1.一种快速克隆方法,其特征在于,包括以下步骤:
设计用于扩增目的基因的第一引物对和用于扩增载体模板的第二引物对;其中,所述第一引物对包括第一上游引物和第一下游引物,第一上游引物包括末端重叠序列a,第一下游引物包括末端重叠序列b;所述第二引物对包括第二上游引物和第二下游引物,第二上游引物包括末端重叠序列b’,第一下游引物包括末端重叠序列a’,且所述末端重叠序列a与所述末端重叠序列a’反向互补,所述末端重叠序列b与所述末端重叠序列b’反向互补;
提供原始载体模板,采用pcr反向扩增技术扩增含有末端重叠序列a和末端重叠序列b的线性化载体,以及采用pcr反向扩增技术扩增含有末端重叠序列a’和末端重叠序列b’的目的基因;
采用连接酶将所述线性化载体的末端重叠序列a和所述目的基因的末端重叠序列a’连接,将所述线性化载体的末端重叠序列b和所述目的基因的末端重叠序列b’连接,得到环状克隆载体;
将所述环状克隆载体导入宿主细胞,进行表达。
2.如权利要求1所述的快速克隆方法,其特征在于,所述末端重叠序列a含有至少15bp;和/或
所述末端重叠序列b含有至少15bp。
3.如权利要求1所述的快速克隆方法,其特征在于,采用pcr反向扩增技术扩增含有末端重叠序列a和末端重叠序列b的线性化载体的步骤中,在pcr反向扩增结束后,采用dpnⅰ酶消化去除甲基化保护的原始载体模板。
4.如权利要求1所述的快速克隆方法,其特征在于,所述连接酶选自in-fusion酶。
5.如权利要求4所述的快速克隆方法,其特征在于,采用连接酶将所述线性化载体的末端重叠序列a和所述目的基因的末端重叠序列a’连接,将所述线性化载体的末端重叠序列b和所述目的基因的末端重叠序列b’连接,得到环状克隆载体的步骤中,反应体系如下:
反应条件为:将所述反应体系混匀后,于45℃~55℃条件下孵育10~20min。
6.如权利要求1至5任一项所述的快速克隆方法,其特征在于,所述原始载体模板为空载体或重组质粒。
7.如权利要求1至5任一项所述的快速克隆方法,其特征在于,所述第一上游引物中,除所述末端重叠序列a外,还含有18bp~27bp。
8.如权利要求1至5任一项所述的快速克隆方法,其特征在于,所述第一下游引物中,除所述末端重叠序列b外,还含有18bp~27bp。
9.如权利要求1至5任一项所述的快速克隆方法,其特征在于,所述第二上游引物中,除所述末端重叠序列b’外,还含有18bp~27bp。
10.如权利要求1至5任一项所述的快速克隆方法,其特征在于,所述第二下游引物中,除所述末端重叠序列a’外,还含有18bp~27bp。