连接体系如下：

(4)将上述反应体系混匀，离心，16℃过夜连接；

(5)将产物热激转化大肠杆菌感受态，37℃过夜培养，生长出白色菌落，挑菌验证，验证结果表明得到正确的重组质粒。

3.植物表达载体的农杆菌转化c58

(1)从-80℃中取出农杆菌c58感受态细胞，低温融化，吸取5μl表达载体加入到融化的感受态细胞中，用微量移液器混匀；将混匀的溶液迅速加入预冷的电击杯中，冰上放置1min(所有操作步骤均在冰上完成)；设置电击转化仪电压为1500v-2000v；

(2)电击后，立即加入0.5mlyep液体培养基，混匀后将其转入1.5mlep管中，28℃，180rpm，培养3h以上；

(3)吸取50μl上述培养的菌液，均匀涂布于含有抗生素yep固体平板(含100mg/lkan)，28℃培养48-72h，直至观察到清晰的单菌落；

(4)菌落pcr验证，阳性克隆用于烟草植株的转化。

4.利用农杆菌介导的烟草叶盘法转化

(1)取适量饱满的野生型烟草种子，氯气(20mlnaclo和3ml浓hcl)灭菌1h，将种子均匀洒在培养基a平板上，每板大约接种50粒种子；培养皿用封口膜封口，置于26℃，16h/8h光周期中培养，幼苗发芽后长出新叶，将其移入培养基a的组培瓶中继续培养，培养约3周后，幼苗可用于侵染实验；

(2)将构建好的含有植物表达载体pcambia2300-smzip的c58农杆菌和含有pcambia2300-35s-ocs载体的c58农杆菌活化，划线培养，培养条件为28℃培养48-72h；从上述平板中分别挑取单菌落，并将其分别接种于5mlyep液体培养基(含100mg/lkan)中，28℃，180rpm培养过夜；分别取400μl上述菌液，分别接种于50mlyep液体培养基(含100mg/lkan)中，置于28℃，180rpm摇床中培养，培养至od600值大约为0.5以上；将上述菌液分别移入灭菌的50ml离心管中，4℃，4000rpm，离心10min，收集菌体；集于管底的菌体分别用1/2ms液体培养基重悬，再加入as，用于后续侵染实验；

(3)选取长势较好的无菌烟草幼苗，在灭菌的滤纸上将叶片切成约1cm²的叶盘，放入上述制备好的菌液中，侵染20min，期间轻轻摇晃两次；取出叶片，并用无菌滤纸将叶片上的菌液吸干，将叶片正面朝下放置于含有无菌滤纸的培养基b表面，用封口膜密封平皿，25℃，暗培养3天；

(4)待含有筛选培养基的组织培养瓶中抗性芽生长至1.0cm时，可将其切下转入含有培养基d的组织培养瓶中诱导生根，培养条件为16h/8h光周期，当组织培养瓶中的烟草幼苗根生长至3cm以上，根比较多，幼苗生长比较健壮时，打开组培瓶的瓶盖，在温室中进行炼苗，炼苗一般需要2-3天。将烟草幼苗从组培瓶中取出，用手轻轻去掉根部的培养基，用清水清洗根部，注意不要弄伤组培苗的根与叶片。将烟草幼苗移栽到以蛭石和营养土为基质的小花盆中，浇水后用保鲜膜覆盖，温室培养。待幼苗长大到一定阶段，将其移入大花盆中，继续生长。

5.t0代转基因烟草的dna水平验证

(1)用ctab法提取转基因烟草的基因组dna，同时提取野生型烟草植株的dna为对照，进行pcr鉴定；

(2)ctab法提取dna步骤如下：取叶片，清洗干净，置于2mlep管中，放小钢珠；加入600μl预热的ctab提取液(tris-hcl，edta，nacl，ctab)，研磨机打碎；65℃水浴1h，每15min轻轻振荡；加入等体积氯仿，剧烈震荡，室温12,000rpm离心10min，取上清液；重复一遍第四步；加等体积的异丙醇，室温沉淀2h以上；室温下12,000rpm离心10min；弃上清液，加1ml75％乙醇离心弃上清，重复两遍；37℃下烘干沉淀物，-80℃干粉保存或加入30μlddh2o和rnase溶解。

(3)使用烟草基因组为模板，分别pcr筛选出转化pcambia2300-smzip的阳性植株；

(4)反应体系为：

pcr反应条件为：94℃4min；94℃30s，56.4℃30s，72℃1min20s(30cycles)；72℃8min；4℃∞。

(5)pcr产物经电泳检测，检测结果参见图1。

6.t1代烟草种子的筛选

(1)通过pcr筛选出的阳性植株继续培养在温室中培养至花期(图2)，套袋自花授粉，直至种子成熟，收集各阳性植株的种子，在烘箱中充分晒干，去除杂质及不饱满的种子；

(2)取适量的种子经氯气灭菌后，接种于ms培养基的平板上(含100mg/lkan)，每皿约50粒种子；

(3)将播好种子的平板放置于组织培养间进行培养，培养条件为25℃，光照强度为300μmol/(m²·s)；

(4)培养一周后，种子皆开始发芽，待幼苗生根长到一定阶段，将植株移栽到小花盆中，放置于温室中进行培养；

(5)生长4-5周后，进行后续实验的检测。

7.转基因烟草经不同浓度cd胁迫后不同器官cd含量检测和cd抗性观察

(1)材料培养：选用野生型和smzip转基因型烟草种子在培养基上发芽、生长2周左右(24h持续光照，25℃恒温，30-40％湿度)，待幼苗长至5cm，将烟草幼苗从ms培养基取出，移入花盆中生长5周左右，随机分成3组，对照组浇1/2hoagland’s营养液，处理组浇cd终浓度为10μmol/l和100μmol/l的1/2hoagland’s营养液，培养28天，期间随时补液。

(2)取材：取cd处理了14天的野生型和smzip转基因型烟草的根、茎、叶的新鲜材料，清洗干净后，于80℃下烘2天，90℃下烘2天至恒重，将样本研磨、保存。

(3)称量：使用万分之一的天平分别称取各样品0.2g于小烧杯中。

(4)硝化：往小烧杯中加入5ml的浓硝酸于室温下过夜浸泡至粉末变成土黄色，然后将烧杯置于80℃的调温板上加热并逐渐升高温度，使浓硝酸慢慢挥发，待浓硝酸几乎全部挥发后，再加5ml的浓硝酸和2ml的高氯酸，继续加热，重复此过程直至烧杯中的溶液呈无色，此时升温至135℃将酸全部挥发并缓慢蒸干直至烧杯中有无色晶体析出。

(5)定容：待烧杯整体冷却后，加入5ml的10％稀硝酸溶解样品过夜充分溶解，第二天再定容至25ml，静置后1天后测定。

(6)原子吸收光谱仪检测各样品中的cd含量，计算cd处理14天后野生型和转基因烟草不同器官中cd含量，计算出cd从地下向地上部分的转移率，结果参见表1。

表1野生型和转基因烟草经不同浓度cd胁迫14天后各器官的cd含量

(7)取cd胁迫28天后的野生型和smzip转基因型烟草的叶片进行观察和记录，结果如图3所示。

结果与分析

1、如表1所示，随着处理浓度的增大，野生型和smzip转基因型烟草根、茎和叶中cd的含量均增加，且含量增加速率为：根＞茎＞叶；未受到cd处理和在10μmol/lcdcl2溶液和100μmol/lcdcl2溶液中处理14天后，野生型烟草中cd地下到地上部分的转运系数分别为0.62、0.36、0.10。在相同处理条件下，smzip转基因型烟草根、茎和叶中cd含量均要高于野生型烟草的，通过计算可知未受处理和在不同浓度处理下的转基因型烟草中cd地下向地上部分的转运系数为0.60、0.41、0.16。所以，在10和100μmol/lcdcl2溶液长时间胁迫后，smzip转基因型烟草对cd的转运能力强于野生型烟草，smzip能够促进cd向地上部分运输。

2、如图3所示，cd胁迫28天后野生型和smzip转基因型烟草的生长状态均受到了影响。在cd胁迫28天时比较两种烟草在不同浓度梯度中叶片的生长状态，可知随着处理浓度的增加，smzip转基因型烟草的叶片形状大致相同，只是在高浓度处理后叶片颜色开始偏黄；但野生型烟草的叶片形状变化较大，在10μmol/lcdcl2溶液处理下叶片变得狭长，在100μmol/lcdcl2溶液处理下叶片大面积变黄，叶边出现卷曲，若干叶片上还出现褐色的斑点。因此，在相同的cd胁迫条件下smzip转基因型烟草植株生长活性要强于野生型烟草，说明smzip基因增强了烟草对cd的耐受性。

综上，实验证明本发明的方法获得的含有smzip蛋白的转基因烟草，在不同浓度的cd胁迫条件下，各器官cd含量增加，cd向地上部分转移率增加；同时，转基因植株比野生型植株在cd处理过程中表现出更强的cd抗性。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>天津师范大学

<120>一种通过转化旱柳smzip蛋白提高植物重金属cd转运能力及抗性的方法

<130>1

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<170>patentinversion3.5

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<212>prt

<213>旱柳

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<212>dna

<213>旱柳

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<213>人工合成

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