一种制备番茄红素的方法与流程

本发明涉及一种制备番茄红素的方法，尤其是一种使用三孢布拉氏霉菌制备番茄红素的方法。

背景技术：

番茄红素是一种脂溶性类胡萝卜素，具有高效猝灭单线态氧和清除自由基的作用，其抗氧化性在类胡萝卜素中最强，且对预防心血管疾病、增强机体免疫力以及延缓衰老等都具有一定的作用，是一种很有开发价值的功能性天然色素。

番茄红素原料的生产主要有植物提取法、化学合成法和微生物发酵法。植物提取法所需要的原料主要是番茄，番茄种植受气候、产地、运输等条件限制，且提取工艺繁琐冗长，成本昂贵，不能满足工业化生产的需求。化学合成法尽管成本较低，但其对环境影响比较大，且产品活性较低，因此应用范围受到极大限制。采用微生物发酵法生产番茄红素，其产品质量和生理活性和天然提取产品完全相同，且不受环境条件限制，具有产量高、成本低、安全性高、易于被人体吸收等优点。

目前，工业上利用三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素，主要是将三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌在种子培养阶段分开培养，之后将正菌和负菌的种子液以一定的比例混合后再接入发酵培养基中培养。如中国专利申请cn103276018和cn106047944a均是在发酵培养时，将三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的种子液以一定的比例混合后再接入发酵培养基中培养，但其发酵产量较低。现有提高三孢布拉氏霉菌产番茄红素产量的方法主要是增加溶氧和添加前体物质。增加溶氧通常采取的措施是通过增加鼓风或强制通氧，但是这种方法需要耗费大量的能源，增加成本，对工业化生产造成困难。也有在发酵液中添加氧载体正十二烷等，但会对菌体造成伤害。添加前体物质的报道也有很多，但是效果不是很理想，而且还会增加成本。本发明旨在提供一种简便易行，更有效的提高番茄红素的产量的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种制备番茄红素的方法。该方法简便易行，可有效提高番茄红素的产量。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

提供一种制备番茄红素的方法，将三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌分开培养得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液分别采用物理手段处理后混合发酵培养制备番茄红素；收集发酵后得到的菌体，从菌体中提取番茄红素。所述的物理手段处理主要是达到减少菌体中菌丝之间的缠绕、提高菌丝分散程度、改善菌丝分布的目的。

按上述方案，上述制备番茄红素的方法，包括以下具体步骤：

(1)取三孢布拉氏霉菌正、负菌分开进行斜面培养；

(2)将步骤(1)斜面培养的三孢布拉氏霉菌正、负菌分开进行种子培养，和根据需要进行种子放大培养；

(3)将步骤(2)得到的三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液采用物理手段进行处理后混合，最后进行发酵培养制备番茄红素；

(4)收集发酵后得到的菌体，从菌体中提取番茄红素。

按上述方案，所述的物理处理手段为剪切处理，剪切的转速为300-15000转/分钟，优选3000-8000转/分钟，剪切时间为1-30分钟，优选5-10分钟。

按上述方案，所述的剪切处理为：在装有在线剪切装置的缓冲罐中进行剪切，剪切处理时控制剪切体系温度为25-30℃，尤其控制在进行大于8000转/分钟的高速剪切时剪切过程中的剪切体系温度为25-30℃。

按上述方案，所述的物理处理手段为胶体磨处理。，所述的胶体磨处理是将菌浓为15％-30％的三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌种子液在无菌室进行无菌研磨，胶体磨的磨齿间隙0.01-1.5mm，优选0.1-1mm，研磨转速为1000-9000转/分钟，优选1500-4000转/分钟，研磨次数为1-10次，优选2-6次。通过胶体磨处理达到减少菌体中菌丝之间的缠绕和/或提高菌丝分散程度，改善菌丝分布程度的目的，提高接合效率，提高发酵产量的目的。

按上述方案，所述的物理处理手段为利用旋流混合器进行旋流混合气动处理，旋流混合器进气压力0.15-0.25mpa，气流量50-300nm³/min。旋流混合器利用压缩空气本身的静压能和动能转换，空气喷射产生对周边液体的抽吸带动作用，并转化为高速旋转的气液混合流。通过旋流混合器处理，在旋流混合气动处理的过程中，达到减少菌体中菌丝之间的缠绕和/或提高菌丝分散程度，改善菌丝分布，进而提高接合效率，提高发酵产量的目的。

按上述方案，所述三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液以三孢布拉氏霉菌正、负菌干菌体质量计，按质量比1:1-1:50优选为1:5-1:10混合后进行发酵培养(干菌体质量：分别取一定体积的正、负菌种子液，干燥处理后测得)。

本发明具有如下有益效果：

三孢布拉氏霉菌正、负菌混合培养生产番茄红素中，正、负菌的菌丝体相互接触、融合，不断生成接合孢子，进而合成番茄红素。正、负菌的接合程度对番茄红素的产量有直接影响，目前的工艺技术均是分别培养正负菌后直接进行混合发酵生产番茄红素，然而，三孢布拉氏霉菌正负菌为丝状真菌，浓度达到一定程度之后菌丝相互缠绕，正负菌混合后接触的概率显著降低，从而导致接合孢子的量减少，进而影响了番茄红素产量，目前行业内没有任何相关技术解决该问题。本发明改进后的工艺在将三孢布拉氏霉菌正负菌混合发酵前，通过物理手段处理，通过减少菌体中菌丝之间的缠绕，提高菌丝分散程度，改善菌丝分布程度，进而达到提高接合效率，提高发酵产量的目的。

具体而言，本发明在将三孢布拉氏霉菌正负菌混合发酵前，通过物理手段处理如优选地将三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液通过剪切、胶体磨、气动的方式处理，并通过各处理条件参数的控制优选，可很好地减少菌体中菌丝之间的缠绕、提高菌丝分散程度、改善菌丝分布程度，进而提高接合效率，且不影响菌体活性，由此达到提高发酵制备的番茄红素产量的目的。经实验验证，本发明工艺番茄红素的产量可至少提高20％以上，最高达到100％左右。充分说明了本发明工艺的创造性。

附图说明

图1为显微镜放大40倍，剪切前后的菌丝形态图。剪切前菌丝缠绕聚集，8000转/分钟剪切5分钟后，菌丝分散均一。

图2反应了不同物理手段对三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素生物量的影响。

具体实施方式

下述实施例中使用的所述三孢布拉氏霉菌正菌菌株：三孢布拉氏霉菌bt7251(+)，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：cctccm2014378；三孢布拉氏霉菌负菌菌株：三孢布拉氏霉菌bt7603(-)，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：cctccm2014379。

但本方法并不限于上述三孢布拉氏霉菌正菌菌株和三孢布拉氏霉菌负菌菌株，市售三孢布拉氏霉菌正菌菌株和三孢布拉氏霉菌负菌菌株均可。

实施例1

1)斜面培养：配制pda斜面培养基(葡萄糖20g/l，琼脂粉25g/l，去皮土豆200g/l；将土豆切成1cm方块加入去离子水煮沸30分钟，冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加入葡萄糖和琼脂粉)。取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液，分别涂布于pda斜面培养基上，于25℃恒温培养箱中培养5-7天；

2)种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌正、负菌株斜面上用接种铲铲取一铲的正菌、负菌，分别接种到含有150ml种子培养基的1000ml三角瓶中，于25℃，180转/分钟条件下培养48小时，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液。所述种子培养基为：葡萄糖10g/l，玉米淀粉30g/l，玉米浆干粉50g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.1g/l，ph7.0。

3)发酵瓶培养：将步骤2)中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液通过物理手段处理后，按照正、负菌菌体质量比为1:1混合均匀，以10％(体积比)接种量接入装有40ml发酵液的250ml三角瓶中，25℃，180rpm培养120小时。在发酵开始后36小时加入起始发酵液体积0.15％的烟碱。所述发酵培养基为：葡萄糖20g/l，玉米淀粉40g/l，酵母浸膏25g/l，黄豆饼粉40g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.1g/l，ph7.0。

4)收集发酵后得到的菌体，将菌体过滤清洗后烘干，得到干重。

5)准确称量0.02g干菌体，用乙酸乙酯萃取，用高效液相色谱法测定番茄红素含量。

上述步骤完成后，使用现有的常规工艺，例如使用溶剂提取菌体中的番茄红素，进一步脱溶、纯化、结晶后，即可制得番茄红素。

将本发明的制备方法与现有技术对比，结果如下：

现有技术(不使用物理手段处理种子液，直接将正、负菌混合后，进行发酵)：测得发酵液中番茄红素的产量为4.91g/l。

本实施例：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液8000转/分钟分别剪切5分钟后混合再进行发酵，测得发酵液中番茄红素的产量为9.47g/l，比现有技术提高了92.87％。

实施例2

1)斜面培养：配制pda斜面培养基(葡萄糖20g/l，琼脂粉25g/l，去皮土豆200g/l；将土豆切成1cm方块加入去离子水煮沸30分钟，冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加入葡萄糖和琼脂粉)。取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液，分别涂布于pda斜面培养基上，于25℃恒温培养箱中培养5-7天；

2)种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌正菌、负菌菌株斜面上用接种铲铲取一铲的正菌、负菌，分别接种到含有150ml种子培养基的1000ml三角瓶中，于25℃，180转/分钟条件下培养48小时，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液。所述种子培养基为：葡萄糖10g/l，玉米淀粉30g/l，玉米浆干粉50g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.1g/l，ph7.0。

3)发酵瓶培养：将步骤2)中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液(菌浓22％)和三孢布拉氏霉菌负菌种子液(菌浓23％)使用胶体磨研磨，研磨过程在无菌室进行，然后按照正、负菌菌体质量比为1:1混合均匀，以10％(体积比)接种量接入50l发酵罐中，培养过程工艺控制为：培养温度25℃，搅拌速度300转/分钟，通气量3vvm(l/l.min)，罐压0.1mpa培养时间120h，在发酵开始后36小时加入起始发酵液体积0.15％的烟碱。发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中葡萄糖浓度在10-20g/l。所述发酵培养基为：葡萄糖20g/l，玉米淀粉40g/l，酵母浸膏25g/l，黄豆饼粉40g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.1g/l，ph7.0。

4)收集发酵后得到的菌体，将菌体过滤清洗后烘干，得到干重。

5)准确称量0.02g干菌体，用乙酸乙酯萃取，用高效液相色谱法测定番茄红素含量。

上述步骤完成后，使用现有的常规工艺，例如使用溶剂提取菌体中的番茄红素，进一步脱溶、纯化、结晶后，即可制得番茄红素。

将本发明的制备方法与现有技术对比，结果如下：

现有技术(不使用物理手段处理种子液，直接将正、负菌混合后，进行发酵)：测得发酵液中番茄红素产量为4.77g/l。

本实施例方案一：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用胶体磨研磨，磨齿间隙0.01mm，2000转/分钟，循环研磨4次，将研磨后的三孢布拉氏霉菌正、负种子液再混合进行发酵，测得发酵液中番茄红素的产量为7.21g/l，比现有技术提高了51.15％。

本实施例方案二：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用胶体磨研磨，磨齿间隙0.5mm，1500转/分钟，循环研磨5次，将研磨后的三孢布拉氏霉菌正、负种子液再混合进行发酵，测得发酵液中番茄红素的产量为8.09g/l，比现有技术提高了69.60％。

本实施例方案三：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用胶体磨研磨，磨齿间隙1mm，3000转/分钟，循环研磨6次，将研磨后的三孢布拉氏霉菌正、负种子液再混合进行发酵，测得发酵液中番茄红素的产量为8.33g/l，比现有技术提高了74.63％。

本实施例方案四：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用胶体磨研磨，磨齿间隙1.5mm，4000转/分钟，循环研磨2次，将研磨后的三孢布拉氏霉菌正、负种子液再混合进行发酵，测得发酵液中番茄红素的产量为7.39g/l，比现有技术提高了54.93％。

对比方案：将种子液使用胶体磨研磨，磨齿间隙0.005mm，20000转/分钟，循环研磨10次，将研磨后的三孢布拉氏霉菌正、负种子液再混合进行发酵，测得发酵液中番茄红素的产量为4.32g/l，产量低于对照。胶体磨可快速高效分散菌丝，时间短，效率高，但容易研磨过度而将菌丝体研磨成碎片影响菌体活性，本发明优选的胶体磨处理条件可很好的达到减少菌体中菌丝之间的缠绕、提高菌丝分散程度、改善菌丝分布程度，进而提高接合效率，且不影响菌体活性的目的。

实施例3

1)斜面培养：配制pda斜面培养基(葡萄糖20g/l，琼脂粉25g/l，去皮土豆200g/l；将土豆切成1cm方块加入去离子水煮沸30分钟，冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加入葡萄糖和琼脂粉)。取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液，分别涂布于pda斜面培养基上，于25℃恒温培养箱中培养5-7天；

2)种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌正菌、负菌菌株斜面上用接种铲铲取一铲的正菌、负菌，分别接种到含有150ml种子培养基的1000ml三角瓶中，于25℃，180转/分钟条件下培养48小时，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液。所述种子培养基为：葡萄糖10g/l，玉米淀粉30g/l，玉米浆干粉50g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.1g/l，ph7.0。

3)种子扩大培养：将步骤2)中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液按照10％(体积比)接种量分别接种到扩大培养基中进行培养，所用种子罐容积为100l，培养过程工艺控制为：培养温度25℃，搅拌速度200转/分钟，通气量1vvm(l/l.分钟)，培养时间48h，所述扩大培养基为：葡萄糖10g/l，玉米淀粉30g/l，玉米浆干粉50g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.1g/l，ph7.0。

4)发酵罐培养：将步骤3)中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液通过物理手段处理后，按照正、负菌菌体质量比为1:10混合，以10％(体积比)接种到1m³发酵罐中发酵培养制备番茄红素，发酵培养过程工艺控制为：培养温度25℃，搅拌速度150-200转/分钟，通气量1-3vvm(l/l.分钟)，罐压0.05-0.1mpa，培养时间120-144h，在发酵开始后36小时加入起始发酵液体积0.15％的烟碱。发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中葡萄糖浓度在10-20g/l。所述发酵培养基为：葡萄糖20g/l，玉米淀粉40g/l，酵母浸膏25g/l，黄豆饼粉40g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.1g/l，ph7.0。

5)收集发酵后得到的菌体，将菌体过滤清洗后烘干，得到干重。

6)准确称量0.02g干菌体，用乙酸乙酯萃取，用高效液相色谱法测定番茄红素含量。

上述步骤完成后，使用现有的常规工艺，例如使用溶剂提取菌体中的番茄红素，进一步脱溶、纯化、结晶后，即可制得番茄红素。

将本发明的制备方法与现有技术对比，结果如下：

现有技术(不使用物理手段处理种子液，直接将正、负菌混合后，进行发酵)：测得发酵液中番茄红素产量为5.39g/l。

本实施例方案一：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液300转/分钟分别剪切30分钟后混合再进行发酵，测得发酵液中番茄红素的产量为6.92g/l，比现有技术提高了28.39％。

本实施例方案二：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液3000转/分钟分别剪切10分钟后混合再进行发酵，测得发酵液中番茄红素的产量为7.73g/l，比现有技术提高了43.41％。

本实施例方案三：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液8000转/分钟分别剪切5分钟后混合再进行发酵，测得发酵液中番茄红素的产量为9.79g/l，比现有技术提高了81.63％。

本实施例方案四：将种子液15000转/分钟剪切1分钟后再进行发酵，测得发酵液中番茄红素的产量为10.44g/l，比现有技术提高了93.69％。剪切过程：将待剪切的种子液移入装有在线剪切装置的缓冲罐，剪切时在缓冲罐夹套中通入冷冻水，以控制剪切过程中剪切体系温度为25-30℃。

上述说明：通过剪切手段处理的方式，可很好地减少菌体中菌丝之间的缠绕，使菌体的菌丝分布更加均匀。处理前显微镜目测三孢布拉氏霉菌的菌丝体较长，通常为45μm-600μm，互相缠绕，由此直接将种子液混合发酵，会影响正、负菌的接合效率及接合程度，进而影响番茄红素的产量，剪切处理后，菌丝分散均一。

如图1所示。

实施例4

1)斜面培养：配制pda斜面培养基(葡萄糖20g/l，琼脂粉25g/l，去皮土豆200g/l；将土豆切成1cm方块加入去离子水煮沸30分钟，冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加入葡萄糖和琼脂粉)。取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液，分别涂布于pda斜面培养基上，于25℃恒温培养箱中培养5-7天；

2)种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌正菌、负菌菌株斜面上用接种铲铲取一铲的正菌、负菌，分别接种到含有150ml种子培养基的1000ml三角瓶中，于25℃，180转/分钟条件下培养48小时，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液。所述种子培养基为：葡萄糖10g/l，玉米淀粉30g/l，玉米浆干粉50g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.1g/l，ph7.0。

3)种子扩大培养：最终发酵罐的体积为10m³，依次选用容积为10l，100l，1m³的种子罐扩大培养种子液，在最后一级种子罐中安装旋流混合器，种子罐中培养基装量为60％(体积比)，将步骤2)中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液按照10％(体积比)接种量分别接种到种子罐中进行培养，培养过程工艺控制为：培养温度25℃，搅拌速度200转/分钟，通气量1vvm(l/l.分钟)，培养时间48h，所述扩大培养基为：葡萄糖10g/l，玉米淀粉30g/l，玉米浆干粉50g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.1g/l，ph7.0。

4)发酵罐培养：将步骤3)中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液分别通过旋流混合器处理后，按照正、负菌菌体质量比为1:50混合均匀后，以10％(体积比)接种量接入10m³发酵罐中，旋流混合器进气压力0.15-0.25mpa，气流量50-300nm³/min。培养过程工艺控制为：培养温度25℃，搅拌速度150-200转/分钟，通气量1-3vvm(l/l.分钟)，罐压0.05-0.1mpa，培养时间120-144h，在发酵开始后36小时加入起始发酵液体积0.15％的烟碱。发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中葡萄糖浓度在10-20g/l。所述发酵培养基为：葡萄糖20g/l，玉米淀粉40g/l，酵母浸膏25g/l，黄豆饼粉40g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.1g/l，ph7.0。

5)收集发酵后得到的菌体，将菌体过滤清洗后烘干，得到干重。

6)准确称量0.02g干菌体，用乙酸乙酯萃取，用高效液相色谱法测定番茄红素含量。

上述步骤完成后，使用现有的常规工艺，例如使用溶剂提取菌体中的番茄红素，进一步脱溶、纯化、结晶后，即可制得番茄红素。

将本发明的制备方法与现有技术对比，结果如下：

现有技术(不使用物理手段处理种子液，直接将正、负菌混合后，进行发酵)：测得发酵液中番茄红素产量为5.42g/l。

本实施例方案一：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液利用旋流混合器分别混合，旋流混合器进气压力0.15mpa，气流量50nm³/min，将研磨后的三孢布拉氏霉菌正、负种子液再混合进行发酵，测得发酵液中番茄红素的产量为6.54g/l，比现有技术提高了20.66％。

本实施例方案二：将三孢布拉氏霉菌正、负种子利用液旋流混合器分别混合，旋流混合器进气压力0.2mpa，气流量150nm³/min，将研磨后的三孢布拉氏霉菌正、负种子液再混合进行发酵，测得发酵液中番茄红素的产量为6.88g/l，比现有技术提高了26.94％。

本实施例方案三：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液旋流混合器分别混合，旋流混合器进气压力0.25mpa，气流量300nm³/min，将研磨后的三孢布拉氏霉菌正、负种子液再混合进行发酵，测得发酵液中番茄红素的产量为7.15g/l，比现有技术提高了31.92％。

上述三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液采用物理手段进行处理后混合进行发酵培养制备番茄红素，发酵结束后生物量如图2所示。由图2可看出：三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液采用本发明的物理手段处理后再混合进行发酵培养，发酵结束后生物量与对照(三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液不进行物理手段处理)无明显差异，说明本发明的物理手段处理没有破坏菌体的活性。

通过以上实例及对比可以看出，本发明在将三孢布拉氏霉菌正负菌混合发酵前，通过物理手段处理如将三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液通过剪切、胶体磨、气动的方式处理，可很好地减少菌体中菌丝之间的缠绕、提高菌丝分散程度、改善菌丝分布程度，进而提高接合效率，且不影响菌体活性，由此达到提高发酵制备的番茄红素产量的目的。经实验验证，本发明工艺番茄红素的产量可至少提高20％以上，最高达到100％左右。