与猪生长性状相关联的SNP分子标记的制作方法

本发明涉及猪分子标记制备技术领域，具体涉及猪生长性状相关联snp分子标记。所述的猪生长性状包括校正100kg日增重性状和校正100kg日龄性状指标。本发明的分子标记可用于猪生长性状的辅助选择和预测。

背景技术：

家猪是人类最早驯化的家养动物之一，家猪作为人类肉食消费的主要畜种，猪肉产量也是位列各个家畜之首(larsong,liur,zhaox,etal.patternsofeastasianpigdomestication,migration,andturnoverrevealedbymodernandancientdna[j].proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica,2010,107(17):7686-7691.)。我国人口众多，对猪肉的需求量极大，进行猪的遗传改良，提高生猪养殖效率是目前育种工作的一项刻不容缓的重大任务。随着科技的发展，生猪养殖在遗传育种、营养调控以及疾病防控等方面均取得了显著突破，商品猪的生长速度、瘦肉率以及料肉均有了巨大的提升。

在猪生产中，生长性状是非常重要的经济性状，直接影响生猪养殖的经济效益，也是育种工作者最关心的性状。其中，生长性状主要分为4个度量标准：即生长速度、饲料转化效率、采食量和活体背膘厚(丰艳平和刘小飞.养猪生产[m].中国轻工业出版社,2011年)。生长速度通常用平均日增重表示，即指在一定时间内生长育肥猪平均每天增加的体重，一般是计算某段时间内体重增量除以饲养天数。100kg体重日龄也是生长速度的关键指标，即在出生后达到体重100kg的日龄。目前，大家通常用来测定生长性状的指标包括平均日增重、100kg日龄、饲料转化效率和剩余采食量。

本发明所涉及的猪生长性状是平均日增重和日龄两个性状校正到100kg后的表型：即，校正100kg日增重性状指标和校正100kg日龄性状指标，这两个性状指标是跟据下列公式计算得到的，是目前国内生猪养殖最常用的两个测定猪生长速度的指标。具体公式为：

猪生长性状是由多基因控制的复杂性状，采用常规的遗传手段难以精确的鉴定其主效基因，而基于高密snp芯片或测序的全基因组关联分析为复杂疾病或数量性状候选基因定位提供了有效的技术手段(尹建良等,赵姣姣,陈赛.猪全基因组关联分析研究进展及展望[j].中国猪业(10):,201732-36.)。全基因组关联分析(gwas)的概念是risch在1996年首次提出的，他曾发现在复杂性状的遗传学研究中关联分析比连锁分析的效果更好、统计效力更高，于是提出全基因组关联分析的概念(rischn,merikangask.thefutureofgeneticstudiesofcomplexhumandiseases.[j].science,1996,273(3):350-354.)。全基因组关联分析是指在全基因组范围内寻找与目标性状显著相关的遗传变异。全基因关联分析的原理是连锁不平衡，即在全基因组范围内总会存在一个snp与引起性状的致因突变存在连锁不平衡，通过检测该snp就可以缩小或识别出影响性状的基因组位置。自2005年发表的第一篇关于视网膜黄斑变性的全基因组关联分析以来，全基因组关联分析方法已经成为复杂疾病和数量性状研究的重要方法之一(kleinrj,zeissc,chewey,etal.complementfactorhpolymorphisminage-relatedmaculardegeneration[j].science,2005,308(5720):385-389.)。

分析时常用的模型有一般线性模型(glm)、混合线性模型(mlm)、逻辑回归模型(lr)和贝叶斯模型(bayesian)等(schmidm,bennewitzj,schmidm,etal.invitedreview:genome-wideassociationanalysisforquantitativetraitsinlivestock–aselectivereviewofstatisticalmodelsandexperimentaldesigns[j].2017,60(3):335-346.)。近年来，对于猪生长性状的全基因组关联分析也越来越多，但大多研究的样本含量比较少且在单一品种内开展，这种情况下得到的研究结果容易被质疑且很难得到广谱的控制生长性状的候选基因。本专利使用四种品种(长白猪、大白猪、杜洛克猪和皮特兰猪)混合的纯种猪群进行全基因组关联分析，使用mvp软件的中farmcpu模型进行分析(liux,huangm,fanb,etal.iterativeusageoffixedandrandomeffectmodelsforpowerfulandefficientgenome-wideassociationstudies[j].plosgenetics,2016,12(2):e1005767.)，筛选出与生长性状(校正100kg日增重和校正100日龄)相关的snp分子标记，为猪生长性状的遗传改良提供了一种可行途径，对于猪养殖业具有重要意义。

本发明中发现的snp与猪生长性状(即校正100kg日增重性状指标和校正100kg日龄性状指标)的相关性达到了显著水平，为家猪生长性状的研究提供了新的遗传资源。

技术实现要素：

本发明的目的在于完善家猪与生长相关的分子标记，尤其是作为猪生长性状中校正100kg日增重性状和校正100kg日龄性状的分子标记。本发明利用50k的基因芯片对snp进行分型，并使用全基因组关联分析筛选与猪生长性状(例如：校正100kg日增重性状指标和校正100kg日龄的性状)相关的snp，为猪的遗传育种提供了新的分子标记资源和应用。

本发明的技术方案如下所述：

申请人通过基因分型技术并参阅ensembl，得到affx-114707063基因片段上下游50bp的核苷酸序列，该序列如序列表seqidno:1所示。具体来说如下所述：

ctctgcccttcaggaatactctaggttcaccttaggtgactcataatttr(a/t)agatgcaaaaaatatatgtatgacaagactacacaaagatgtttggcatta，

上述序列的第51位碱基处的r为一个a51-t51的等位基因突变,该突变所述序列产生了核苷酸多态性。申请人利用该段序列作为检测猪生长性状关联的分子标记,且当序列表seqidno：1上的第51位核苷酸为a时，表明猪具有更快的生长速度。

上述序列可以作为检测与猪生长性状相关的分子标记。

申请人提供了一种筛选猪生长性状相关snp分子标记的方法，所述的方法包括如下步骤：

①提取猪耳或猪尾基因组dna，并对dna进行质量检测；

②利用基因芯片对猪基因组进行分型；

③采用基于多标记关联模型的方法，采用个体的性别和场次作为固定效应，利用r统计环境下mvp软件包中的farmcpu模型进行gwas分析。具体的模型如下：其中，是第i个个体的“表型值向量"(thevectorofphenotypes)；是固定效应，包括t个pseudoqtns的基因型以及控制群体遗传背景的主成分；是对应的效应；是第i个体的第j个标记；是第j个标记对应的效应；代表“残差向量”(avectorofresidualerrors)，服从正态分布，表示残差方差。

本发明筛选的分子标记可用于非诊断目的的对猪生长性状相关基因的基因型或与猪生长性状中的校正100kg日增重及校正100kg日龄之间的关联分析中，为猪生长性状的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记资源。

与现有技术相比本发明具有的有益效果：

本发明可通过在体外采用基因芯片技术检测猪的基因型，作为非诊断目的的评价猪的生长速度，与目前的pcr-rflp等方法相比，本发明具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。

更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。

附图说明

图1：本发明的总体技术流程示意图。

图2：是本发明克隆的affx-114707063上下游50bp核苷酸序列和本发明分子标记的核苷酸序列。附图标记说明：在图2显示核苷酸序列的第51位碱基处存在一个a/t等位基因突变(51bp处的英文字母“r”为突变位点)。

图3：是本发明曼哈顿图。附图标记说明：研究的是猪校正100公斤日增重性状，黑色圆圈及箭头指向标记的为本发明筛选的分子标记，该标记位于猪第6号染色体上。

图4：是本发明曼哈顿图。附图标记说明：研究的是猪校正100公斤日龄性状，黑色圆圈及箭头指向标记的为本发明筛选的分子标记，该标记位于猪第6号染色体上。

具体实施方式

对序列表的说明

序列表seqidno：1是本发明克隆登录号为affx-114707063基因片段上下游50bp核苷酸序列。该片段是本发明筛选的分子标记。核苷酸序列长度为为101bp，该序列的51位碱基处的r存在一个a/t的等位基因突变。

实施例1：基因分型检测

(1)利用试剂盒法(离心柱型)提取猪生长性状相关群体的耳组织或尾组织的基因组dna

1)将生长性状相关群体的猪(例如大白猪、长白猪、杜洛克猪和皮特兰猪)耳组织或尾组织用眼科剪剪碎至糊状，加入200ulga(试剂盒为商购，货号为tiangen,dp304-03)，并震荡混匀；然后放入56℃水浴锅中消化过夜；

2)将消化后的组织样加入200ul缓冲液gb(试剂盒为商购，货号为tiangen,dp304-03，该gb试剂为试剂盒自带，下同)，充分颠倒混匀，并70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管壁上的水珠；

3)加入200ul无水乙醇，充分震荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管壁上的水珠；

4)将上一步所得溶液及絮状沉淀一并加入吸附柱cb3(吸附柱cb3为商购，天根生化科技(北京)有限公司，货号dp304-03)，中，并将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心30s，倒掉废液，并将吸附柱放回收集管中；

5)向吸附柱cb3中加入500ul缓冲液gd(缓冲液gd为商购，天根生化科技(北京)有限公司，货号dp304-03)，12000rpm离心30s，倒掉废液，并将吸附柱放入收集管中；

6)向吸附柱cb3中加入600ul漂洗液pw(漂洗液pw为商购，天根生化科技(北京)有限公司，货号dp304-03)，12000rpm离心30s，倒掉废液，并将吸附柱放入收集管中，并重复该步骤。

7)将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，到掉废液；将吸附柱cb3置于室温下放置数分钟，以彻底晾干吸附柱材料中剩余的漂洗液；

8)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，并向吸附柱膜中间部位悬空滴加50-200ul的洗脱液te，室温下放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)snp基因型的判定及质量控制

使用50k基因芯片进行分型，并对基因型数据进行质检，最终有4828个个体和47157个snp用于全基因组关联分析研究。

实施例2：affx-114707063分子标记分型方法及其在猪生长性状关联分析中的应用(1)affx-114707063分子标记分型结果与生长性状(例如：校正100kg日增重性状和校正100kg日龄性状)关联分析

用于基因型与生长性状关联分析所用的实验猪群来自两个相互独立的纯种猪群体，包括大白猪、长白猪、杜洛克猪和皮特兰猪，均为常规品种)。基因分型所用的dna由纯种大白猪、长白猪、杜洛克猪、皮特兰猪(说明书正文和表中所称的纯种大白猪、长白猪、杜洛克猪和皮特兰猪等品种简称“猪”)耳样或尾样提取。采用基于多标记关联模型的方法，采用个体的性别和场次作为固定效应，利用r统计环境下mvp软件包中的farmcpu模型进行gwas分析。具体的模型如下：其中，是第i个个体的“表型值向量"(thevectorofphenotypes)；是固定效应，包括t个pseudoqtns的基因型以及控制群体遗传背景的主成分；是对应的效应；是第i个体的第j个标记；是第j个标记对应的效应；代表“残差向量”(avectorofresidualerrors)，服从正态分布，表示残差方差。

关联分析结果见表1和表2。

表1affx-114707063的多态性以及不同基因型对猪生长性状(校正100kg日增重性状)的影响

表1说明：p<0.05为差异显著；p<0.01为差异极显著。

表2affx-114707063的多态性以及不同基因型对猪生长性状(校正100kg日龄性状)的影响

表1说明：p<0.05为差异显著；p<0.01为差异极显著。

由表1可知，对于校正100公斤日增重性状，基因型为aa的个体的日增重极显著高于at个体，说明基因型为aa的个体生长速度极显著高于at个体。由表2可知，对于校正100公斤日龄性状，基因型为aa的个体的校正100公斤日龄极显著低于at个体，说明基因型为aa的个体生长速度极显著高于at个体。综上所述，基因型为aa的个体生长速度极显著高于at个体，所以a是有利于生长速度加快的等位基因。

主要参考文献：

[1]larsong,liur,zhaox,etal.patternsofeastasianpigdomestication,migration,andturnoverrevealedbymodernandancientdna[j].proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica,2010,107(17):7686-7691.

[2]rischn,merikangask.thefutureofgeneticstudiesofcomplexhumandiseases.[j].science,1996,273(3):350-354.

[3]kleinrj,zeissc,chewey,etal.complementfactorhpolymorphisminage-relatedmaculardegeneration[j].science,2005,308(5720):385-389.

[4]liux,huangm,fanb,etal.iterativeusageoffixedandrandomeffectmodelsforpowerfulandefficientgenome-wideassociationstudies[j].plosgenetics,2016,12(2):e1005767.

[5]schmidm,bennewitzj,schmidm,etal.invitedreview:genome-wideassociationanalysisforquantitativetraitsinlivestock–aselectivereviewofstatisticalmodelsandexperimentaldesigns[j].2017,60(3):335-346.

[6]丰艳平等，养猪生产[m].中国轻工业出版社,2011年.

[7]尹建良等，猪全基因组关联分析研究进展及展望[j].中国猪业,2017(10):32-36。

序列表

<110>华中农业大学

<120>与猪生长性状相关联的snp分子标记

<141>2018-12-15

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>101

<212>dna

<213>猪(susscrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(101)

<220>

<221>mutation

<222>(51)..(51)

<400>1

ctctgcccttcaggaatactctaggttcaccttaggtgactcataattttagatgcaaaa60

aatatatgtatgacaagactacacaaagatgtttggcatta101