一种提高胭脂萝卜天竺葵素稳定性的方法与流程

本发明涉及天竺葵素改性技术领域，特别的涉及一种提高胭脂萝卜天竺葵素稳定性的方法。

背景技术：

花青素(anthocyanin)是黄酮属的天然色素，广泛的存在于具有不同颜色的植物中，如蓝莓、黑莓和紫甘薯等，在自然状态下往往与各种糖苷形成花青苷。胭脂萝卜(carmineradish)是重庆市涪陵区特有的蔬菜品种，主要用于制备食用红色素，研究发现其红色素为花青素类天竺葵素。根据国内外对花青素的研究结果表明，天竺葵素具有清除自由基、保护和改善视力、治疗心血管疾病、预防肥胖、防止脑神经老化、抗癌、皮肤保健、抗衰老、具有抑菌活性和抗疲劳等作用。

由于花青素是水溶性色素，容易受到金属离子、二次色素、温度、光照、ph值等因素的影响，导致色素降解及活性降低，成为阻碍其在食品工业中应用的瓶颈。为了改善花靑素的稳定性，扩大此类色素的应用领域。研究发现酰化可以改善花色苷的颜色保护，提高花色苷的稳定性。“酰基化蓝莓花青素的稳定性研究”赵立仪等公开酰化蓝莓花青素及矢车菊素-3-o-葡萄糖苷对温度、光照、强氧化剂、食品添加剂的稳定性有显著提高。该方法采用月桂酰氣作为酰化剂，但需要在90℃反应，高温条件下反应能耗高，且大大的影响花青素的活性。“笃斯越橘酰化花青素稳定性分析”古明辉等公开对黑枸杞花青素进行苹果酸酰基化改性使其半衰期和保留率均显著上升。该方法采用novozym435脂肪酶法辅助软脂酸对笃斯越橘花青素进行化学修饰，但酰化效果不理想，反应进行较慢。专利cn201310421249.5公开了一种提高蓝莓花青素稳定性的处理方法，将无水没食子酸、无水乙酸酐、无水吡啶制备成三乙酰没食子酸作为酰基化试剂，操作复杂。并且目前还没有针对胭脂萝卜天竺葵素酰化方法的相关报道。

技术实现要素：

针对现有技术的存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种提高胭脂萝卜天竺葵素稳定性的方法，解决现有酰化方法酰化效果不佳、反应能耗高、操作复杂和花青素活性低等问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：一种提高胭脂萝卜天竺葵素稳定性的方法，包括以下步骤：

1）水杨酸溶液的制备：称取水杨酸并用沸水溶解，制得浓度为0.01~0.1g·ml^-1的水杨酸溶液；

2）将步骤1）制备的水杨酸溶液和天竺葵素溶液按照体积比1:1混合得到反应液，然后将所述反应液在28℃下反应1~2h，得到酰化天竺葵素，即提高了胭脂萝卜天竺葵素的稳定性。

这样，水杨酸作为酰化剂与胭脂萝卜天竺葵素之间的成键和形成的复合物的类型及其稳定性效果与现有技术（背景技术中已公开的）之间存在差异。天竺葵素分子中存在高度分子共轭体系，因所带羟基数多，化学性质活跃，稳定性差，利用水杨酸将其醇或酚分子中的羟基氢原子酰基取代后生成酯，进而提高了胭脂萝卜天竺葵素的稳定性。

进一步，所述胭脂萝卜天竺葵素溶液采用以下方法制得：

s1：胭脂萝卜天竺葵素的提取：称取萝卜粉，以料液比1：10g/ml加入酸化的75%乙醇，然后超声波提取15min，55℃恒温水浴浸提30min后，采用ab-8树脂进行初步分离，收集洗脱液并浓缩，再将浓缩后的洗脱液真空冻干后用甲醇溶解，得到粗产物；

s2：胭脂萝卜天竺葵素的分离：将步骤1）制得的粗产物采用半制备型高效液相色谱xchargec18柱分离胭脂萝卜天竺葵素，柱温30℃，流动相a：3%甲酸溶液，流动相b：甲醇，检测波长530nm，10ml定量环，甲醇-3%甲酸溶液流动相梯度洗脱，流速为15ml/min、进样量为1.2ml，分离得到胭脂萝卜天竺葵素溶液。

进一步，所述天竺葵素溶液的浓度为0.1~1mg·ml^-1。

进一步，所述酸化的75%乙醇是用将无水乙醇溶于质量分数为10%的盐酸中制得。

进一步，所述超声波提取的单次工作时间10s，间隔时间10s。

上述方法制备得到的酰化天竺葵素。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明采用水杨酸作为酰化剂对胭脂萝卜天竺葵素进行改性处理，常温常压下进行反应，降低了反应能耗，反应条件温和，有效的保持了天竺葵素原有的结构和活性，酰化度较高；并且整个工艺简单、易于控制，原料易得，成本低，具有良好的应用前景。

2、本发明通过水杨酸改性得到的酰化胭脂萝卜天竺葵素，显著提高了其对光、温度、al³⁺、碱性环境和过氧化氢的稳定性，本发明对水杨酸改性后的胭脂萝卜天竺葵素分别进行了羟自由基、dpph自由基和abts自由基的清除能力性能的验证，结果显示水杨酸酰化对天竺葵素的体外抗氧化活性无影响。可见，本发明的酰化胭脂萝卜天竺葵素具有良好的稳定性和抗氧化活性，能够被广泛应用于食品、保健品、化妆品、医药等领域。

附图说明

图1为胭脂萝卜天竺葵素的紫外吸收光谱；a：未酰化；b：酰化；

图2为光照对酰化/未酰化天竺葵素保留率的影响；

图3为不同温度对酰化/未酰化天竺葵素保留率的影响；a：80℃；b：100℃；c：120℃；

图4为金属离子al³⁺对酰化/未酰化天竺葵素保留率的影响；

图5为不同ph对酰化/未酰化天竺葵素保留率的影响；

图6为h2o2对酰化/未酰化天竺葵素保留率的影响；

图7为酰化/未酰化天竺葵素对羟自由基的清除率；

图8为酰化/未酰化天竺葵素对dpph自由基的清除率；

图9为酰化/未酰化天竺葵素对abts自由基的清除率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

一、酰化胭脂萝卜天竺葵素的制备

实施例1

1）水杨酸溶液的制备：准确称取0.2g水杨酸并用10ml沸水溶解，制得浓度为0.02g·ml^-1的水杨酸溶液；

2）胭脂萝卜天竺葵素的提取：称取2.0g萝卜粉，以料液比1：10（g/ml）加入酸化的75%乙醇（10%盐酸）；超声波提取15min，单次工作时间10s，间隔时间10s，；55℃恒温水浴浸提30min后，采用ab-8树脂进行初步分离，收集洗脱液浓缩，真空冻干后用甲醇溶解，得到粗产物；

3）胭脂萝卜天竺葵素的分离：将步骤1）制得的粗产物采用半制备型高效液相色谱xchargec18柱（20mm×250mm，10μm）进行胭脂萝卜天竺葵素的分离；柱温30℃，流动相a：3%甲酸溶液，流动相b：甲醇；检测波长530nm；10ml定量环，甲醇-3%甲酸溶液流动相梯度洗脱，流速为15ml/min、进样量为1.2ml，分离得到浓度为0.5mg·ml^-1的天竺葵素溶液；

4）将步骤1）制备的水杨酸溶液和步骤3）制备的天竺葵素溶液按照体积比1:1混合得到反应液，然后将反应液在28℃下反应1~2h，即得到酰化天竺葵素。

实施例2

1）水杨酸溶液的制备：准确称取1g水杨酸并用10ml沸水溶解，制得浓度为0.1g·ml^-1的水杨酸溶液；

2）胭脂萝卜天竺葵素的提取：称取2.0g萝卜粉，以料液比1：10（g/ml）加入酸化的75%乙醇（10%盐酸）；超声波提取15min，单次工作时间10s，间隔时间10s，；55℃恒温水浴浸提30min后，采用ab-8树脂进行初步分离，收集洗脱液浓缩，真空冻干后用甲醇溶解，得到粗产物；

3）胭脂萝卜天竺葵素的分离：将步骤1）制得的粗产物采用半制备型高效液相色谱xchargec18柱（20mm×250mm，10μm）进行胭脂萝卜天竺葵素的分离；柱温30℃，流动相a：3%甲酸溶液，流动相b：甲醇；检测波长530nm；10ml定量环，甲醇-3%甲酸溶液流动相梯度洗脱，流速为15ml/min、进样量为1.2ml，分离得到浓度为1mg·ml^-1的天竺葵素溶液；

4）将步骤1）制备的水杨酸溶液和步骤3）制备的天竺葵素溶液按照体积比1:1混合得到反应液，然后将反应液在28℃下反应1~2h，即得到酰化天竺葵素。

将实施例1~2制备的酰化胭脂萝卜天竺葵素和未酰化胭脂萝卜天竺葵素在200~600nm的吸收光谱下进行测定，结果如图1所示。

经紫外光谱分析得到，与未酰化胭脂萝卜天竺葵素相比，酰化胭脂萝卜天竺葵素在317nm处出现明显吸收峰，说明胭脂萝卜天竺葵素发生了酰基化。

二、酰化胭脂萝卜天竺葵素稳定性的测定

将实施例1制备的酰化胭脂萝卜天竺葵素进行稳定性的测定

2.1酰化胭脂萝卜天竺葵素的光稳定性

各取30ml未酰化和酰化天竺葵素装至白色透光的试剂瓶中，放在自然光照条件的环境中，隔天定时测定其保留率的变化，共测5d。结果如图2所示。

由图2可见，10天内随光照时间的延长，未酰化与酰化天竺葵素保留率均逐渐下降，但酰化天竺葵素的稳定性均显著高于未酰化的天竺葵素（p<0.05），光照第10d时，酰化天竺葵素的保留率在81.28%左右，而未酰化天竺葵素的保留率已降到61.33%左右，可见，水杨酸酰化后的天竺葵素的光稳定性提高了32.5%。

2.2酰化胭脂萝卜天竺葵素的热稳定性

各取3份30ml酰化与未酰化的天竺葵素溶液分别置于80℃、100℃和120℃水浴中，分别于2h、4h、6h、8h、10h时测定其含量变化。结果如图3所示。

由图3可见，随着温度的升高和时间的延长，酰化与未酰化的天竺葵素的保留率均下降。在80℃环境下2h后，酰化天竺葵素保留率均显著大于未酰化天竺葵素（p<0.05）。在100℃环境下2~6h，酰化天竺葵素保留率与未酰化天竺葵素没有显著性差异，在8h-10h时差异极显著（p<0.01）。120℃环境下2h-4h，酰化与未酰化天竺葵素保留率没有显著性差异，在6h-10h时差异显著（p<0.05）。在80℃、100℃、120℃加热10h后，酰化天竺葵素保留率分别为81.59%、71.82%和58.03%，未酰化天竺葵素保留率分别为71.59%、60.04%和49.27%，酰化天竺葵素均显著高于未被酰化天竺葵素，说明酰化天竺葵素的热稳定性显著提高。

2.3酰化胭脂萝卜天竺葵素对金属离子的稳定性

各取30ml酰化与未酰化的天竺葵素，分别加入浓度为0.01mol/l的硫酸铝溶液，分别于2h、4h、6h、8h、10h后测定其含量变化。结果如图4所示。

由图4可知，随着反应时间的增长，0.01mol/l的al³⁺对已酰化和未酰化天竺葵素的稳定性影响有显著性差异（p＜0.05），10h后酰化天竺葵素和未酰化天竺葵素的保留率分别为83.26%和69.24%，可见，酰化后的天竺葵素对金属离子al³⁺的稳定性提高了20%。

2.4酰化胭脂萝卜天竺葵素对不同ph溶液的稳定性

各取30ml酰化与未酰化的天竺葵素溶液，然后分别用盐酸和氢氧化钠溶液调节酸碱度，分别调节溶液ph值分别为2、4、6、8、10、12时测定其含量的变化。结果如图5所示。

由于天竺葵素受ph影响较大，当ph值小于3时，天竺葵素呈稳定的红色；当ph值在3至6范围之间时，红色变浅；当ph值大于6时，呈不稳定的蓝色。由图5可知，胭脂萝卜天竺葵素在ph<6时，即酸性条件下较为稳定，在碱性条件下保留率下降显著（p<0.05）。但整体上酰化天竺葵素的保留率显著高于未酰化的天竺葵素（p<0.05）。可见，酰化胭脂萝卜天竺葵素显著提高了对碱性条件的稳定性。

2.5酰化胭脂萝卜天竺葵素对h2o2的稳定性

各取30ml未酰化和酰化的天竺葵素，分别加入10％过氧化氢溶液溶液，分别于2h、4h、6h、8h、10h后测定其含量变化。结果如图6所示。

由图6可知，在反应2~8h内，添加10%过氧化氢对天竺葵素的保留率无显著影响（p>0.05），在8h后，酰化天竺葵素的保留率显著高于未酰化天竺葵素（p<0.05），说明在长时间反应后酰化天竺葵素能显著提高对强氧化剂的稳定性，而且短时间内酰化天竺葵素的优势并不显著。

三、酰化胭脂萝卜天竺葵素的抗氧化活性评价

将实施例1制备的酰化胭脂萝卜天竺葵素进行抗氧化活性评价

3.1羟基自由基（-oh）的清除

分别取2ml不同浓度（0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml）的酰化天竺葵素和未酰化天竺葵素，再分别加入2ml（6mmol/l）硫酸亚铁溶液和2mlh2o2混合均匀后，在37℃恒温水浴中反应30min，4000rpm冷冻离心5min，取上清液在510nm下测吸光度作为试验组，记为ai；用蒸馏水代替样品作为空白组，记为a0；以蒸馏水代替h2o2作为对照组，记为ai0；用vc作为阳性对照，按下式计算对自由基的清除率：

由图7可知，当酰化天竺葵素、未酰化天竺葵素与vc浓度在0.5mg/ml~2.5mg/ml内时，对羟基的清除率均随浓度的增加而增大。相同浓度的vc对羟自由基的清除率均低于天竺葵素（p<0.05），酰化前后天竺葵素的对羟自由基的清除能力未见显著差异，说明胭脂萝卜天竺葵素具有良好的羟自由基清除能力，且水杨酸酰化未影响其清除羟自由基的能力。

3.2dpph自由基的清除

分别取2ml不同浓度（0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml）的酰化天竺葵素和未酰化天竺葵素，再分别加入2ml的dpph溶液，在黑暗环境下反应30min后，在波长517nm下测定其吸光度（ai）；以2ml待测溶液加入2ml的无水乙醇作对照组（ai0），以2ml的dpph溶液加入2ml蒸馏水中作为空白（a0），用vc作为阳性对照，计算对dpph自由基的清除率：

如图8所示，当酰化天竺葵素、未酰化天竺葵素和vc的浓度在0.2~0.8mg/ml之间，dpph自由基的清除率均随着浓度的增加而增加。当浓度达到0.8mg/ml时，天竺葵素对dpph清除率达到最高，但低于vc（p<0.05），酰化天竺葵素和未酰化天竺葵素对dpph自由基具有相当的清除效果，说明酰化未影响天竺葵素对dphh自由基的清除能力。

3.3abts自由基的清除

取10ml浓度为7mmol/labts和176ul浓度为70mmol/l过硫酸钾混合均匀置于黑暗处室温反应24h，得到储备液。再用乙醇稀释成abts工作液，使其在734nm波长下吸光度在0.68~0.72范围内。

分别取0.1ml不同浓度（0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml）的酰化天竺葵素和未酰化天竺葵素于25ml比色管中，再加入5mlabts工作液，混合均匀后在室温下反应30min，于734nm下测其吸光度，作为试验组记为ai；用蒸馏水代替天竺葵素溶液作为空白组记为a0；用乙醇代替abts工作液作为对照组记为ai0。按下列公式计算abts自由基的清除率：

如图9所示，当酰化天竺葵素、未酰化天竺葵素和vc的浓度在0.2~1.0mg/ml范围内时对abts自由基的清除率均随着浓度的增加而增加，同等浓度下的天竺葵素对abts的清除率始终高于vc，当浓度达到0.8mg/ml后，vc对abts自由基清除几乎达到饱和，1mg/ml天竺葵素对abts自由基清除率达84.2%，且酰化天竺葵素和未酰化天竺葵素对abts自由基的清除率无显著性差异，说明酰化并未影响天竺葵素对abts自由基的清除能力。

综上，水杨酸酰化对天竺葵素的体外抗氧化活性无影响，并且显著的提高了胭脂萝卜天竺葵素的稳定性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。