本发明涉及鱼胶原蛋白的提取领域，具体涉及一种同时获得4种鱼胶原蛋白的方法。
背景技术：
目前，从鱼皮中提取i型胶原蛋白的研究很多，一般工艺都包括原料的处理、酶解、灭酶、脱色、过滤、浓缩和喷雾干燥等步骤。高温灭酶过程可能对胶原蛋白液造成影响，使胶原蛋白液中部分基团间发生反应，从而影响胶原蛋白的颜色和质量；同时在提取胶原蛋白各类型胶原复合物，不容易分离各类型胶原蛋白，应用价值低，不能满足人们安全性能好、高质量胶原蛋白的需要。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种同时获得4种鱼胶原蛋白的方法，该方法不仅能够同时获得4种不同的鱼胶原蛋白，且获得的鱼胶原蛋白纯度高，颜色好。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种同时获得4种鱼胶原蛋白的方法，该方法包括：
(1)将鱼皮与蛋白酶接触，获得鱼皮的酶解液；然后对所述酶解液进行固液分离，获得第一上清液；
(2)向所述第一上清液中加入盐溶液，以对所述第一上清液进行盐析，并对所得第一盐析产物进行固液分离，获得第二沉淀和第二上清液；
其中，所述第二上清液含有iv型胶原蛋白；
(3)对所述第二沉淀依次进行酸溶和固液分离，获得第三上清液，并向所述第三上清液中加入盐溶液，以对所述第三上清液进行盐析，然后对所得第二盐析产物进行固液分离，获得第四沉淀；之后使用含2.1-3mol/l的氯化钠和0.03-0.08mol/ltris-hcl的第一抽提液对所述第四沉淀进行抽提并固液分离，获得第五沉淀和第五上清液；
(4)对所述第五上清液进行色谱分离，并使用洗脱液对色谱柱进行洗脱以获得洗脱产物；
其中，所述洗脱产物含有v型胶原蛋白；
(5)使用含有1.5-2mol/l氯化钠和0.03-0.08mol/ltris-hcl的第二抽提液对所述第五沉淀进行抽提并固液分离，获得第六沉淀和第六上清液；
其中，所述第六上清液含有i型胶原蛋白；
(6)使用含有0.8-1.2mol/l氯化钠和0.03-0.08mol/ltris-hcl的第三抽提液对所述第六沉淀进行抽提并固液分离，获得第七上清液；
其中，所述第七上清液含有iii型胶原蛋白。
优选的，在对所述鱼皮进行酶解之前，该方法还包括将所述鱼皮与正丁醇进行接触。
优选的，在对所述鱼皮进行酶解之前，该方法还包括将所述鱼皮与碱性溶液进行接触。
优选的，步骤(1)中，所述蛋白酶选自胃蛋白酶、无花果蛋白酶和碱性蛋白酶中的至少一种。
优选的，步骤(3)中，酸溶后进行固液分离的条件包括：转速为80000-120000g，时间为40-80min，在向所述第三上清液中加入盐溶液前，还包括向所述第三上清液中加入tris的步骤；抽提后进行固液分离的条件包括：转速为80000-120000g，时间为40-80min。
通过采用本申请的方法提取鱼皮中的胶原蛋白，能够获得4种不同的胶原蛋白，也即，i型、ⅲ型、ⅳ型、ⅴ型，且纯度均较高，其中，i型胶原蛋白的纯度可达98％以上，ⅲ型、ⅳ型、ⅴ型的纯度可达90％以上。此外，本申请的方法在提取胶原蛋白的过程中，由于没有采用高温灭酶的步骤，因此，不会导致胶原蛋白颜色发生很大的变化，并且本申请不使用有毒有害试剂，安全性较高。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种同时获得4种鱼胶原蛋白的方法，其特征在于，该方法包括：
(1)将鱼皮与蛋白酶接触，获得鱼皮的酶解液；然后对所述酶解液进行固液分离，获得第一上清液；
(2)向所述第一上清液中加入盐溶液，以对所述第一上清液进行盐析，并对所得第一盐析产物进行固液分离，获得第二沉淀和第二上清液；
其中，所述第二上清液含有iv型胶原蛋白；
(3)对所述第二沉淀依次进行酸溶和固液分离，获得第三上清液，并向所述第三上清液中加入盐溶液，以对所述第三上清液进行盐析，然后对所得第二盐析产物进行固液分离，获得第四沉淀；之后使用含2.1-3mol/l的氯化钠和0.03-0.08mol/ltris-hcl的第一抽提液对所述第四沉淀进行抽提并固液分离，获得第五沉淀和第五上清液；
(4)对所述第五上清液进行色谱分离，并使用洗脱液对色谱柱进行洗脱以获得洗脱产物；
其中，所述洗脱产物含有v型胶原蛋白；
(5)使用含有1.5-2mol/l氯化钠和0.03-0.08mol/ltris-hcl的第二抽提液对所述第五沉淀进行抽提并固液分离，获得第六沉淀和第六上清液；
其中，所述第六上清液含有i型胶原蛋白；
(6)使用含有0.8-1.2mol/l氯化钠和0.03-0.08mol/ltris-hcl的第三抽提液对所述第六沉淀进行抽提并固液分离，获得第七上清液；
其中，所述第七上清液含有iii型胶原蛋白。
正丁醇处理
根据本发明，尽管按照如上的方法进行鱼皮中胶原蛋白的提取即可同时获得高纯度的4种胶原蛋白，但本发明的发明人发现，在对所述鱼皮进行酶解之前，将所述鱼皮与正丁醇进行接触，能够进一步提高所获得的4种胶原蛋白的纯度。分析原因可能在于正丁醇能够溶解鱼皮中的脂类物质，从而避免后期提取过程中脂类物质的干扰。
其中，将鱼皮与正丁醇进行接触的条件没有特别的限定，优选的，所述接触的温度为1-8℃，时间为20-30小时，正丁醇的浓度为8-12体积％。
其中，鱼皮与正丁醇的接触可以为动态接触，例如在搅拌的条件下接触，也可以为静态接触。
碱溶液处理
根据本发明，尽管按照如上的方法进行鱼皮中胶原蛋白的提取即可同时获得高纯度的4种胶原蛋白，但本发明的发明人发现，在对所述鱼皮进行酶解之前，特别优选在所述鱼皮与正丁醇接触之后，将所述鱼皮与碱性溶液进行接触，能够进一步提高所获得的4种胶原蛋白的纯度。分析原因可能在于碱性物质可以将鱼皮中除胶原蛋白之外的杂蛋白进行溶解，从而避免了后期提取过程中杂蛋白物质的干扰，提高胶原蛋白的浓度。
其中，将鱼皮与碱性溶液进行接触的条件没有特别的限定，优选的，所述接触的温度为1-8℃，时间为20-30小时。
其中，本发明对所述碱性溶液的种类并没有特别的限定，其可以为常规的各种碱性溶液，例如，氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾等等。优选的，所述碱性溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
其中，鱼皮与正丁醇的接触可以为动态接触，例如在搅拌的条件下接触，也可以为静态接触。
步骤(1)
根据本发明，对所述鱼皮进行酶解所用的酶可以为本领域常规的各种蛋白酶，例如，可以为但不限于胃蛋白酶、无花果蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等等。本发明优选胃蛋白酶、无花果蛋白酶和碱性蛋白酶中的至少一种。
其中，所述鱼皮和蛋白酶进行接触的条件也没有特别的限定，只要能够充分进行酶解即可。优选的，鱼皮与蛋白酶在搅拌的条件下进行接触，接触的条件包括：ph值为6.0-8.5，温度为1-8℃，时间为12-84小时；相对于100重量份的鱼皮，所述蛋白酶的用量为0.5-10g。其中，可以通过加入冰醋酸(例如，浓度为0.3-0.5mol/l)来调节酶解体系的ph值。
其中，为了使得酶解更加充分，在将所述鱼皮和蛋白酶接触之前，优选将所述鱼皮切成小块。
其中，对酶解产物进行固液分离以获得第一上清液的条件可以在较宽的范围内进行选择，综合能耗和分离效果考虑，所述固液分离的转速为8000-12000g，时间为15-30min，温度为1-8℃。
步骤(2)
根据本发明，对所述第一上清液进行盐析所用的盐溶液可以为本领域中常规使用的对蛋白进行盐析所用的盐溶液，例如，可以为但不限于硫酸铵、硝酸铵、氯化钾和氯化钠中的至少一种的饱和溶液。其中，所述盐析的条件也可以在较宽的范围内进行选择，本发明对此并没有特别的限制，例如，所述盐析的条件可以包括：所述盐溶液的加入量使得其终浓度为0.9-2.7mol/l，ph值为2.5-3，时间为2-20小时，温度为1-8℃。其中，可以通过向体系中加入冰醋酸来达到盐析的ph值。
其中，所述盐析可以在动态的条件下进行，也可以在静态的条件下进行，优选在磁力搅拌的条件下进行动态盐析。
其中，对盐析后的混合物进行固液分离以获得第二沉淀和第二上清液的条件可以在较宽的范围内进行选择，综合能耗和分离效果考虑，所述固液分离的转速为8000-12000g，时间为15-30min，温度为1-8℃。
其中，所述固液分离后得到的第二上清液中含有iv型胶原蛋白，可以通过常规的超滤后并冷冻干燥，获得iv型胶原蛋白冻干粉，所述iv型胶原蛋白冻干粉中iv型胶原蛋白的纯度可高于90％。
步骤(3)
根据本发明，可以使用常规的酸对所述第二沉淀进行酸溶，所述酸例如可以为但不限于，并冰醋酸、柠檬酸等等。
其中，对酸溶后的体系进行固液分离以获得第三上清液的条件可以在较宽的范围内进行选择，但本发明的发明人发现，通过采用超速离心的方法能够进一步提高后续产品的纯度，所述超速离心的转速可以为80000-120000g，时间可以为40-80min。
本发明的发明人在研究的过程中发现，在对所述第三上清液进行盐析之前，向所述第三上清液中加入tris，能够进一步提高后续产品的纯度。其中，tris的加入量优选使得其浓度为0.01-0.05mol/l。
其中，对所述第三上清液进行盐析所用的盐溶液可以为本领域中常规使用的对蛋白进行盐析所用的盐溶液，例如，可以为但不限于硫酸铵、硝酸铵、氯化钾和氯化钠中的至少一种的饱和溶液。其中，所述盐析的条件也可以在较宽的范围内进行选择，本发明对此并没有特别的限制，例如，所述盐析的条件可以包括：所述盐溶液的加入量使得其终浓度为4-5mol/l，ph值为6.5-7.5，时间为10-20小时，温度为1-8℃。
其中，可以通过向体系中加入碱性溶液来达到盐析的ph值，所述碱性溶液可以为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾中的至少一种，优选的，所述碱性溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
其中，所述盐析可以在动态的条件下进行，也可以在静态的条件下进行，优选在磁力搅拌的条件下进行动态盐析。
其中，对盐析后的混合物进行固液分离以获得第四沉淀的条件可以在较宽的范围内进行选择，综合能耗和分离效果考虑，所述固液分离的转速为8000-12000g，时间为30-60min，温度为1-8℃。
根据本发明一种优选的实施方式，为了进一步提高后续产品的纯度，在对所述第四沉淀进行抽提之前，还使用含4-5mol/l的氯化钠和0.03-0.08mol/ltris-hcl的洗涤液对所述第四沉淀进行洗涤；优选的，所述洗涤的温度为1-8℃，时间为10-20小时。其中，所述洗涤优选在搅拌的条件下进行。
其中，对洗涤产物进行固液分离的条件可以在较宽的范围内进行选择，综合能耗和分离效果考虑，所述固液分离的转速为8000-12000g，时间为30-60min，温度为1-8℃。
根据本发明，对第四沉淀抽提后进行固液分离以获得第五沉淀和第五上清液的条件可以在较宽的范围内进行选择，但本发明的发明人发现，通过采用超速离心的方法能够进一步提高后续产品的纯度，超速离心的转速可以为80000-120000g，时间可以为10-20min。
其中，可以重复对所述第四沉淀进行所述抽提步骤，以使得所述第四沉淀中含有的胶原蛋白能够最大程度的提出，所述重复的次数可以为2-5次。然后将抽提并固液分离后的上清液合并进行后处理。
其中，所述获得的第五上清液中含有i型胶原蛋白的三聚体和v型胶原蛋白。
步骤(4)
根据本发明一种优选的实施方式，所述色谱分离柱为纤维素色谱分离柱，进一步优选的，所述色谱分离柱为deae-纤维素de-32。
其中，根据本发明又一种优选的实施方式，为了提高所得v型胶原蛋白的浓度，在对所述第五上清液进行色谱分离前，优选调整第五上清液中胶原蛋白的浓度，使其浓度小于1mg/ml。
根据本发明，为了进一步提高所得b型胶原蛋白的纯度，该方法还优选在对所述第五上清液进行色谱分离之前，使用氯化钠浓度为0.08-0.12mol/l，尿素浓度为1.5-2.5mol/l，tris-hcl浓度为0.03-0.08mol/l的缓冲液对所述第五上清液进行超滤。
根据本发明，对所述色谱柱进行洗脱的洗脱液优选含有氯化钠、尿素和tris-hcl，其中，氯化钠的浓度可以为0.18-0.22mol/l，尿素的浓度可以为1.5-2.5mol/l，tris-hcl的浓度可以为0.03-0.08mol/l。
其中，所得洗脱产物中含有v型胶原蛋白，为了进一步提高v型胶原蛋白的浓度，还优选使用0.0008-0.0012mol/l的乙酸溶液对所述洗脱产物进行透析2-3天，之后进行冷冻干燥，获得v型胶原蛋白冻干粉，其纯度可达到90％以上。
步骤(5)
根据本发明，对所述第五沉淀进行抽提的条件可以在较宽的范围内进行选择，优选的，所述抽提的时间为4-8小时，温度为1-8℃。
根据本发明，抽提结束后对所得混合体系进行固液分离以获得第六沉淀和第六上清液的条件可以在较宽的范围内进行选择，但本发明的发明人发现，通过采用超速离心的方法能够进一步提高后续产品的纯度，超速离心的转速可以为80000-120000g，时间可以为10-20min。
其中，可以重复对所述第五沉淀进行所述抽提步骤，以使得所述第五沉淀中含有的胶原蛋白能够最大程度的提出，所述重复的次数可以为2-5次。然后将抽提并固液分离后的上清液合并进行后处理。
根据本发明，所述第六上清液中含有i型胶原蛋白，可以通过常规的超滤后并冷冻干燥，获得i型胶原蛋白冻干粉，所述i型胶原蛋白冻干粉中i型胶原蛋白的纯度可高于98％。
步骤(6)
根据本发明，对所述第六沉淀进行抽提的条件可以在较宽的范围内进行选择，优选的，所述抽提的时间为4-8小时，温度为1-8℃。
根据本发明，抽提结束后对所得混合体系进行固液分离以获得第七上清液的条件可以在较宽的范围内进行选择，但本发明的发明人发现，通过采用超速离心的方法能够进一步提高后续产品的纯度，超速离心的转速可以为80000-120000g，时间可以为10-20min。
其中，可以重复对所述第六沉淀进行所述抽提步骤，以使得所述第六沉淀中含有的胶原蛋白能够最大程度的提出，所述重复的次数可以为2-5次。然后将抽提并固液分离后的上清液合并进行后处理。
根据本发明，所述第七上清液中含有iii型胶原蛋白，可以通过常规的超滤后并冷冻干燥，获得iii型胶原蛋白冻干粉，所述iii型胶原蛋白冻干粉中iii型胶原蛋白的纯度可高于90％。
根据本发明，所述鱼皮可以为各种富含胶原蛋白的鱼皮，例如，可以为罗非鱼、马面鱼、鲟鱼等。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
色谱分离柱为deae-纤维素de-32，购自solarbiolifesciences，货号为d8900。
实施例1
本实施例用于说明本发明的胶原蛋白的提取方法
1、正丁醇处理
罗非鱼皮解冻后清洗沥干，于4℃冰箱内用10体积％正丁醇于1l封口瓶内浸泡24h，清洗沥干；
2、氢氧化钠溶液处理
于4℃冰箱内用0.02mol/l氢氧化钠溶液于封口瓶内将正丁醇浸泡过的鱼皮浸泡24h，清洗沥干。
3、酶解
用剪刀将鱼皮剪成小块，称取30g鱼皮，于4℃冰箱内，于1l烧杯内，加入冰醋酸调节ph值至6.0，加入胃蛋白酶1.5g，磁力搅拌下酶解提取60h，高速低温离心机10000g离心，每次离心约250ml，离心多次，获得第一上清液。
4、盐析
相对于每升的第一上清液，使溶液的ph值为2.8，磁力搅拌下缓慢加入饱和氯化钠溶液，至终浓度为1.5mol/l。于4℃冰箱内放置12h，产品盐析析出，4℃下8000g离心20min，获得第二沉淀和第二上清，其中，第二上清液中含有iv型胶原蛋白，超滤后并冷冻干燥，获得iv型胶原蛋白冻干粉。
5、第一次抽提
将第二沉淀溶解于0.5mol/l冰醋酸中，以100000g的速度超速离心60min，取上清液，加入tris达0.03mol/l，然后在充分搅拌下加入5.0mol/l氢氧化钠中和至ph值为7，再加入饱和氯化钠溶液使溶液的最终浓度达4.4mol/l。搅拌过夜，以10000g的速度离心45分钟，弃去上清液，用4.4mol/l氯化钠-0.05mol/ltris-hcl(ph7.5)洗涤，在4℃下搅拌过夜。
然后以10000g的速度离心45分钟，弃去上清液，用2.4mol/l氯化钠-0.05mol/ltris-hcl缓冲液抽提6小时，以100000g的速度超速离心15分钟，获得第五沉淀和第五上清液。
第五上清液含ⅰ型胶原的三聚体和ⅴ型胶原，此操作重复2次。
6、色谱层析
用0.1mol/l氯化钠-2mol/l尿素-0.05mol/ltris-hcl缓冲液对第五上清液进行超滤，调整胶原溶液的浓度小于1mg/ml，然后用纤维素柱色谱分离，然后使用0.2mol/l氯化钠-2mol/l尿素-0.05mol/ltris-hcl缓冲液洗脱，洗脱产物用0.001mol/l乙酸透析3d，冷冻干燥，即得纯化ⅴ型胶原。
7、第二次抽提
第五沉淀用1.7mol/l氯化钠-0.05mol/ltris-hcl缓冲液抽提6小时，以100000g的速度超速离心15分钟，获得第六沉淀和第六上清液，此操作重复3次，合并上清液，超滤后冷冻干燥，即得ⅰ型胶原。
8、第三次抽提
第六沉淀用1.0mol/l氯化钠-0.05mol/ltris-hcl缓冲液抽提6h，以100000g超速离心15分钟。获得第七上清液，此操作重复3次，合并上清液，超滤后冷冻干燥，即得ⅲ型胶原。
实施例2
本实施例用于说明本发明的胶原蛋白的提取方法
1、正丁醇处理
罗非鱼皮解冻后清洗沥干，于4℃冰箱内用8体积％正丁醇于1l封口瓶内浸泡30h，清洗沥干；
2、氢氧化钠溶液处理
于4℃冰箱内用0.02mol/l氢氧化钾溶液于封口瓶内将正丁醇浸泡过的鱼皮浸泡20h，清洗沥干。
3、酶解
用剪刀将鱼皮剪成小块，称取30g鱼皮，于4℃冰箱内，于1l烧杯内，加入冰醋酸调节ph值至7.5，加入无花果蛋白酶0.5g，磁力搅拌下酶解提取80h，高速低温离心机8000g离心，每次离心约250ml，离心多次，获得第一上清液。
4、盐析
相对于每升的第一上清液，使溶液的ph值为2.5，磁力搅拌下缓慢加入饱和氯化钾溶液，至终浓度为1.0mol/l。于4℃冰箱内放置20h，产品盐析析出，4℃下10000g离心15min，获得第二沉淀和第二上清，其中，第二上清液中含有iv型胶原蛋白，超滤后并冷冻干燥，获得iv型胶原蛋白冻干粉。
5、第一次抽提
将第二沉淀溶解于0.5mol/l冰醋酸中，以120000g的速度超速离心40min，取上清液，加入tris达0.01mol/l，然后在充分搅拌下加入5.0mol/l氢氧化钠中和至ph值为6.5，再加入饱和氯化钠溶液使溶液的最终浓度达4mol/l。搅拌过夜，以10000g的速度离心45分钟，弃去上清液，用4.4mol/l氯化钠-0.05mol/ltris-hcl(ph7.5)洗涤，在4℃下搅拌过夜。
然后以10000g的速度离心45分钟，弃去上清液，用2.0mol/l氯化钠-0.03mol/ltris-hcl缓冲液抽提8小时，以120000g的速度超速离心10分钟，获得第五沉淀和第五上清液。
第五上清液含ⅰ型胶原的三聚体和ⅴ型胶原，此操作重复2次。
6、色谱层析
用0.08mol/l氯化钠-2.5mol/l尿素-0.03mol/ltris-hcl缓冲液对第五上清液进行超滤，调整胶原溶液的浓度小于1mg/ml，然后用纤维素柱色谱分离，然后使用0.22mol/l氯化钠-1.5mol/l尿素-0.03mol/ltris-hcl缓冲液洗脱，洗脱产物用0.0012mol/l乙酸透析3d，冷冻干燥，即得纯化ⅴ型胶原。
7、第二次抽提
第五沉淀用1.5mol/l氯化钠-0.08mol/ltris-hcl缓冲液抽提8小时，以120000g的速度超速离心10分钟，获得第六沉淀和第六上清液，此操作重复3次，合并上清液，超滤后冷冻干燥，即得ⅰ型胶原。
8、第三次抽提
第六沉淀用1.2mol/l氯化钠-0.03mol/ltris-hcl缓冲液抽提4h，以120000g超速离心10分钟。获得第七上清液，此操作重复3次，合并上清液，超滤后冷冻干燥，即得ⅲ型胶原。
实施例3
本实施例用于说明本发明的胶原蛋白的提取方法
1、正丁醇处理
罗非鱼皮解冻后清洗沥干，于4℃冰箱内用12体积％正丁醇于1l封口瓶内浸泡20h，清洗沥干；
2、氢氧化钠溶液处理
于4℃冰箱内用0.02mol/l氢氧化钠溶液于封口瓶内将正丁醇浸泡过的鱼皮浸泡30h，清洗沥干。
3、酶解
用剪刀将鱼皮剪成小块，称取30g鱼皮，于4℃冰箱内，于1l烧杯内，加入冰醋酸调节ph值至8.0，加入碱性蛋白酶3g，磁力搅拌下酶解提取40h，高速低温离心机12000g离心，每次离心约250ml，离心多次，获得第一上清液。
4、盐析
相对于每升的第一上清液，使溶液的ph值为3.0，磁力搅拌下缓慢加入饱和硫酸铵溶液，至终浓度为2.0mol/l。于4℃冰箱内放置6h，产品盐析析出，4℃下12000g离心10min，获得第二沉淀和第二上清，其中，第二上清液中含有iv型胶原蛋白，超滤后并冷冻干燥，获得iv型胶原蛋白冻干粉。
5、第一次抽提
将第二沉淀溶解于0.5mol/l冰醋酸中，以80000g的速度超速离心80min，取上清液，加入tris达0.05mol/l，然后在充分搅拌下加入5.0mol/l氢氧化钠中和至ph值为7.5，再加入饱和氯化钠溶液使溶液的最终浓度达5mol/l。搅拌过夜，以10000g的速度离心45分钟，弃去上清液，用4.4mol/l氯化钠-0.05mol/ltris-hcl(ph7.5)洗涤，在4℃下搅拌过夜。
然后以10000g的速度离心45分钟，弃去上清液，用2.8mol/l氯化钠-0.08mol/ltris-hcl缓冲液抽提4小时，以80000g的速度超速离心20分钟，获得第五沉淀和第五上清液。
第五上清液含ⅰ型胶原的三聚体和ⅴ型胶原，此操作重复2次。
6、色谱层析
用0.12mol/l氯化钠-1.5mol/l尿素-0.08mol/ltris-hcl缓冲液对第五上清液进行超滤，调整胶原溶液的浓度小于1mg/ml，然后用纤维素柱色谱分离，然后使用0.15mol/l氯化钠-2.5mol/l尿素-0.08mol/ltris-hcl缓冲液洗脱，洗脱产物用0.0008mol/l乙酸透析3d，冷冻干燥，即得纯化ⅴ型胶原。
7、第二次抽提
第五沉淀用2.0mol/l氯化钠-0.03mol/ltris-hcl缓冲液抽提4小时，以80000g的速度超速离心20分钟，获得第六沉淀和第六上清液，此操作重复3次，合并上清液，超滤后冷冻干燥，即得ⅰ型胶原。
8、第三次抽提
第六沉淀用0.8mol/l氯化钠-0.08mol/ltris-hcl缓冲液抽提8h，以80000g超速离心20分钟。获得第七上清液，此操作重复3次，合并上清液，超滤后冷冻干燥，即得ⅲ型胶原。
实施例4
本实施例用于说明本发明的胶原蛋白的提取方法
按照实施例1的方法进行胶原蛋白的提取，不同的是，省略步骤(1)正丁醇处理的步骤，分别得到4种不同类型的胶原蛋白。
实施例5
本实施例用于说明本发明的胶原蛋白的提取方法
按照实施例1的方法进行胶原蛋白的提取，不同的是，步骤(1)中，使用异丁醇对鱼皮进行处理，分别得到4种不同类型的胶原蛋白。
实施例6
本实施例用于说明本发明的胶原蛋白的提取方法
按照实施例1的方法进行胶原蛋白的提取，不同的是，步骤(1)和步骤(2)进行对调，分别得到4种不同类型的胶原蛋白。
实施例7
本实施例用于说明本发明的胶原蛋白的提取方法
按照实施例1的方法进行胶原蛋白的提取，不同的是，所述蛋白酶为菠萝蛋白酶，分别得到4种不同类型的胶原蛋白。
实施例8
本实施例用于说明本发明的胶原蛋白的提取方法
按照实施例1的方法进行胶原蛋白的提取，不同的是，步骤(5)第一次抽提中，酸溶后进行固液分离的条件包括：转速为12000g，时间为60min，在向所述第三上清液中加入盐溶液前，不向所述第三上清液中加入tris的步骤；抽提后进行固液分离的条件包括：转速为12000g，时间为15min。分别得到4种不同类型的胶原蛋白。
对比例1
本对比例用于说明参比的胶原蛋白的提取方法
按照实施例1的方法进行胶原蛋白的提取，不同的是，步骤(7)第二次抽提和步骤(8)第三次抽提的顺序对调，也即，步骤(7)获得iii型胶原蛋白，步骤(8)获得i型胶原蛋白。
测试例
胶原蛋白纯度
使用i型胶原蛋白酶联免疫分析试剂盒检测i型胶原蛋白含量，计算i型胶原蛋白的纯度。ⅲ型胶原蛋白、ⅳ型胶原蛋白和ⅴ型胶原蛋白分别使用该物质的酶联免疫分析试剂盒，测定含量后计算纯度。
表1
通过表1的结果可以看出，采用本发明的方法提取鱼皮中的胶原蛋白，能够获得4种不同的胶原蛋白，也即，i型、ⅲ型、ⅳ型、ⅴ型，且纯度均较高，其中，i型胶原蛋白的纯度可达98％以上，ⅲ型、ⅳ型、ⅴ型的纯度可达90％以上。此外，由实施例1和实施例4-6进行对比可以看出，在对鱼皮进行酶解之前，优选采用正丁醇和氢氧化钠溶液对鱼皮进行处理，能够进一步提高所得各类型胶原蛋白的纯度；由实施例1和实施例7进行对比可以看出，使用本申请优选的蛋白酶对鱼皮进行酶解，能够进一步提高所得各类型胶原蛋白的纯度；由实施例1和实施例8比较可以看出，步骤(5)第一次抽提中，酸溶后以及抽提后的固液分离条件采用本申请的超高速离心，且在向所述第三上清液中加入盐溶液前，向所述第三上清液中加入tris，能够进一步提高所得各类型胶原蛋白的纯度。
此外，本申请的方法在提取胶原蛋白的过程中，由于没有采用高温灭酶的步骤，因此，胶原蛋白颜色发基本为白色，并且本申请不使用有毒有害试剂，安全性较高。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。