本发明涉及在藤黄轮丝链霉菌中合成咔唑霉素b的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
咔唑霉素是具有抗真菌、细菌及酵母菌的广谱抗生素，共有8种同系化合物，分别为a、b、c、d、e、f、g、h，同时咔唑霉素b亦是5-脂肪氧合酶的活性抑制剂，具有抗氧化活性。在医药、植物生防领域具有重要用途，因此具有庞大的市场需求和广阔的市场前景。
咔唑霉素b首次在streptoverticilliumehimenseh1051-my10培养液中分离得到并鉴定化学结构，此后鲜有其他种属微生物合成咔唑霉素b的报道。咔唑霉素b的化学全合成过程复杂，步骤多，收率低，无法满足工业化生产。生物发酵咔唑霉素b具有稳定、安全、无污染的优点，是最有前景的生产方法。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题在于提供一种微生物发酵法制备咔唑霉素b的方法，所述方法利用藤黄轮丝链霉菌发酵生产咔唑霉素b，菌体生长快，发酵周期短，生产成本低。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种微生物发酵法制备咔唑霉素b的方法，所述的咔唑霉素b生产菌为藤黄轮丝链霉菌菌株hy61(streptomycesluteoverticillatus)；具体包括以下步骤：
(1)菌株活化：挑取藤黄轮丝链霉菌株hy61菌种划线接种至固体斜面培养基，于恒温培养箱22～30℃培养5～7d，待斜面长出大量孢子用于转接液体种子；
(2)液体种子制备：挑取步骤(1)的活化菌株接种于装有种子培养基的容器中，纱布封口，于22-30℃，150～220r/min摇床振荡培养30～72h，长出大量菌丝球或菌丝体，得液体种子；
(3)液体发酵：按体积比10～20％接种量向发酵培养基接入步骤(2)制备的液体种子，转速200～850r/min，溶氧控制45～50％，温度22～28℃，待初始葡萄糖耗尽后流加葡萄糖溶液并维持一定浓度，发酵24h后补入咔唑霉素合成的前体物质，发酵过程中流加酸碱调节剂维持ph6.5～7.5，通气培养48～72h；发酵结束后用正丁醇萃取发酵液中的咔唑霉素b，测定发酵效价。
所述的固体斜面培养基：可溶性淀粉20g/l，kno31g/l，mgso40.5g/l，nacl0.5g/l，kh2po40.5g/l，feso40.01g/l，琼脂20g/l，ph7.2～7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min；
所述的液体种子培养基：葡萄糖10g/l，酵母浸粉2g/l，蛋白胨5g/l，nacl5g/l，ph7.2～7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min；
所述的发酵培养基：葡萄糖20g/l，蛋白胨5g/l，酵母浸粉2g/l，kno30.4g/l，mgso44g/l，kh2po40.5g/l，cacl25mg/l，vb10.5mg/l,核黄素0.5mg/l，vh0.5mg/l，烟酸1mg/l，feso40.5mg/l，mnso40.5mg/l，ph7.2～7.4，121℃高压蒸汽灭菌20min。
进一步，所述的发酵过程中酸碱调节剂为25％氨水、20％naoh及10％的hcl中的一种。
进一步，所述的发酵过程中流加的葡萄糖液浓度为500g/l，流加方式为溶氧-stat或ph-stat方式。
进一步，所述的发酵过程中补加的咔唑霉素b合成的前体物质为l-色氨酸、丙酮酸或乙酸中的一种或多种组合。
采用本发明所述的发酵方法，整个发酵过程操作简单，发酵产物咔唑霉素b的含量高，通用性强，生产成本低。
本发明与现有技术相比的有益效果：
1、本发明采用补料分批发酵，降低葡萄糖初始浓度，缓解对藤黄轮丝链霉菌菌株株hy61菌体生长的抑制效应，有利于菌体快速生长，以ph-stat方式补加碳源，在产物合成期控制葡萄糖始终在低浓度，消除碳源的分解代谢物阻遏，促进咔唑霉素合成。
2、本发明在菌体充分生长后补加咔唑霉素b的合成前体物质，有效提高了咔唑霉素b的产量及合成效率。
具体实施方式
为阐明对本项发明特征的理解，下面结合一些非限定性的实施实例对本发明做进一步阐述。
藤黄轮丝链霉菌菌株株hy61，分离自烟台海域海底沉积物，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年12月13日，分类命名为藤黄轮丝链霉菌(streptomycesluteoverticillatus)，保藏编号为：cgmccno.15060。
实施例1：咔唑霉素b发酵
(1)菌株活化：挑取藤黄轮丝链霉菌菌株hy61菌种划线接种至固体斜面培养基，于恒温培养箱28℃培养5d，待斜面长出大量孢子用于转接液体种子；
(2)液体种子制备：挑取活化菌株接种于装有种子培养基的容器中，纱布封口，于28℃，200r/min摇床振荡培养40h，长出大量菌丝球或菌丝体，得液体种子；
(3)液体发酵：按体积比10％接种量向发酵培养基接入步骤(2)制备的液体种子，转速200r/min，溶氧控制45～50％，温度28℃，初始葡萄糖耗尽后采用溶氧-stat方式补入500g/l的葡萄糖溶液，维持发酵液中葡萄糖浓度约为0.9-1.2g/l，发酵24h后补入1g/l的前体物质丙酮酸，发酵过程中流加20％浓度的naoh维持ph7.0，通气培养60h；发酵结束后用正丁醇萃取咔唑霉素b，测定发酵效价为26mg/l。
实施例2咔唑霉素b发酵
(1)菌株活化：挑取藤黄轮丝链霉菌菌株hy61菌种划线接种至固体斜面培养基，于恒温培养箱26℃培养6d，待斜面长出大量孢子用于转接液体种子；
(2)液体种子制备：挑取活化菌株接种于装有种子培养基的容器中，纱布封口，于26℃，180r/min摇床振荡培养48h，长出大量菌丝球或菌丝体，得液体种子；
(3)液体发酵：按体积比15％接种量向发酵培养基接入步骤2制备的液体种子，转速550r/min，溶氧控制45～50％，温度26℃，初始葡萄糖耗尽后采用ph-stat方式补入500g/l的葡萄糖溶液，维持发酵液中葡萄糖浓度约为0.9-1.2g/l，发酵24h后补入2g/l的前体物质l-色氨酸，发酵过程中流加25％浓度的氨水维持ph7.0，通气培养60h；发酵结束后用正丁醇萃取咔唑霉素b，测定发酵效价为34mg/l。
实施例3咔唑霉素b发酵
(1)菌株活化：挑取藤黄轮丝链霉菌菌株hy61菌种划线接种至固体斜面培养基，于恒温培养箱24℃培养7d，待斜面长出大量孢子用于转接液体种子；
(2)液体种子制备：挑取活化菌株接种于装有种子培养基的容器中，纱布封口，于24℃，220r/min摇床振荡培养60h，长出大量菌丝球或菌丝体，得液体种子；
(3)液体发酵：按体积比16％接种量向发酵培养基接入步骤2制备的液体种子，转速850r/min，溶氧控制45～50％，温度22℃，初始葡萄糖耗尽后采用ph-stat方式补入500g/l的葡萄糖溶液，维持发酵液中葡萄糖浓度约为0.4-0.6g/l，发酵24h后补入1g/l的前体物质l-色氨酸及乙酸，发酵过程中流加25％浓度的氨水维持ph7.0，通气培养60h；发酵结束后用正丁醇萃取咔唑霉素b，测定发酵效价为43mg/l。