一种柴达木双层环伞菌及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种柴达木双层环伞菌亚种高等真菌zju-cdma-12菌株及其应用。

背景技术：

青藏高原汇集了全球分布最高的大型真菌，被称为世界“高山真菌宝库”，适于耐寒性、耐缺氧大型真菌生长。据初步统计，喜马拉雅海拔3000～5800m，就有大型真菌300余种，金针菇、黄绿蜜环菌、铅色灰球菌等分布超过海拔4000m，为世界所罕见。

柴达木双层环伞菌又名柴达木大肥蘑菇(agaricusbitorquis(quél.)sacc.qaidam)，为罕见的担子菌亚门(basidiomycotina)、伞菌目(agaricales)、蘑菇科、蘑菇属的低温型地生蘑菇，作为青藏高原真菌资源宝库中的代表种，被公认为最有开发价值的名贵野生药食兼用真菌之一。

研究表明，从植物、真菌等中提取活性多糖具有调节免疫、抗肿瘤、降血糖、抗疲劳、抗缺氧、抗氧化等多种生物学功能。国内外研究者发现多糖可以通过多条细胞信号，包括g蛋白介导的信号转导途径、受体酪氨酸蛋白激酶(receptortyrosineproteinkinase，rtpk)途径、no信号转导途径、核转录因子κb(nuclearfactor-kappab，nf-κb)信号转导途径作用于相关细胞，从而发挥其免疫调节活性(weimin，z.，wuren,m.,jing,z.etal.“theimmunoregulatoryactivitiesofastragaluspolysaccharideliposomeonmacrophagesanddendriticcells”，《internationaljournalofbiologicalmacromolecules》，105，852-861(2017))。

多糖类化合物具有清除自由基，抑制脂质过氧化，抑制亚油酸氧化等抗氧化作用。不少研究提示，多糖的抗氧化性可能是抗肿瘤、抗衰老、抗感染等其它活性的作用机理之一。人参多糖具有抗疲劳作用，可以提高小鼠血中ldh、ck、葡葡萄糖和mda水平，降低血清中tg和gsh-px水平，其抗疲劳作用机理可能是通过调节抗氧化酶的活性来减慢脂质氧化过程，从而减弱细胞膜的氧化损害(jia,w.,shanshan,l.,yuying,f.etal.“anti-fatigueactivityofthewater-solublepolysaccharidesisolatedfrompanaxginsengc.a.meyer”，《journalofethnopharmacology》，130，421-423(2010))。

从粒盘毛菌种提取分离的真菌多糖lep-1可以延长常压缺氧条件小鼠的游泳时间，同时在亚硝酸钠中毒试验中lep-1能对缺氧损伤的细胞起到保护作用，从而表现出抗缺氧活性(zhanzhan,d.,shuai,z.,maheenmahwish,s.“strtcturalcharacterizationandanti-hypoxiaactivityofanexopolysaccharideisolatedfromfermentationbrothoflachnumsp.”，《processbiochemistry》，51，1290-1298(2016))。黑灵芝多糖能抑制缺氧/复氧引起的ldh的释放及细胞活力的下降，这种保护作用伴随着mda含量减少，sod、cat、gsh-px活性增强及蛋白表达量增大，并且能减少缺氧/复氧引起的ros的释放及细胞凋亡；且黑灵芝多糖通过调节半胱氨酸蛋白酶、bcl-2和氧化还原系统保护心肌细胞，防止缺氧/复氧诱导的线粒体介导的细胞凋亡(wen-juan,l.,shao-ping,n.,yi,c.etal.,“ganodermaatrumpolysaccharideprotectscardiomyocytesagainstanoxia/reoxygenation-inducedoxidativestressbymitochondrialpathway”，《journalofcellularbiochemistry》，110，191-200，(2010))。研究表明，许多天然多糖成分具有改善运动性疲劳的作用，其作用机制大多与提高机体糖储备以及提高机体免疫能力等方面有关，多糖抗运动性疲劳方面的研究成为近几年运动营养学领域研究一个热点。研究发现从玛卡中分离得到的多糖组分mps-1和mps-2均能延长小鼠的游泳时间，降低小鼠血清中la、ldh和bun水平，提高hg水平，表明该两种多糖具有抗疲劳作用(jing,l.,qingrui,s.,qingran,m.etal.“anti-fatigueactivityofpolysaccharidefractionsfromlepidiummeyeniiwalp.(maca)”，《internationaljournalofbiologicalmacromolecules》，95，1305-1311(2017))。

目前，涉及抗疲劳、抗缺氧的食品、保健品和药物也相继有开发报道。但是，涉及具有抗疲劳抗缺氧活性的食用菌多糖专利申请文件较少，cn105192514a公布了一种由黑木耳多糖浓缩液、大豆分离蛋白、乳清蛋白、果糖、植物油、麦芽糊精等成分构成的黑木耳多糖能量棒，该产品可以明显延长小鼠负重游泳时间，降低血乳酸和血尿素氮含量，同时具有增加机体糖原储备的作用，具有明显的抗疲劳和消除疲劳作用。

综上，研究高效、经济、低毒甚至无毒的抗疲劳、抗缺氧食品功能因子具有十分重要研究意义和实际应用价值。基于新食品资源和特征功效成分的发掘是我国健康食品或维护人体健康的重要公益研究领域，其中围绕高海拔地域的独特食品资源发掘和关键功效成分解析具有重要战略意义和实际应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于重点挖掘一种生长在青藏高原柴达木盆地地区地下深层生长萌发的柴达木双层环伞菌亚种食用资源，并挖掘其活性多糖的抗疲劳、抗缺氧功能，开发具有更高生物活性功能的食用菌多糖，为开发天然、低毒甚至无毒、高效的抗疲劳、抗缺氧食品功能因子以及保健食品资源提供新的途径和解决方案。

本发明提供了一种柴达木双层环伞菌，从青藏高原青海省柴达木大盆地生长在盆地戈壁地区表面盐层50-60cm下的野生柴达木双层环伞菌子实体中组织分离，经人工正常大气压下纯化与培养，得到新的菌株，命名为柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12(agaricusbitorquiszju-cdma-12)，这是首次在低海拔地区正常条件下培养获得的柴达木双层环伞菌菌株。利用形态特征、培养形状和生理生化特征等微生物学特性对柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12鉴定为担子菌亚门(basidiomycotina)、伞菌目(agaricales)、蘑菇科、蘑菇属的低温型地生蘑菇agaricusbitorquis(quél.)sacc.qaidam，该菌株已于2018年5月4日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctccno:m2018250，保藏地址：中国武汉，武汉大学。

该菌株具有下述生物学特性：

菌体特征：为食用真菌，菌体长约52-74μm，宽约18-32μm。

菌落特征：在pda培养基上形成明显的菌落，直径在346-579mm之间，菌落呈铁饼状，从中央辐射状向四周平展，菌落中心部有隆起，四周平展，呈草帽状；边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素。

生长特性：该菌株的最低生长温度为8℃，最高生长温度为32℃，在温度18-25摄氏度下生长最佳，最高和最低初始生长ph分别为7.8和2.3，最适生长初始ph为5.0；菌丝萌芽阶段相对较长，为7-10天。

该菌丝体的保存方法：在温度4℃下以pda斜面试管避光形式保存。

培养方法与培养条件：本发明的菌种采用需氧、避光的培养方式。用于培养该菌株的碳源可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、乳糖、土豆提取物等；氮源可以是酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨等。该菌株菌丝体生长的最佳温度范围为18-28℃，ph范围3-7。用于该菌株液体培养的最佳温度范围为18-25℃，ph范围3-6。在菌株液体培养过程中还可以添加磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、复合维生素b、维生素c等成分，液体培养过程中摇床转速为90-150rpm。

研究表明，从本发明提供的菌株提取分离出的子实体多糖、菌丝体多糖或是通过液体发酵制得的发酵液多糖均具有提高小鼠力竭游泳时间、延长常压密闭容器中小鼠存活时间、对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞具有保护作用的特点，体现了该多糖具有抗疲劳、抗缺氧的活性。

因此，本发明提供了柴达木双层环伞菌在制备抗疲劳或抗缺氧的药物或保健品中的应用。

本发明提供了一种柴达木双层环伞菌多糖的制备方法，所述柴达木双层环伞菌多糖为子实体多糖、菌丝体多糖或发酵液多糖，

所述子实体多糖的制备方法，包括：

取所述的柴达木双层环伞菌的子实体，加入水中，于70-90℃水浴中浸提，收集上清液，浓缩后醇沉，收集沉淀，复溶后制得子实体多糖；

所述菌丝体多糖的制备方法，包括：

(1)将活化的所述的柴达木双层环伞菌菌种接入种子培养基，16-28℃避光培养，得到种子液；

(2)将种子液接入液体扩大培养基中，16-28℃避光振荡培养，培养结束后，收集固形菌丝体，干燥；

(3)将干燥的菌丝体粉碎后加入水中，细胞破碎，于70-90℃水浴中浸提，收集上清液，浓缩后醇沉，收集沉淀，复溶后制得菌丝体多糖；

所述发酵液多糖的制备方法，包括：

(a)将活化的所述的柴达木双层环伞菌菌种接入种子培养基，16-28℃避光培养，得到种子液；

(b)将种子液接入液体发酵培养基中，16-28℃避光振荡培养；

(c)过滤收集发酵液，浓缩后醇沉，收集沉淀，复溶后制得发酵液多糖。

步骤(1)和步骤(a)中，菌株活化时，将柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌种接种于pda斜面培养基中，12-25℃避光培养7-40天。

所述接种方式为挖块接种，优选地，挖取2-3块(长×宽：2-3cm×1-2cm)接入斜面试管中。

作为优选，所述的pda斜面培养基中含有质量百分比为0.2％-0.7％的蛋白胨。添加蛋白胨使得菌丝体生长更粗壮，不容易断裂，且有助于加快生长速度。更为优选，蛋白胨的添加量为0.5％。pda固体种子培养基的组分包括：100-400g/l土豆提取物、10-35g/l葡萄糖、2-10g/l蛋白胨、0.01-0.1g/lcacl2，ph值为3.0-7.8。

作为优选，菌株活化培养条件为18-23℃避光培养21-30天。更为优选，先在18℃下培养2天，再转移到23℃下避光培养19-28天。

步骤(1)和步骤(a)中，所述种子培养基的组分包括：100-400g/l土豆提取物、10-35g/l葡萄糖、2-10g/l蛋白胨、0.01-0.1g/lcacl2，ph值为3.0-7.8；种子液制备条件为：16-28℃避光振荡培养7-20天，转速为90-160rpm。

作为优选，所述种子培养基的组分包括：200g/l土豆提取物、20g/l葡萄糖、5g/l蛋白胨、0.05g/lcacl2，ph值为5.0；种子液制备条件为：23℃避光振荡培养14天，转速120rpm。

步骤(2)中，所述扩大培养基的组分包括：10-60g/l葡萄糖、0-60g/l果糖、0-40g/l蔗糖、0-40g/l麦芽糖、2-10g/l蛋白胨、0.01-0.1g/lcacl2、0.1-1.0g/l7h2o·mgso4、0.3-3g/lkh2po3、0.05-0.1g/l复合b族维生素，ph值为2.0-7.5；菌丝体扩大培养条件为：接种量10％，18-28℃下避光振荡培养5-15天，转速为90-160rpm。

作为优选，所述扩大培养基的组分包括：10g/l葡萄糖、17g/l果糖、5g/l蔗糖、3g/l麦芽糖、5g/l蛋白胨、0.05g/lcacl2、0.5g/l7h2o·mgso4、1g/lkh2po3、0.06g/l复合b族维生素，ph值为5；扩大培养条件为：23℃下避光恒温振荡培养10天，转速为120rpm。

在上述的条件下进行培养，柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体的生物量最大可达到17.26g/l。

步骤(b)中，所述液体发酵培养基的组分包括：50-500g/l土豆提取物、0-65g/l麦芽糖、2-12g/l蛋白胨、0.01-0.1g/lcacl2、0.12-1.2g/l7h2o·mgso4、0.3-3g/lkh2po3、0.05-0.5g/l复合b族维生素，ph值为2.5-7.5。

作为优选，所述液体发酵培养基的组分包括：200g/l土豆提取物、35g/l麦芽糖、5g/l蛋白胨、0.05g/lcacl2、0.5g/l7h2o·mgso4、2g/lkh2po3、0.1g/l复合b族维生素，ph值为5；发酵培养条件为：接种量10％，23℃下避光振荡培养10天，转速120rpm。

在上述的条件下进行发酵培养，柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体发酵液中的活性多糖含量最高可达到18.65g/l。

提取子实体多糖和菌丝体多糖时，本发明采用水提法进行活性多糖的提取，物料与水的配比为：子实体干粉1g对应水20ml；菌丝体1g对应水80ml。作为优选，在80℃的水中浸提3h，3000r/min离心后收集上清液。

所述的浓缩为在50℃、0.01mpa条件下减压浓缩。

所述的醇沉为浓缩液用4倍体积量的95％(v/v)乙醇于4℃下醇沉24h。

本发明利用上述方法制得柴达木双层环伞菌粗多糖，按照经典的抗疲劳实验和抗缺氧实验方法，通过大量评估、分析实验，从柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体粗多糖、发酵液粗多糖、菌丝体粗多糖具有下述性质：

(1)具有抗疲劳活性，能延长小鼠力竭游泳时间；

(2)具有抗缺氧活性，能提高常压密闭容器中小鼠存活时间；

(3)对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞具有保护作用，能减少该细胞在缺氧环境下的凋亡。

进一步地，粗多糖依次经脱色、脱蛋白、层析等纯化步骤得到柴达木双层环伞菌多糖。

所述脱色为采用活性炭进行脱色，作为优选，按照100ml浓度为5mg/ml的粗多糖溶液加入6g活性炭进行脱色，脱色时水浴温度为60℃，脱色时间40分钟，边搅拌边脱色。

所述脱蛋白为采用savage法脱蛋白，作为优选，按照v(正丁醇)：v(氯仿)＝1:5配置savage试剂，按照v(多糖溶液)：v(sevege)＝1:2配置成混合溶液。将所述的混合溶液剧烈振摇20-30min，蛋白质变性后形成凝胶沉淀，离心15min(3000r/min)分离，分出水层和溶剂层交界处的变性蛋白质，吸取水层溶液得到脱蛋白多糖溶液。

所述层析为采用deae-52纤维素柱，以2mnacl溶液为洗脱液进行分离纯化，洗脱液流速为1ml/min，分段收集多糖洗脱液，分别得到纯化后的子实体多糖组分、菌丝体多糖组分和发酵液多糖组分。

具体地：对脱蛋白的子实体多糖溶液进行分离纯化，分段收集出峰时间为洗脱体积是层析柱体积1.3倍、2.7倍、3.6倍时的馏分，即为子实体多糖组分ps-i、ps-ii、ps-iii；

对脱蛋白的菌丝体多糖溶液进行分离纯化，分段收集出峰时间为洗脱体积是层析柱体积1.6倍、2.5倍、3.7倍时的馏分，即为菌丝体多糖组分pm-i、pm-ii、pm-iii；

对脱蛋白的发酵液多糖溶液进行分离纯化，分段收集出峰时间为洗脱体积是层析柱体积3.6倍、4.3倍和5.5倍时的馏分，即为发酵液多糖组分pfs-i、pfs-ii、pfs-iii。

研究表明，柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖、菌丝体多糖和发酵液多糖的分子量大小有差异，且3种多糖中均含有3个不同组分。

本发明提供了由上述制备方法制得的柴达木双层环伞菌多糖。所述多糖具有抗疲劳、抗缺氧的活性。

本发明还提供了所述的柴达木双层环伞菌多糖在制备抗疲劳或抗缺氧的药物或保健品中的应用。

进一步研究表明，柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体多糖组分pm-i具有下述性质：

(1)通过提高肺动脉平滑肌细胞中kv1.5的表达量、降低kir6.2的表达量从而保护缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞；

(2)通过提高肺动脉平滑肌细胞中5-羟色胺(5-ht)和多巴胺(da)含量、降低乳酸脱氢酶(ldh)、还原型辅酶ⅱ(ndaph)、内皮素(et)和乙酰胆碱(ach)含量从而保护缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞；

(3)对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞的保护作用与[ca²⁺]ii通道有关；

(4)对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞的保护作用与k离子通道有关。

因此，本发明提供的柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体多糖组分pm-i可应用于制备治疗肺缺氧性损伤疾病的药物或保健品中。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明提供了一种食用真菌柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12，从该zju-cdma-12野生子实体提取分离的胞内多糖、人工培养的菌丝体中提取分离的菌丝体多糖以及菌丝体经液体发酵得到的发酵液多糖均具有提高小鼠力竭游泳时间、延长常压密闭容器中小鼠存活时间、对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞具有保护作用的特点，从而体现抗疲劳、抗缺氧活性。柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体变种可作为提取抗疲劳、抗缺氧活性因子的来源，也可用于制备具有抗疲劳、抗缺氧功能的食品或者药物，具有非常广泛的应用前景。

(2)本发明提供的子实体多糖、菌丝体发酵液多糖和菌丝体多糖制备方法简单易操作，菌丝体液体发酵培养条件简单、且容易控制，发酵时能产生大量生物活性多糖。

附图说明

图1为柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体透射电镜，其中(a)为1微米的菌丝体内部结构；(b)为2微米的内部结构。

图2为柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌落。

图3为柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖组分(a)、发酵液多糖组分(b)和菌丝体多糖组分(c)的洗脱曲线。

图4为柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖组分i、发酵液多糖组分i和菌丝体多糖组分i的傅里叶红外光谱图。

图5为柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖组分i、菌丝体多糖组分i和发酵液多糖组分i的核磁共振图谱，其中图(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)分别为柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖组分的¹hnmr图谱、子实体多糖组分的¹³cnmr图谱、发酵液多糖组分i的¹hnmr图谱、发酵液多糖组分i的¹³cnmr图谱、菌丝体多糖组分i的¹hnmr图谱、菌丝体多糖组分i的¹³cnmr图谱。

图6为柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖组分(ps)、发酵液多糖组分(pfb)和菌丝体多糖(pm)对力竭游泳小鼠的抗疲劳作用，其中图a、b、c、d、e分别为柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖组分(ps)、发酵液多糖组分(pfb)和菌丝体多糖(pm)对小鼠力竭游泳时间的影响、对小鼠血液中hb含量的影响、对小鼠血液中bun含量的影响、对小鼠血液中la和ldh含量的影响、对小鼠肝脏中hg含量的影响；小写字母a、b、c、d等表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异(p＜0.05)。

图7为柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖组分(ps)、发酵液多糖组分(pfb)和菌丝体多糖组分(pm)对常压密闭容器急性缺氧小鼠的抗缺氧作用，其中图a、b、c、d、e、f、g、h分别代表柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖组分(ps)、发酵液多糖组分(pfb)和菌丝体多糖(pm)对常氧密闭容器缺氧小鼠存活时间的影响、对常氧密闭容器缺氧小鼠脑积水含量的影响、对小鼠肝脏中gph-px、cat、sod、mda、no和tp的影响。

图8为柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖组分(ps)、发酵液多糖组分(pfb)和菌丝体多糖组分(pm)对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞的保护作用，其中图a、b、c分别为肺动脉平滑肌细胞在不同氧气浓度下od450值随时间的变化、子实体多糖组分(ps)、发酵液多糖组分(pfb)和菌丝体多糖组分(pm)对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞的保护作用、子实体多糖组分(ps)、发酵液多糖组分(pfb)和菌丝体多糖组分(pm)对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞凋亡率的影响。小写字母a、b、c、d等表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异(p＜0.05)。

图9为柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖、菌丝体多糖和发酵液多糖对缺氧损伤的pc12细胞的保护作用，其中图a、b、c分别为pc12细胞在不同氧气浓度下od450值随时间的变化、菌丝体多糖组分(pm-i)对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞的保护作用、菌丝体多糖组分(pm-i)对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞凋亡率的影响。对照为空白组、阳性对照红景天苷组、阴性对照苯丙胺组；小写字母a、b、c、d等表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异(p＜0.05)。

图10为柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体多糖组分pm-i对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞中kv1.5的和kir6.2蛋白表达量的影响，其中图a、b、c分别为肺动脉平滑肌细胞中kv1.5的和kir6.2蛋白的电泳图(其中1为常氧空白组，2为常氧阳性对照组，3为常氧阴性对照组，4为常氧菌丝体多糖pm-i组，5为缺氧空白组，6为缺氧阳性对照组，7为缺氧阴性对照组，8为缺氧菌丝体多糖pm-i组)、菌丝体多糖pm-i对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞中kv1.5表达量的影响、菌丝体多糖pm-i对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞中kir6.2表达量的影响。对照为空白组、阳性对照红景天苷组、阴性对照苯丙胺组；小写字母a、b、c、d等表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异(p＜0.05)。

图11为柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体多糖pm-i对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞中[ca²⁺]i的影响。其中图a、b、c分别为对照组、红景天苷组和菌丝体多糖pm-i组的缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞中荧光染色图，d为三组缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞中[ca²⁺]i荧光值的影响。对照为缺氧空白组，小写字母a、b、c、d等表示不同字母所代表的组别都存在显著性差异(p＜0.05)。

图12为柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体多糖pm-i对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞中钾电流的影响。其中图a、d分别为空白组缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞中电化学图和钾电流变化图，图b、e分别为红景天苷组缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞中电化学图和钾电流变化图，图c、f分别为菌丝体多糖pm-i组缺氧损伤的缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞中电化学图和钾电流变化图，图h为三组缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞中最大钾电流的影响。小写字母a、b、c等不同字母所代表的组别都存在显著性差异(p＜0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但保护范围并不局限于此。

实施例1：柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12的分离鉴定

1、柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌种来源：由海拔从四周4000m到中部2600m的柴达木盆地德令哈、格尔木、诺木洪等地，生长在盆地戈壁地区表面盐层50-60cm下的野生柴达木双层环伞菌子实体中组织分离，经人工正常大气压下纯化与培养得到。

菌体特征：为食用真菌，菌体长约52-74μm，宽约18-32μm，参见附图1。

菌落特征：在pda培养基上形成明显的菌落，直径在346-579mm之间，菌落呈铁饼状，从中央辐射状向四周平展，菌落中心部有隆起，四周平展，呈草帽状；边缘整齐，乳白色，不透明，表面湿润光滑，不产生色素，参见附图2。

生长特性：该菌株的最低生长温度为8℃，最高生长温度为32℃，在温度18-25摄氏度下生长最佳，最高和最低初始生长ph分别为7.8和2.3，最适生长初始ph为5.0；菌丝萌芽阶段相对较长，为7-10天。

菌丝体菌株的保存方法：在温度4℃下以pda斜面试管形式保存。

利用形态特征、培养形状和生理生化特征等微生物学特性对上述菌株鉴定为担子菌亚门(basidiomycotina)、伞菌目(agaricales)、蘑菇科、蘑菇属的低温型地生蘑菇agaricusbitorquis(quél.)sacc.qaidam，并将其命名为柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12(agaricusbitorquiszju-cdma-12)，该菌株已于2018年5月4日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctccno:m-2018250，保藏地址：中国武汉，武汉大学。该培养物的存活性由2018年5月15日检测完毕，结果为存活。

2、柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体的培养方法与培养条件：

采用需氧、避光的培养方式。用于培养该菌株的碳源可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、甘露糖、乳糖、土豆提取物等；用于培养该菌株的氮源可以是酵母膏、牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨等。该菌株菌丝体生长的最佳温度范围为18-28℃，ph范围3-7。

用于该菌株液体培养的最佳温度范围为18-25℃，ph范围3-6。在菌株液体培养过程中还可以添加磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、复合维生素b、维生素c等成分，液体培养过程中摇床转速为90-150rpm。目前，柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体的人工扩繁及二级种子已获得了成功，菌丝体生长温度范围为18-28℃，ph范围3-7，培养时间为10-30天。

柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12中营养成分丰富，富含粗蛋白24.0％、粗纤维17.32％、粗脂肪2.10％、碳水化合物34.91％、灰分13.65％；必需氨基酸(5.215g/100g)占氨基酸总量(15.88g/100g)的35.84％；含维生素b20.107mg/100g、维生素b3(烟酸)8.168mg/100g；1kg子实体含钾118mg、磷38.5mg、硫272.6mg、钙624.9mg、铜11.07mg、铁163.4mg、镁608.6mg、锰5.77mg和钠223.5mg。柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12中富含多种生物活性成分，如多糖、萜类物质、多酚等，研究表明从柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12的子实体、发酵液、菌丝体中提取活性多糖具有明显的抗疲劳、抗缺氧活性。

实施例2：利用柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体提取子实体多糖

1)、子实体粗多糖的提取

将干燥的柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体进行粉碎，过60目筛。按柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体干粉1g对应蒸馏水20ml，水浴温度80℃，水浴时间3h，离心15min(3000r/min)收集上清液，上清液用旋转蒸发仪进行减压浓缩(50℃，0.01mpa)，得到的浓缩液用4倍95％(v/v)乙醇于4℃下醇沉24h，并收集沉淀。将沉淀用蒸馏水溶解，得到子实体粗多糖提取物。

2)、子实体粗多糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法测定粗多糖含量。得到的子实体粗多糖(ps)含量为12.37±0.41g/100ml。

实施例3：利用柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体进行液体发酵培养生产菌丝体多糖

1)菌丝体活化：将柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体斜面菌种接种于添加0.5％蛋白胨的pda斜面试管中，23℃避光培养28天；

2)种子培养：液体种子培养基组成为：200g/l土豆提取物、20g/l葡萄糖、5g/l蛋白胨、0.05g/lcacl2，ph5.0。装液量为50ml种子液/250ml三角瓶，121℃灭菌20min。将活化的斜面菌种采用挖块接种方式(2块，长×宽：3cm×1cm)接入液体种子培养基中，23℃避光培养16天，转速120rpm；

3)扩大培养：扩大培养基组成为：10g/l葡萄糖、17g/l果糖、5g/l蔗糖、3g/l麦芽糖、5g/l蛋白胨、0.05g/lcacl2、0.5g/l7h2o·mgso4、1g/lkh2po3、0.06g/l复合b族维生素，发酵液ph5。装液量为50ml种子液/250ml三角瓶，121℃灭菌20min。取步骤2)中的种子液接入液体发酵培养基中进行发酵，接种量为10％，23℃避光培养10天，转速为120rmp。

4)生物量(菌丝体)测定：发酵结束后用4层纱布过滤发酵液，得到固形菌丝体。用蒸馏水将固形菌丝体冲洗干净，于60℃烘箱中烘干(48h)，称量烘干的菌丝体。在此条件下培养得到的柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体的生物量总共为18.79g，生物量含量为16.26g/l。

5)菌丝体粗多糖提取：将步骤4)中得到的干燥菌丝体粉碎，称取10.015g菌丝体，按照1g/80ml加入蒸馏水并用细胞破碎仪破碎，于80℃水浴提取3h，离心15min(3000r/min)收集上清液，上清液用旋转蒸发仪进行减压浓缩(50℃，0.01mpa)，得到的浓缩液用4倍95％(v/v)乙醇于4℃下醇沉24h，并收集多糖沉淀。将多糖沉淀用蒸馏水溶解，定容到100ml，得到菌丝体粗多糖。

6)菌丝体粗多糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法测定粗多糖含量。得到的菌丝体粗多糖(pm)含量为24.14±0.41g/100g。

实施例4：利用柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12液体深层发酵培养获得最大胞外多糖

1)菌株活化：将柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体斜面菌种接种于添加0.5％蛋白胨的pda斜面试管中，先在18℃下培养2天，再转移到23℃下避光培养19-28天。固体种子培养基的组分包括：200g/l土豆提取物、20g/l葡萄糖、5g/l蛋白胨、0.05g/lcacl2，ph5.0。

2)液体种子培养基及其培养条件

液体种子培养基的组分包括：200g/l土豆提取物、20g/l葡萄糖、5g/l蛋白胨、0.05g/lcacl2，ph值为5.0。种子液制备条件为：23℃避光振荡培养14天，转速120rpm。

3)液体发酵培养基及培养条件

液体发酵培养基的组分包括：200g/l土豆提取物、35g/l麦芽糖、5g/l蛋白胨、0.05g/lcacl2、0.5g/l7h2o·mgso4、2g/lkh2po3、0.1g/l复合b族维生素，ph值为5。装液量为50ml种子液/250ml三角瓶，121℃灭菌20min。取步骤3)中的种子液接入液体发酵培养基中进行发酵，接种量为10％，23℃避光培养10天，转速为120rmp。

4)发酵液粗多糖提取：将步骤3)得到的发酵液用旋转蒸发仪进行减压浓缩(50℃，0.01mpa)，得到的浓缩液用4倍95％(v/v)乙醇于4℃下醇沉24h，并收集沉淀。将沉淀用蒸馏水溶解，得到发酵液粗多糖提取物。

在上述条件下进行发酵培养，柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体发酵液中的活性多糖含量最高可达到18.65g/l。

实施例5：对实施例2-4获得的子实体粗多糖、发酵液粗多糖和菌丝体粗多糖进行纯化分离得到多糖单组分

1)、粗多糖的脱色：

采用活性炭进行脱色。分别将柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体粗多糖(ps)、发酵液粗多糖(pfb)和菌丝体粗多糖(pm)溶液进行脱色处理。将3种粗多糖稀释成多糖浓度为5mg/ml的溶液，按照在100ml多糖溶液中加入6g活性炭进行脱色，脱色时水浴温度为60℃，脱色时间40分钟，边搅拌边脱色。

2)、粗多糖的脱蛋白处理

将脱色处理的3种粗多糖溶液采用savage法脱蛋白。按照v(正丁醇)：v(氯仿)＝1:5配置savage试剂，按照v(多糖溶液)：v(sevege)＝1:2配置成混合溶液。将混合溶液剧烈振摇20-30min，蛋白质变性后形成凝胶沉淀，离心15min(3000r/min)分离，分出水层和溶剂层交界处的变性蛋白质。采用考马斯亮蓝法检测蛋白质含量。得到脱蛋白后的多糖粗溶液。

3)、粗多糖的柱层析

将得到的3种脱蛋白多糖溶液用deae-52纤维素进行柱层析，并用2mnacl盐溶液进行洗脱，苯酚-硫酸法检测洗脱液中多糖含量。

4)、收集：用2mnacl溶液洗脱，按1ml/min的流速收集洗脱液，采用苯酚-硫酸法测定每管od值，绘制洗脱曲线。根据洗脱峰值收集不同组分，分段收集多糖洗脱液，分别得到纯化后的柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖组分(ps-i、ps-ii、ps-iii)、发酵液多糖组分(pfs-i、pfs-ii、pfs-iii)、菌丝体多糖组分(pm-i、pm-ii、pm-iii)。

其中，菌丝体多糖第一个组分pm-i出峰时较早，约洗脱液体积是层析柱体积的1.6倍时，出现该组分，菌丝体多糖组分pm-ii和pm-iii的出峰时间为洗脱体积是层析柱体积的2.5倍、3.7倍；子实体多糖三个组分的出峰时间分别为洗脱体积为层析柱体积的1.3倍、2.7倍和3.6倍；发酵液多糖的三个组分的出峰时间分别是洗脱液体积为层析柱体积的3.6倍、4.3倍和5.5倍。

分别将3种多糖组分在无菌操作台中进行无菌滤膜过滤，放入4℃冰箱冷藏备用。

实施例6：检测实施例5制得的子实体多糖组分、发酵液多糖组分和菌丝体组分的分子量

1)、标准葡聚糖分子量的标准曲线制作

利用不同分子量大小的多糖在葡聚糖凝胶柱中保留时间不同的原理，先测定出葡聚糖标准品在deae-52凝胶柱中的保留时间，以已知分子量标准品的保留时间(rt)为横坐标x，以相应分子量的对数值lgmw为纵坐标y，绘制标准品分子量的标准曲线：y＝-0.173x+7.653，r²＝0.9957。

2)、多糖组分分子量测定步骤

分别将柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖组分、发酵液多糖组分和菌丝体多糖组分配成浓度为2mg/ml的样液，各取1ml进行加样，测定其保留时间rt，根据标准品分子量的标准曲线计算出三种多糖的分子量大小。

3)、多糖组分分子量测定结果

柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖组分、发酵液多糖组分和菌丝体多糖组分的洗脱曲线见附图3，不同组分的分子量大小见附表1。

表1.子实体多糖组分、发酵液多糖组分和菌丝体多糖组分分子量的测定

从实验结果中可以看出，通过deae-52纤维素柱分离纯化，从柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体、发酵液和菌丝体中均分离得到3种多糖组分，评价分子量大小分别为20234da、2773da和14417da。不同多糖组分的分子量大小见附表1。不同种类多糖的分子量大小存在差异，3种多糖的平均分子量大小从大到小的排列顺序为：子实体多糖＞菌丝体多糖＞发酵液多糖。其中，发酵液和菌丝体多糖的平均分子量分别仅为子实体多糖的0.14倍和0.71倍。实验结果表明，柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖、菌丝体多糖和发酵液多糖的分子量大小有差异，且3种多糖中均含有3个不同组分。

实施例7：检测实施例5制得的子实体多糖组分i(ps-i)、发酵液多糖组分i(pfb-i)和菌丝体多糖组分i(pm-i)的红外光谱图

1)、多糖组分样品处理

将柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖组分i(ps-i)、发酵液多糖组分i(pfb-i)和菌丝体多糖组分i(pm-i)分别冻干(-51℃，48h)，分别与烘至恒重的kbr粉末(0.2-0.5g)混合，充分研磨，混合均匀，进行压片处理。并分析4000-400cm^-1范围内3种多糖组分的红外吸收光谱。

2)、多糖组分的傅里叶红外光谱图

柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖组分i(ps-i)、发酵液多糖组分i(pfb-i)和菌丝体多糖组分i(pm-i)见附图4。实验结果表明，该3种多糖组分在3300-3500、3000-2800、1590-1650cm^-1范围内有相似的吸收峰，但是在1200-1000cm^-1波长范围内的吸收峰有所差异。3种多糖组分在3300-3500cm^-1范围内的吸收峰是羟基的伸缩振动峰。2920cm^-1处的吸收峰与c-h基团伸缩振动和游离糖的弯曲振动有关。3种多糖组分在950-1200cm^-1的吸收峰表明其糖链结构中含有c-o-c和c-o-h。子实体多糖组分(ps-i)和发酵液多糖组分(pfb-i)在1250cm^-1的吸收峰说明其可能含有硫酸酯基团。子实体多糖组分i(ps-i)、发酵液多糖组分i(pfb-i)和菌丝体多糖组分i(pm-i)分别在1086cm^-1、1128cm^-1和1148cm^-1处的特征吸收峰是葡萄糖残基中c-4位置上c-o的特征吸收峰信号，且该特征吸收峰的差异可能与3种多糖组分中糖链上环振动的角度或方向不同而导致的。

实验结果表明，柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖组分i(ps-i)、发酵液多糖组分i(pfb-i)和菌丝体多糖组分i(pm-i)结构有所差异，且它们结构中糖链的基团也有所差异。

实施例8：检测实施例5制得的子实体多糖组分i(ps-i)、发酵液多糖组分i(pfb-i)和菌丝体多糖组分i(pm-i)的核磁共振图谱

1)、多糖组分样品处理

将适量的柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖组分i(ps-i)、发酵液多糖组分i(pfb-i)和菌丝体多糖组分i(pm-i)冻干粉分别与p2o5混合放置4天，之后将50mg多糖样品与1mld2o进行交换3次，再进行¹h和¹³cnmr分析。

2)、多糖组分核磁共振图谱

柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖组分i(ps-i)、发酵液多糖组分i(pfb-i)和菌丝体多糖组分i(pm-i)的核磁共振图谱见附图5。

a、子实体多糖组分(ps-i):子实体多糖组分(ps-i)的¹hnmr图谱中5.07ppm处的信号峰说明其中含有糖苷键的异头质子，3.0-4.0ppm处的信号峰与糖链中ch2-o和ch-o有关，而3.2-4.1ppm信号峰表明其中含有从h-2到h-6质子。子实体多糖组分(ps-i)的¹hnmr图谱在5.4ppm没有吸收峰，表明其含有吡喃葡萄糖结构。在子实体多糖组分(ps-i)的¹³cnmr图谱中179.75-184.27ppm信号峰表明其含有糖醛酸，65.69ppm处的信号峰与c-6有关，表明其含有α-1-葡萄糖苷键和α-1,6-葡萄糖苷键。78.00-70.16ppm信号峰表明其中含有c-2,c-3和c-4,说明可能含有α-1,3-葡萄糖苷键。95.84ppm信号峰与α-异头碳相关，78.57ppm信号峰与c-4相关，而65.84ppm信号峰与(1→4)-α-d-吡喃葡萄糖基残基中的c-5有关。

结合子实体多糖组分(ps-i)的ftir图谱和nmr图谱结果，推测子实体多糖组分(ps-i)可能含有α-d-呋喃甘露糖和果糖，其碳链骨架由(1→4)-α-d-糖苷键连接；子实体多糖组分(ps-i)中含有饱和羧酸，可能是糖醛酸。同时该多糖组分中含有硫酸基团。

b、发酵液多糖组分(pfb-i)：在发酵液多糖组分(pfb-i)的¹hnmr图谱中，4.49ppm-5.29ppm(尤其是在5.07ppm)吸收峰表明其中含有糖苷键的异头质子，4.80-5.07ppm处的异头质子吸收峰说明该多糖组分是由呋喃糖的α-链接方式组成。¹hnmr图谱中3.10-3.07ppm吸收峰表明其含有-ch2-sor基团，3.22to3.75ppm吸收峰与h-2到h-5质子有关；5.4ppm处没有吸收峰说明发酵液多糖组分(pfb-i)中含有呋喃葡萄糖。从发酵液多糖组分(pfb-i)的¹³cnmr图谱中显示其在92.41-100.64ppm有信号峰，说明发酵液多糖组分(pfb-i)中糖链主链是α结构。98.47ppm信号峰与(1→3,6)-α-d-呋喃乳糖有关，¹³cnmr图谱中71.76-78.58ppm信号峰是c-2，c-3和c-4的信号峰，说明其存在α-1,3-葡萄糖苷键。同时65.08ppm处的信号峰与α-1-葡萄糖苷键和α-1,6葡萄糖苷键有关。

结合发酵液多糖组分(pfb-i)的ftir图谱和nmr图谱结果，推测发酵液多糖组分(pfb-i)碳链骨架由(1→6)或者(1→4)-糖苷键连接，其中可能含有6-8个糖单元构成的α-d-呋喃同时该多糖组分中含有硫酸基团。

c、菌丝体多糖组分(pm-i)：菌丝体多糖组分(pm-i)的¹hnmr和¹³cnmr图谱表明，¹hnmr图谱中从4.55ppm到5.14ppm的化学位移表明含有与糖苷键相关的异头质子，而在4.86-5.15ppm中的异头质子化学位移与吡喃糖单元中的α-结构相关。¹hnmr中3.41-4.55ppm中的化学位移表明含有c-2至c-6的质子，同时，3.15-3.10ppm和2.30ppm化学位移表明其中含有-ch2-sor和-ch2-c(＝o)oh结构。当异头碳中的化学位移在100-106ppm之间时，表明糖苷键中的吡喃糖残基是β结构，当异头碳中的化学位移在93-100ppm之间时，表明糖苷键中的吡喃糖残基是α结构。菌丝体多糖组分(pm-i)的¹³cnmr图谱表明，其异头碳中的化学位移在93-103ppm之间，表明其糖苷键中的吡喃糖残基是α结构。在¹³cnmr图谱中，99.2ppm的化学位移表明含有3-o-乙酰(1→6)的葡萄糖残基；与非乙酰化的葡萄糖残基相比，此位移向前推移了1.42ppm。在100.71ppm处的异头碳信号与(1→4)-d-葡聚糖中的c-1键相关，此处信号证实了菌丝体多糖组分(pm-i)的吡喃糖残基是α结构。22.72-22.77ppm范围内和172.29ppm处的化学位移表明o-乙酰基团的甲基和c＝o结构。179.75-184.27ppm化学位移表明该多糖结构中含有糖醛酸。

结合菌丝体多糖组分(pm-i)的ftir和nmr图谱结果，可以推测菌丝体多糖组分(pm-i)中碳链骨架含有(1→4)-α-d-吡喃葡萄糖基，其分支结构中可能含有(1→6)-糖苷键，初步判断菌丝体多糖组分i中可能含有α-d-呋喃甘露糖和β-l-阿拉伯吡喃糖，化学键含有硫酸酯键和糖醛酸。

实施例9：本发明的柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖(ps)、发酵液多糖(pfb)和菌丝体多糖(pm)具有抗疲劳活性，能延长小鼠力竭游泳时间

1)、动物分组和喂养

将100只小鼠随机分为空白组(control)，红景天苷组(rhodiola)，子实体组(ps)，发酵液组(pfb)和菌丝体组(pm)，每组20只，雌雄各半。采用前述实施例2、3、4、5、6中初步提取分离并经过透析的多糖溶液，每天在灌胃前两个小时停止喂食，按照100mg/kg的剂量对5组实验小鼠分别进行灌胃35d，空白组以同等体积的生理盐水进行灌胃。

2)、模型小鼠的力竭游泳实验

在第35天灌胃结束后，60min后称量每只小鼠的体重，在水桶(高30cm，直径25cm)内放入一定量的水(20cm)，并保持水温在25℃，一桶一鼠。当小鼠头部露出水面超过10s，同时漂浮不动时视为体力耗竭，立即记录小鼠游泳时间。小鼠游泳实验结束后，立即用乙醚麻醉，采样，测定生化指标。

3)、全血的采集

采用摘眼球法收集全血，按照试剂盒说明书检测氰化高铁血红蛋白(hemoglobin，hb)含量。

4)、血清的采集

将收集的全血进行低温离心(4℃，8000rpm/10min)，上清液(即为血清)放入-20℃冰箱中保存，按照试剂盒说明书检测血清中乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，ldh)、尿素氮(bloodureanitrogen，bun)和乳酸(lacticacid，la)含量。

5)、肝脏的收集

待全血取出后，立即将小鼠肝脏取出，用低温生理盐水漂洗3次，滤纸吸干后称量每只小鼠肝脏重量，将小鼠肝脏组织放入-20℃冰箱中保存，按照试剂盒说明书检测肝糖原(hepaticglycogen，hg)含量。

6)、实验分析结果见附图6

a、子实体多糖(ps)、发酵液多糖(pfb)和菌丝体多糖(pm)能使小鼠力竭游泳时间均显著延长(p＜0.05)；3种多糖组中小鼠力竭游泳时间从大到小的排列顺序为：发酵液多糖＞菌丝体多糖＞菌丝体多糖，且3组之间具有显著差异性(p＜0.05)。菌丝体多糖组的小鼠力竭游泳时间最长，为89.97±4.38min，分别是空白组和红景天苷组小鼠力竭游泳时间的3.03倍和1.81倍。发酵液多糖组和子实体多糖组小鼠的力竭游泳时间分别是空白组的2.33倍和1.93倍。菌丝体多糖组的小鼠力竭游泳时间最长。

b、与空白对照组相比，3种多糖组的小鼠血清中hb含量均有所提高，其中菌丝体多糖组的小鼠血液中hb含量最高(517.48±101.69mg/ml)，显著大于空白对照(236.72±15.20mg/ml)和阳性对照组(345.12±15.28mg/ml)。子实体和发酵液多糖组的小鼠血液中hb含量无显著差异，分别为(355.32±49.53mg/ml)和(417.87±53.94mg/ml)(p＞0.05)；子实体多糖组的小鼠血液中hb含量显著高于空白对照组(p＜0.05)，但发酵液多糖组小鼠血液中hb含量与空白对照组和阳性对照组均无显著差异(p＞0.05)。

c、与空白对照组相比(16.28±0.04mmol/l)，子实体多糖组、发酵液多糖组、菌丝体多糖组和阳性对照组小鼠血清中bun含量均显著下降(p＜0.05)，且分别下降了65.78％、69.14％、72.79％和25.68％。3种多糖组小鼠血清中bun含量均无显著差异(p＞0.05)，但均显著高于与阳性对照组(p＜0.05)。

d、与空白对照组相比(24.32±2.65mmol/l)，3种多糖组和阳性对照组小鼠血清中la含量均显著下降(p＜0.05)，且分别下降了25.21％、34.29％、37.34％和37.95％；虽然3组多糖组与阳性对照组之间均无显著差异(p＞0.05)，但多糖组小鼠血清中la含量低于阳性对照组。同时与空白对照组相比，3种多糖组和阳性对照组小鼠血清中ldh活性均显著升高(p＜0.05)，且分别升高了34.47％、38.29％、43.72％和27.03％。虽然3组多糖组与阳性对照组之间均无显著差异(p＞0.05)，但阳性对照组小鼠血清中lda含量低于3种多糖实验组，且菌丝体多糖组小鼠血清中lda含量最高，为(14.30±0.69ku/l)。

实验结果表明，子实体多糖(ps)、发酵液多糖(pfb)和菌丝体多糖(pm)可以延长小鼠力竭游泳时间，提高小鼠血液中hb、hg、血清中ldh含量，同时降低小鼠血清中bun和la含量。由此可见，表明柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖(ps)、发酵液多糖(pfb)和菌丝体多糖(pm)具有明显的抗疲劳作用。

实施例10：本发明的柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖(ps)、发酵液多糖(pfb)和菌丝体多糖(pm)具有抗缺氧活性，能提高常压密闭容器中小鼠存活时间

1)、动物分组和喂养

将100只小鼠随机分为空白组(control)，红景天苷组(rhodiola)，子实体组(ps)，发酵液组(pfb)和菌丝体组(pm)，每组20只，雌雄各半。每天在灌胃前两个小时停止喂食，按照100mg/kg的剂量对5组实验小鼠分别进行灌胃35d，空白组以同等体积的生理盐水进行灌胃。

2)、常压密闭缺氧实验

在第35天灌胃结束后，60min后称量每只小鼠的体重。将每只小鼠分别置于含有10gnaoh的广口瓶(500ml)中，一瓶一鼠，开口用凡士林密封。记录小鼠存活时间，并迅速取出肝脏，用生理盐水洗净血液，称重后按照小鼠体重：生理盐水＝1:9加入生理盐水，进行离心(3500rpm/10min)，按照试剂盒说明书检测肝脏组织中过氧化氢酶(catalasecat)、丙二醛(malonaldehydemad)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutasesod)、谷胱甘肽还原酶(glutathioneperoxidasegsh-px)、总蛋白质(totalproteintp)和一氧化氮(nitricoxideno)含量。取缺氧死亡后小鼠的大脑，称湿重，记录重量；放置于37℃恒温烘箱中，24h后取出小鼠大脑，称干重，记录重量，并计算脑积水量。

3)、实验分析结果见附图7

a、实验结果证明，与空白组相比(37.82±2.33min)，红景天苷、子实体多糖(ps)、发酵液多糖(pfb)和菌丝体多糖(pm)能显著提高小鼠在密闭容器缺氧条件下的存活时间(p＜0.05)，分别提高了14.30％、21.37％、25.14％和53.78％。且菌丝体多糖组小鼠的存活时间最长(58.16±2.21min)，显著大于子实体多糖组和发酵液多糖组(p＜0.05)。

b、与空白对照组相比(66.79±0.82％)，子实体多糖(ps)、发酵液多糖(pfb)和菌丝体多糖(pm)组中缺氧死亡小鼠中的脑积水量均下降，分别下降了12.13％、12.01％和13.94％，且菌丝体多糖组中小鼠的脑积水量最小，但是其余2组多糖组与空白对照组和阳性对照组中小鼠脑积水量无显著差异(p＞0.05)。

c、与空白对照组相比(11.11±0.37u/ml)，子实体多糖组、发酵液多糖组、菌丝体多糖组和红景天苷阳性对照组小鼠肝脏组织中，gsh-px含量均显著提高(p＜0.05)，分别提高了72.64％、46.45％、40.08％和28.03％；且子实体多糖组小鼠肝脏中gsh-px含量最高(17.92±0.42u/ml)，但是发酵液多糖组和菌丝体多糖组的gsh-px含量无显著差异(p＞0.05)。

d、经过3种多糖和红景天苷喂养小鼠，小鼠肝脏中cat和sod水平均有所提高，菌丝体多糖组中cat和sod含量最高，分别为172.70±3.82u/mg、238.83±8.15u/ml；但3组多糖组小鼠肝脏中cat和sod水平均无显著差异(p＞0.05)。

e、与空白对照组相比(4.50±0.28nmol/mg)，3组多糖组和红景天苷组小鼠肝脏中mda含量均明显下降，分别下降了87.80％、84.04％、93.35％和81.15％。虽然菌丝体多糖组小鼠肝脏中mda含量最低，但与子实体多糖组、发酵液多糖组均无显著差异(p＞0.05)，且子实体多糖组、发酵液多糖组和红景天苷组小鼠肝脏中mda含量也差异不显著(p＞0.05)。

f、通过用子实体多糖组、发酵液多糖组、菌丝体多糖组和红景天苷喂养小鼠，小鼠缺氧死亡后肝脏中no含量与空白对照组相(6.13±0.19mol/μg)比均显著下降(p＜0.05)，分别下降了54.65％、85.90％、76.54％和24.63％，且菌丝体多糖组小鼠肝脏中no含量最低。

g、与空白对照组相比(4.89±0.098mg/ml)，3组多糖组和红景天苷组小鼠肝脏中tp含量均有所提高，分别提高了36.81％、52.96％、68.92％和9.82％，但只有菌丝体多糖组有显著地提高(8.26±1.46mg/ml)(p＜0.05)，且子实体多糖组、发酵液多糖组和红景天苷组小鼠肝脏中tp含量无显著差异(p＞0.05)。

实验结果表明，子实体多糖(ps)、发酵液多糖(pfb)和菌丝体多糖(pm)可以延长小鼠在密闭容器缺氧条件下的存活时间，提高小鼠肝脏中gsh-px、cat、sod和tp含量，同时降低小鼠肝脏中mda和no含量。由此可见，表明柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖(ps)、发酵液多糖(pfb)和菌丝体多糖(pm)具有缺氧作用。

实施例11：本发明的柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖(ps)、发酵液多糖(pfb)和菌丝体多糖(pm)对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞具有保护作用，能减少该细胞在缺氧环境下的凋亡

肺动脉平滑肌细胞株购自上海细胞生化所细胞库，采用含10％胎牛血清、1％青-链霉素(双抗)的dmem高糖培养基培养。

1)、细胞复苏：于液氮罐中取出冻存的肺动脉平滑肌细胞，在37℃水浴下水浴1min，使冻存液快速溶化，然后将细胞转移至50ml离心管中，加入10ml新鲜dmem高糖培养基培养。1500r/m离心5min(4℃)，弃去上清，加入dmem高糖培养基培养混匀，转移至培养瓶中，于37℃、5％co2饱和湿度细胞培养箱中培养，次日换培养液并观察细胞生长情况。

2)、细胞培养：肺动脉平滑肌细胞用含10％胎牛血清、1％青-链霉素(双抗)的dmem高糖培养基培养。将肺动脉平滑肌细胞置于dmem高糖培养液中，37℃、5％co2饱和湿度细胞培养箱中培养，隔天换液。对数生长期汇合度大于80％可以传代，5mlpbs清洗2次，0.25％胰蛋白酶消化细胞1-2min，至细胞脱离瓶壁，转移至离心管中，无菌针头吹至单细胞，以1:3比例传代培养。取第4-10代细胞用于实验。

3)、细胞缺氧损伤模型建立

当细胞生长满培养瓶70％-80％时，将细胞分别置于37℃、95％n2、5％co2、氧气含量分别为2％、4％、6％、8％的条件下培养12h、24h、48h，cck-8法检测细胞在不同氧气浓度下和不同培养时间下的细胞活力。

4)、3种多糖组分对缺氧损伤细胞的保护作用

实验分组：每株细胞分成8组。正常空白组、正常子实体多糖组、正常发酵液多糖组、正常菌丝体多糖组；缺氧空白组、缺氧子实体多糖组、缺氧发酵液多糖组、缺氧菌丝体多糖组。

细胞处理：当细胞生长满培养瓶70％-80％时，采用血球计数板计数。在96孔板每孔加入3000个细胞。将250μg/ml的多糖溶液或者对照品添加到细胞培养液中，终体积为200μl，并于适宜的缺氧条件下、37℃、5％co2、饱和湿度条件下培养24h，培养结束后再用cck-8法检测细胞活力，设计3次重复实验。检测前在每孔加入20μlcck-8溶液，37℃、5％、co2细胞培养箱内继续孵育2小时。酶标仪提前预热，测定od450吸光值。

5)、流式细胞仪分析细胞周期：收集细胞，pbs重悬细胞并计数。取1×10⁶细胞，1000r/min离心5min后，弃上清，加入500μlannexinv-fitc结合液轻轻重悬细胞。再加入5μlannexinv-fitc，轻轻混匀。室温避光孵育10min后1000r/min离心5分钟，弃上清，加入500μlannexinv-fitc结合液轻轻重悬细胞。再加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置，使用流式细胞仪检测细胞周期情况。

6)、实验结果与分析见附图8

a)、细胞缺氧损伤模型建立肺动脉平滑肌细胞在氧气含量为8％时培养24h后，od450值最高0.708±0.05，随着培养时间延长，od450值明显降低；在氧气浓度为4％时培养12h后，od值最高0.781±0.04，且随着培养时间延长，od450值明显降低；在氧气浓度为2％时，随着培养时间延长，od450值呈明显降低趋势，当培养时间为48h，od450值仅为0.239±0.03。如果等肺动脉平滑肌细胞出现损伤时再进行加样处理，可以将细胞在氧气含量为2％的条件下培养24h建立肺动脉平滑肌细胞缺氧损伤模型，此时od450值为0.448±0.05，是培养时间为0h的75.76％。

b)、3种多糖组分对缺氧损伤细胞的保护作用

当常氧条件下和缺氧条件下的肺动脉平滑肌细胞用子实体多糖、发酵液多糖和菌丝体多糖处理后，与各自的空白对照组相比，od450值都明显提高。缺氧条件会造成肺动脉平滑肌细胞的od450值下降，但用含有用子实体多糖、发酵液多糖和菌丝体多糖溶液的培养基在缺氧条件下培养细胞时，缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞od450值分别显著提高到0.634、0.782和0.918(p＜0.05)，与缺氧空白组相比，细胞的od450值分别显著提高了60.59％、98.06％和132.40％(p＜0.05)，表明多糖能提高肺动脉平滑肌细胞在缺氧条件下的细胞活力，且3种多糖对肺动脉平滑肌细胞缺氧损伤保护作用从大到小的排列顺序为：菌丝体多糖组分＞发酵液多糖组分＞子实体多糖组分。在常氧条件下用3种多糖组分处理细胞，与常氧空白组相比，细胞的od450值也分别显著提高了66.50％、89.86％和122.76％(p＜0.05)。

c)、流式细胞仪分析细胞周期

在常氧条件下当肺动脉平滑肌细胞用子实体多糖、发酵液多糖和菌丝体多糖处理后，其凋亡率下降，与空白组相(4.33％)比分别下降了38.52％、33.95％和48.75％。缺氧条件会造成肺动脉平滑肌细胞的凋亡率明显提高，但是经过多糖处理后，细胞凋亡率都有所下降，与空白组相(20.49％)比分别极显著下降了25.04％、36.39％和49.65％(p＜0.01)，表明多糖减少肺动脉平滑肌细胞在缺氧条件下的凋亡率，且3种多糖对肺动脉平滑肌细胞缺氧损伤保护作用从大到小的排列顺序为：菌丝体多糖组分＞发酵液多糖组分＞子实体多糖组分。

实施例12：本发明的柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体多糖组分pm-i对缺氧损伤的pc12细胞具有保护作用，能减少该细胞在缺氧环境下的凋亡

pc12细胞株购自上海细胞生化所细胞库，采用含10％马血清、5％胎牛血清、1％青-链霉素(双抗)的dmem高糖培养基培养。

1)、细胞复苏：于液氮罐中取出冻存的pc12细胞，在37℃水浴下水浴1min，使冻存液快速溶化，然后将细胞转移至50ml离心管中，加入10ml新鲜dmem高糖培养基培养。1500r/m离心5min(4℃)，弃去上清，加入dmem高糖培养基培养混匀，转移至培养瓶中，于37℃、5％co2饱和湿度细胞培养箱中培养，次日换培养液并观察细胞生长情况。

2)、细胞培养：pc12细胞用含10％马血清、5％胎牛血清、1％青-链霉素(双抗)的dmem高糖培养基培养。将pc12细胞置于dmem高糖培养液中，37℃、5％co2饱和湿度细胞培养箱中培养，隔天换液。对数生长期汇合度大于80％可以传代，5mlpbs清洗2次，0.25％胰蛋白酶消化细胞1-2min，至细胞脱离瓶壁，转移至离心管中，无菌针头吹至单细胞，以1:3比例传代培养。取第4-10代细胞用于实验。

3)、细胞缺氧损伤模型建立

当细胞生长满培养瓶70％-80％时，将细胞分别置于37℃、95％n2、5％co2、氧气含量分别为2％、4％、6％、8％的条件下培养12h、24h、48h，cck-8法检测细胞在不同氧气浓度下和不同培养时间下的细胞活力。

4)、菌丝体多糖组分pm-i对缺氧损伤细胞的保护作用

实验分组：每株细胞分成8组。正常空白组、正常红景天苷组、正常苯丙胺组、正常菌丝体多糖pm-i组；缺氧空白组、缺氧红景天苷组、缺氧苯丙胺组、缺氧菌丝体多糖pm-i组。

细胞处理：当细胞生长满培养瓶70％-80％时，采用血球计数板计数。在96孔板每孔加入3000个细胞。将250μg/ml的菌丝体多糖pmab-i溶液或者对照品添加到细胞培养液中，终体积为200μl，并于适宜的缺氧条件下、37℃、5％co2、饱和湿度条件下培养24h，培养结束后再用cck-8法检测细胞活力，设计3次重复实验。检测前在每孔加入20μlcck-8溶液，37℃、5％、co2细胞培养箱内继续孵育2小时。酶标仪提前预热，测定od450吸光值。

5)、流式细胞仪分析细胞周期：收集细胞，pbs重悬细胞并计数。取1×10⁶万细胞，1000r/min离心5min后，弃上清，加入500μlannexinv-fitc结合液轻轻重悬细胞。再加入5μlannexinv-fitc，轻轻混匀。室温避光孵育10min后1000r/min离心5分钟，弃上清，加入500μlannexinv-fitc结合液轻轻重悬细胞。再加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置，使用流式细胞仪检测细胞周期情况。

6)、实验结果与分析见附图9

a)、细胞缺氧损伤模型建立：pc12细胞在氧气含量为2％、4％、8％条件下培养时，随着培养时间的延长和氧气浓度降低，od450值明显降低；当培养时间为48h，pc12细胞在氧气含量为2％、4％、8％条件下的od450值分别为0.092、0.198和0.404。如果等pc12细胞出现损伤时再进行加样处理，可以将细胞在氧气含量为4％的条件下培养24h建立pc12细胞缺氧损伤模型。此时细胞od450值为0.326，是培养时间为0h的61.39％。

b)、菌丝体多糖组分pm-i对缺氧损伤细胞的保护作用

当常氧条件下和缺氧条件下的pc12细胞用菌丝体多糖组分pm-i、红景天苷处理后，与各自的空白对照组相比，od450值都有所提高。缺氧条件会造成pc12细胞的od450值下降，但用含有菌丝体多糖组分pm-i、红景天苷的培养基在缺氧条件下培养细胞时，缺氧损伤的pc12细胞od450值分别极显著提高到0.547、0.486(p＜0.01)，与缺氧空白组相比，细胞的od450值分别显著提高了73.50％倍和43.00％倍(p＜0.05)，表明菌丝体多糖组分pm-i和阳性对照红景天苷均能提高pc12细胞在缺氧条件下的细胞活力，且菌丝体多糖组分pm-i对pc12细胞缺氧损伤保护作用比红景天苷更强。而苯丙胺能会降低pc12细胞在常氧和缺氧条件下的活力。在常氧条件下用菌丝体多糖组分pm-i处理细胞，与常氧空白组相比，pc12细胞的od450值也极显著提高了24.10％倍(p＜0.01)。

c)、流式细胞仪分析细胞周期

在常氧条进下当pc12细胞用菌丝体多糖组分pm-i和红景天苷处理后，其凋亡率均下降，与空白组相比分别下降了32.23％、55.62％。缺氧条件会造成pc12细胞的凋亡率明显提高，但是经过菌丝体多糖组分pm-i处理和红景天苷后，细胞凋亡率有所下降，与空白组(25.45％)相比极显著下降了57.01％、37.27％(p＜0.01)，表明菌丝体多糖组分pm-i和红景天苷能减少pc12细胞在缺氧条件下的凋亡率，且菌丝体多糖组分pm-i对pc12细胞缺氧损伤保护作用比阳性对照品红景天苷更强。

实施例13：本发明的柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体多糖(pm-i)通过提高肺动脉平滑肌细胞中kv1.5的表达量、降低kir6.2的表达量从而保护缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞

1)、细胞分组：常氧空白组、常氧阳性对照红景天苷组、常氧阴性对照苯丙胺组、常氧菌丝体多糖pm-i组、缺氧空白组、缺氧阳性对照红景天苷组、缺氧阴性对照苯丙胺组、缺氧菌丝体多糖pm-i组，总共8组。

2)、细胞培养在6孔板每孔加入1×10⁵个细胞。分别将250μg/ml的多糖pm-i溶液或者对照品添加到细胞培养液中，并于适宜的缺氧条件下、37℃、5％co2、饱和湿度条件下培养24h，培养结束后进行采用western-blot法检测肺动脉平滑肌细胞中kv1.5和kir6.2的相对表达量。

3)、蛋白质抽提

(1)取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入pmsf，使pmsf的最终浓度为1mm。

(2)弃去6孔板中的培养基。

(3)每孔轻柔的加入2毫升pbs清洗下6孔板中残留的培养基，弃去上清。注意：尽量把pbs弃干净，防止降低裂解效果和稀释蛋白浓度。

(4)每孔加入200ul的裂解液，前后左右晃下，使裂解液充分的覆盖6孔板。4℃，静置10min。

(5)用细胞刮刀或者枪头把细胞刮下，收到1.5ml的ep管中。

(6)12000rpm离心15min，取上清。

4)、蛋白质浓度测定

(1)根据样品数量，按50体积bca试剂a加1体积bca试剂b(50:1)配制适量bca工作液，充分混匀。

(2)加适当体积样品到96孔板中，用裂解液补足至20μl。

(3)各孔加入bca工作液200ul，37℃放置30分钟。

(4)测定562nm下的吸光值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

5)、sds-page电泳

(1)准备样品液：样品与5倍体积的上样缓冲液按照4:1混合，煮沸10分钟。

(2)将准备好的样品和蛋白质marker，分别上样。

(3)电泳：使用biorad电泳装置，样品首先在80v恒定电压下电泳至染料接近分离胶顶端。然后120v恒定电压电泳至溴酚蓝刚出胶底部。

6)、蛋白质转移

(1)取出凝胶，去除所有浓缩胶。将凝胶浸入转移缓冲液中1分钟。

(2)准备膜：预先将nc膜先浸入转移缓冲液中平衡1分钟。

(3)按照泡沫、滤纸、凝胶、转印膜、滤纸、泡沫的顺序组装转移夹层。

(4)将转移夹放入转移槽中，确保转移夹的凝胶侧面向阴极(-)而膜侧面向阳极(+)，向转移槽中加入适量缓冲液，确保将转移夹完全浸没。

(5)转膜装置置于冰水中，打开电源350ma转印2小时。

(6)转移完成后，从槽中取出转移夹，用镊子小心打开转移叠层，在tbst中漂洗膜。

7)、蛋白质显像

(1)将膜置于反应盒中(印迹蛋白的一面朝上)

(2)加0.5ml丽春红染色30秒，观察转印效果。

(3)去除染液，tbst洗膜三次，每次5分钟。

8)、免疫检测

(1)封闭：新鲜配制封闭液：在tbst中加入脱脂奶粉至终浓度为5％(w/v)，封闭时，将膜浸入到封闭液中，室温孵育1h。

(2)加入稀释好的一抗抗体，4℃过夜。

(3)tbst洗膜3次(每次5分钟)。

(4)加入稀释好的二抗抗体(1:5000)，室温孵育1小时。

(5)tbst洗膜3次(每次5分钟)。

9)、化学发光检测

(1)洗好膜以后，取出ecl发光试剂，取a液和b液各1ml混合。

(2)将膜放入曝光仪器中，滴加发光液，曝光三次，每次5min，选择三次曝光的重叠值。

10)、实验结果与分析见附图10

大量研究表明，细胞中kv1.5和kir6.2与细胞凋亡有关。为了研究肺动脉平滑肌细胞在缺氧条件下细胞凋亡机制，采用westernblot分析了与钾通道相关的两个非常重要的蛋白质细胞中kv1.5、kir6.2的变化情况。从图14中可以看出，在缺氧条件下，肺动脉平滑肌细胞中kv1.5的相对表达量下降，但通过菌丝体多糖处理肺动脉平滑肌细胞，常氧条件下和缺氧条件下细胞中kv1.5的相对表达量分别显著增大了(0.83±0.04)和(0.64±0.03)(p＜0.01)。但是在常氧和缺氧条件下，菌丝体多糖和红景天苷都能使肺动脉平滑肌细胞中kv1.5的相对表达量增大，但两者无显著性差异(p＞0.05)。在常氧和缺氧条件下，经过菌丝体多糖处理肺动脉平滑肌细胞后，细胞中kir6.2的相对表达量均显著下降，分别下降到(0.28±0.02)(p＜0.05)和(0.56±0.03)(p＜0.01)。与空白组相比，在常氧和缺氧条件下红景天苷能增加肺动脉平滑肌细胞中kir6.2的相对表达量，但均无显著差异(p＞0.05)；而苯丙胺能促进肺动脉平滑肌细胞中kir6.2的相对表达量增加。

通过western-blot法检测常氧和缺氧条件下肺动脉平滑肌细胞中kv1.5和kir6.2的相对表达量，发现本发明的柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12子实体多糖、发酵液多糖、菌丝体多糖通过提高肺动脉平滑肌细胞中kv1.5的表达量、降低kir6.2的表达量从而保护缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞。

实施例14：柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体多糖pm-i通过提高肺动脉平滑肌细胞中5-羟色胺(5-ht)和多巴胺(da)含量、降低乳酸脱氢酶(ldh)、还原型辅酶ⅱ(ndaph)、内皮素(et)和乙酰胆碱(ach)含量从而保护缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞

1)、细胞分组：常氧空白组、常氧红景天苷组、常氧苯丙胺组、常氧菌丝体多糖pm-i组、缺氧空白组、缺氧红景天苷组、缺氧苯丙胺组、缺氧菌丝体多糖pm-i组，总共8组。

2)、细胞培养

在6孔板每孔加入1×10⁵个细胞。分别将250μg/ml的菌丝体多糖pm-i溶液或者对照品添加到细胞培养液中，并于适宜的缺氧条件下、37℃、5％co2、饱和湿度条件下培养24h，培养结束后进行采用elisa法检测肺动脉平滑肌细胞中5-羟色胺(5-ht)和多巴胺(da)含量、降低乳酸脱氢酶(ldh)、还原型辅酶ⅱ(ndaph)、内皮素(et)和乙酰胆碱(ach)蛋白含量。

3)、elisa蛋白检测

(1)用标准品稀释液分别把样品稀释到试剂盒说明书上的浓度。

(2)空白孔只加显色剂和终止液，其余各步骤操作相同。

(3)标准孔加标准品50μl，链霉素-hrp50μl

(4)待测样品孔加样本40μl，然后各加抗-hcy抗体10μl、链霉素-hrp50μl，密封，37℃下孵育60min。

(5)洗涤5次，拍干。

(6)各孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，37度避光显色10min。

(7)每孔加入终止液50μl，终止反应。

(8)450nm下检测吸光值。

4)、实验结果与分析见附表2

表2

*:表示缺氧条件下的分组，control、rhodiola、amfetamine分别为空白组、阳性对照红景天苷组、阴性对照苯丙胺组；

从附表2中可以看出，与常氧组相比，缺氧组中肺动脉平滑肌细胞中的5-ht含量极显著降低(p＜0.01)；当肺动脉平滑肌细胞用菌丝体多糖处理后，与空白组相比，在常氧和缺氧条件下细胞5-ht含量分别增加了25.62％和83.92％；红景天苷也能提高肺动脉平滑肌细胞中5-ht含量，但效果不如菌丝体多糖显著。而在常氧条件下空白组、红景天苷组和菌丝体多糖组中肺动脉平滑肌细胞中的da含量无显著差异(p＞0.05)；但在缺氧条件下与空白组和对阳性照组相比，用菌丝体多糖处理肺动脉平滑肌细胞后，细胞中da含量显著升高(119.74±14.03pg/ml)(p＜0.05)。与红景天苷组相比时，在常氧条件下菌丝体多糖组细胞中ldh含量稍微更高一些；但在缺氧条件下菌丝体多糖组中细胞中ldh含量相对更低一些，且两者之前差异不显著(p＞0.05)。在缺氧条件下肺动脉平滑肌细胞中nadph和et水平都有所提高，但是通过用菌丝体多糖处理细胞后，细胞中nadph和et水平都极显著升高(7.76±1.04ng/mlofnadph和71.37±11.21ofet)(p＜0.01)。在常氧条件和缺氧条件下菌丝体多糖细胞中nadph和et水平含量比红景天苷组更低，但两者无显著差异(p＞0.05)。同时，在缺氧条件下，肺动脉平滑肌细胞中ach含量极显著下降l(p＜0.01)，在常氧、缺氧条件下，菌丝体多糖组细胞中ach含量分别是红景天苷组的1.09倍和2.68倍。

通过采用elisa法检测常氧和缺氧条件下肺动脉平滑肌细胞中5-羟色胺(5-ht)、多巴胺(da)含量、降低乳酸脱氢酶(ldh)、还原型辅酶ⅱ(ndaph)、内皮素(et)和乙酰胆碱(ach)的含量，发现本发明的柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体多糖pm-i组分通过提高肺动脉平滑肌细胞中提高肺动脉平滑肌细胞中5-羟色胺(5-ht)和多巴胺(da)含量、降低乳酸脱氢酶(ldh)、还原型辅酶ⅱ(ndaph)、内皮素(et)和乙酰胆碱(ach)含量从而保护缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞。

实施例15：柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体多糖pm-i对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞的保护作用与[ca²⁺]i通道有关

1)、fluo-4am储存液配制：将fluo-4am溶于dmso，配成终浓度为2mmol/l的储存液，分装，-70℃保存。

2)、细胞分组：低氧组、低氧红景天苷组、低氧菌丝体多糖pm-i组

3)、细胞染色：以5*10⁵个细胞种植于有爬片的24孔培养板中，将250μg/ml的菌丝体多糖pm-i或者对照品添加到细胞培养液中，终体积为200μl，并于适宜的缺氧条件下37℃、5％co2、饱和湿度条件下培养24h。再加入fluo-4am至终浓度为10umol/l，置于5％co2、37℃避光，孵育60min。再用pbs清洗3次，荧光显微镜拍照。

4)、实验结果与分析见附图11

在氧气浓度为2％的缺氧条件下，分别用20μl的菌丝体多糖组分pmab-i(250μg/ml)和红景天苷(100μm)处理肺动脉平滑肌细胞72h，之后用fluo-3/am染料分析细胞的荧光灰度值。细胞灰度结果分析表示，在缺氧条件下用菌丝体多糖和红景天苷处理肺动脉平滑肌细胞72h后，可以显著降低细胞内[ca²⁺]i的荧光值(p＜0.01)，但是菌丝体多糖组分比红景天苷效果更好，能促进更多的[ca²⁺]i外流。该实验结果与前面结果一致，说明用菌丝体多糖处理缺氧条件下的肺动脉平滑肌细胞能抑制缺氧环境诱导的细胞凋亡现象，说明菌丝体多糖可能通过促进细胞内[ca²⁺]i外流从而减少细胞内[ca²⁺]i浓度来抑制缺氧诱导的细胞凋亡现象。

通过荧光染色法检测缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞内[ca²⁺]i变化，实验结果表明菌丝体多糖pm-i能抑制缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞中[ca²⁺]i外流而减少缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞的凋亡。发现本发明的柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体多糖pm-i对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞的保护作用与[ca²⁺]i通道有关。

实施例16：柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体多糖pm-i对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞的保护作用与k离子通道有关。

1)、实验试剂及溶液配制

钾电流记录细胞外液(mmol/l)：nacl110，kcl5，bacl25，mgcl22，clucose10，tea25，hepes10，ttx0.001，cdcl20.0002，ph值用naoh调至7.4。钾电流记录细胞内液(mmol/l)：kcl135，nacl8，cacl20.1，hepes10，egta1，mg·atp2，na3·gtp0.3，ph值用koh调至7.2-7.4，渗透压为280-290mosm，用直径0.22μm一次性滤菌器过滤后分装，置-70℃低温冰箱保存备用。

2)、细胞分组：低氧组、低氧红景天苷组、低氧菌丝体多糖pm-i组

3)、电生理记录方法

将消化后贴壁后0.5-1h的细胞玻片放置于已加入细胞外液的记录槽中，通过倒置显微镜将细胞成像于监视器屏幕上进行实时观察。记录电极选用外径1.5mm，内径0.89mm，长度为10mm的玻璃毛细管，在水平拉制仪上拉制而成。对于全细胞膜片钳的实验，电极尖端直径一般为2μm左右，阻抗为5mω左右。

高倍镜下选取表面光滑，折光性较好的细胞后，移动充有电极内液的记录电极接近细胞，待电极靠近细胞时，并可见电极阻抗升高，顺势给一个负压，同时将钳制电压调节到-70mv就很容易形成高阻封接。封接稳定形成后，撤去负压，补偿电极电容，然后给予机械负压使电极尖端的细胞膜吸破，从而形成全细胞记录模式。所有电生理实验均在室温(20-25℃)下进行，epc-10膜片钳放大器记录，实验参数设置、数据采集和刺激方案施加均通过软件patchmaster2.52来控制。

4)、钾电流记录方案

使用上述钾电流记录外液和内液记录钾电流，给予200ms的-70mv到+50mv以10mv为步阶刺激后诱发出一个外向电流。每组分别记录到8个以上可用的数据，对原始电流进行电流密度计算后，绘制i-v曲线，并得到每个细胞的最大电流密度值进行多组组间电流大小的比较。每组细胞的i-v曲线见附图。

5)、实验结果与分析见附图12

通过记录肺动脉平滑肌细胞中实时钾电流变化情况来分析菌丝体多糖对细胞在缺氧环境下的调节作用机制。由图12可知，当在-70mv到+50mv范围内给予肺动脉平滑肌细胞从0mv到不同的电压刺激时，可以观察到细胞一系列的ik(ca)变化。经过或未经过菌丝体多糖处理的肺动脉平滑肌细胞中平均i-v变化曲线，并检测肺动脉平滑肌细胞中ik(ca)在缺氧条件下用30μm的菌丝体多糖组分处理细胞2min内的变化(图12)。当电压为+50mv时，用30μm的菌丝体多糖组分处理缺氧条件下的肺动脉平滑肌细胞时，ik(ca)从75±8(对照组，n＝10)显著增大到154±18pa(n＝11，p<0.05)；而当电压为+60mv时，用30μm的红景天苷处理缺氧条件下的肺动脉平滑肌细胞时，ik(ca)只增大到85±11pa(n＝8)，明显低于菌丝体多糖组。

同时，通过分析空白组、对照组、实验组中最大k电流变化(图12)，结果表明当缺氧条件下肺动脉平滑肌细胞用菌丝体多糖处理后，细胞中最大钾电流显著高于空白组和阳性对照组。

通过外在钾电流记录外液和内液记录缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞内的钾电流变化，实验结果表明柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体多糖pm-i能增大缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞中最大钾电流而减少缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞的凋亡。发现本发明的柴达木双层环伞菌亚种zju-cdma-12菌丝体多糖组分pm-i对缺氧损伤的肺动脉平滑肌细胞的保护作用与k离子通道有关。